Nghiên cứu thăm dò khả năng chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố của vi khuẩn staphylococcus aureus bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch

Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> NGHIÊN CỨU THĂM DÒ KHẢ NĂNG CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT<br /> HIỆN NHANH ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS<br /> AUREUS BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH<br /> Trần Thị Thanh Quỳnh*, Tô Văn Thiệp, Nguyễn Văn Hoàng,<br /> Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Nguyễn Thị Tâm Thư, Phạm Kiên Cường<br /> Tóm tắt: Độc tố Staphylococcal enterotoxins (SEs), được tiết ra bởi vi khuẩn<br /> Staphylococcus, là nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này gây<br /> ra. Có hơn 20 loại SEs đã được xác định, trong đó SEA là độc tố chiếm tỷ lệ cao<br /> nhất gây ra các vụ ngộ độc. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật sắc<br /> ký miễn dịch để chế tạo que thử phát hiện SEA với các kháng nguyên và kháng thể<br /> thương mại. Kết quả bước đầu cho thấy, que thử có khả năng phát hiện độc tố SEA<br /> trong nước với ngưỡng phát hiện 1ng/ml trong 20 phút.<br /> Từ khóa: Staphylococcus enterotoxin, Que thử, Độc tố SEA.<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus là một trong những nguyên nhân phổ biến<br /> hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm [2,5] và là một trong số các vi khuẩn có khả<br /> năng gây ngộ độc cấp tính rất nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao. Những vi khuẩn này có khả<br /> năng tiết các độc tố bền nhiệt SEs với khối lượng phân tử từ 22-30kDa thuộc họ “siêu<br /> kháng nguyên” [9]. Quá trình đun nấu thông thường có thể tiêu diệt được vi khuẩn nhưng<br /> không làm phân hủy độc tố này. Có hơn 20 loại SEs khác nhau đã được xác định. Trong<br /> đó, SEA là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm bởi tụ cầu vàng chiếm tỷ lệ cao nhất trong<br /> số các loại SEs. Ở Anh, từ năm 1969-1990, 79% các ca ngộ độc thực phẩm liên quan đến<br /> SEs bao gồm: SEA (56.9%), SEA và SED (15.4%), SEB (3.4%), SEC (2.5%), SEB và<br /> SED (1.1%) [12]. Bên cạnh đó, SEA cũng là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc<br /> thực phẩm ở Nhật [8], Pháp (69.7%) [7], Mỹ (77.8%) [3], và Hàn Quốc (90%) [4].<br /> Ở Việt Nam, vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus cũng là nguyên nhân gây ra<br /> nhiều vụ ngộ độc thực phẩm: Hơn 200 công nhân ở Trà Vinh ngộ độc thức ăn do nhiễm khuẩn<br /> tụ cầu vàng (1/2015) [14], Trung tâm y tế dự phòng tỉnh Quảng Ngãi đã công bố kết quả kiểm<br /> nghiệm 10 mẫu bánh mỳ gây ngộ độc là do nhiễm khuẩn tụ cầu vàng (5/2015) [13].<br /> Hiện nay, để phát hiện độc tố tụ cầu vàng, người ta thường sử dụng phương pháp PCR<br /> và phương pháp miễn dịch dựa trên cơ chế kháng nguyên-kháng thể (khuếch tán trên gel,<br /> miễn dịch phóng xạ-RIA, ngưng kết hạt latex, ELISA,...). Trong nước và trên thế giới đã<br /> có nhiều công trình nghiên cứu chế tạo thành công bộ kit phát hiện nhanh vi khuẩn tụ cầu<br /> vàng Staphylococcus aureus dựa trên kỹ thuật ELISA như: kit BK-SETA, kit Ridascreen<br /> SET Total, kit Vidas SET2... Ưu điểm của các phương pháp này là thời gian phân tích<br /> nhanh chỉ trong 1-3 giờ và có ngưỡng phát hiện thấp từ 0,1-10ng/ml. Tuy nhiên, nhược<br /> điểm là cần máy đọc chuyên dụng để phân tích kết quả, đòi hỏi kỹ thuật viên có tay nghề<br /> cao và khó áp dụng ngoài hiện trường. Mặt khác, giá thành của các bộ sinh phẩm nhập<br /> ngoại rất đắt, quy trình phân tích khá phức tạp.<br /> Xu hướng trên thế giới hiện nay là phát triển các phương pháp phân tích nhanh, có độ<br /> nhạy cao, dễ sử dụng để phân tích sàng lọc một số lượng lớn mẫu ngay tại hiện trường.<br /> Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới đã thành công trong việc phát triển que thử phát<br /> hiện SEs dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch nhằm đơn giản hóa và rút gọn thời gian phân<br /> tích xuống còn 30 phút [11]. Tuy nhiên, trong quân đội hiện nay, các nghiên cứu phát hiện<br /> độc tính của vi khuẩn này còn hạn chế.<br /> <br /> <br /> 126 T. T. T. Quỳnh, …, P. K. Cường, “Nghiên cứu thăm dò khả năng … sắc ký miễn dịch.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> Mặt khác, bên cạnh các tác nhân sinh học như vi khuẩn (than, tả, dịch hạch...), virus (đậu<br /> mùa, ebola...), độc tố của tụ cầu vàng S. aureus cũng là một trong những tác nhân nguy<br /> hiểm, có nguy cơ cao trong khủng bố và chiến tranh sinh học [6]. Vì vậy, việc nghiên cứu<br /> các phương pháp phát hiện nhanh độc tố của vi khuẩn này trong thực phẩm là rất cần thiết.<br /> Trong nghiên cứu này, việc thăm dò chế tạo que thử phát hiện độc tố vi khuẩn SEA<br /> dạng đơn giản (chỉ bao gồm màng nitrocellulose và màng hút trên) đã được thực hiện.<br /> 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất<br /> - Nguyên vật liệu: Màng nitrocelluse Immumopore FP và màng thấm hút trên của hãng<br /> Whatman, đĩa ELISA của hãng Beckman Coulter<br /> - Hóa chất: Kháng thể đơn dòng kháng SEA (C86411M _KT2), kháng thể đơn dòng<br /> kháng SEA (C86104M_KT1) của hãng Meridian, độc tố SEA (AT101) của hãng Toxin<br /> technology, Goat-antimouse IgG h&HPR (ab6789_KT3) của hãng Abcam và các hóa chất<br /> thường dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của hãng Sigma, Mecrk, Thermo<br /> Scientific...<br /> 2.2. Thiết bị<br /> Máy phun mẫu bán tự động Linomat (Thụy Sĩ), tủ ấm của Hãng Memmert (Đức), hệ<br /> thống ELISA (Ý), máy khuấy từ gia nhiệt của Hãng Cole Palmer (Mỹ), máy vortex<br /> (Mỹ), máy short spin của Hãng Hermle (Mỹ), máy ly tâm lạnh của hãng Orto alresa (Tây<br /> Ban Nha).<br /> 2.3. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.3.1. Đánh giá phản ứng kháng nguyên kháng thể bằng phương pháp ELISA<br /> Hút 100 µl poly L-lysine 0,01% cho vào mỗi giếng, ủ ở 37oC trong 1 h. Sau đó, rửa<br /> bằng 200 µl đệm rửa (PBS 0,01 M, pH 7.4; tween 20 0,05%) rồi cho 100 µl kháng nguyên<br /> SEA 100 ng/ml ủ ở 4 oC qua đêm. Tiếp theo, bổ sung 200 µl BSA 1% ủ ở 37oC trong 2 giờ<br /> và bổ sung tiếp kháng thể đơn dòng kháng SEA (KT1 và KT2) các nồng độ khác nhau, ủ<br /> 37 oC trong 1 giờ. Tiếp theo, hút 100 µl kháng thể đa dòng Goat-antimouse IgG h&HPR<br /> (KT3) cho vào mỗi giếng, ủ ở 37 oC trong 1 giờ, Sau mỗi bước bổ sung kháng thể đều rửa<br /> sạch giếng bằng 200 µl đệm rửa, 3 lần. Sau đó, bổ sung 50 µl cơ chất TMB (3,3’,5,5’-<br /> tetramethylbenzidine), ủ 30 phút ở 37 oC trong bóng tối rồi bổ sung tiếp 50 µl H2SO4 1N.<br /> Enzyme HPR (Horse Radish Peroxidase) của KT3 sẽ xúc tác thủy phân cơ chất tạo thành<br /> sản phẩm có màu xanh, sau khi bổ sung axit sẽ chuyển thành màu vàng, được đo độ hấp<br /> thụ ở bước sóng A450 và phân tích kết quả. Lượng sản phẩm tạo thành sau phản ứng thể<br /> hiện khả năng bắt cặp của kháng nguyên và kháng thể.<br /> 2.3.2. Cố định các kháng thể lên màng nitrocellulose<br /> Sau khi phân tích ELISA, các kháng thể được lựa chọn để cố định tại tại vạch kiểm<br /> chứng và vạch thử nghiệm được phun trực tiếp lên màng nitrocellulose bằng thiết bị in<br /> phun kháng thể của Linomag (Thụy Sĩ) với các nồng độ khác nhau (0,2-1 µg/mm), tốc<br /> độ phun 40 nl/s. Sau đó màng được để khô tự nhiên qua đêm để kháng thể gắn cố định<br /> lên màng.<br /> 2.3.3. Cộng hợp vàng vào kháng thể<br /> - Chuẩn bị dung dịch cộng hợp vàng theo phương pháp Turkevich [10]: Các hạt nano<br /> vàng (AuNP) có kích thước 40 nm và giữ ổn định bởi Natri citrate. Đầu tiên, 20 ml dung<br /> dịch vàng HAuCl4 0,1 % được đun sôi kết hợp khuấy từ trong bình tam giác 250 ml. Sau<br /> đó, bổ sung 2 ml Natri citrate 1 %, tiếp tục đun sôi khoảng 10 phút (đến khi dung dịch<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 51, 10 - 2017 127<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> chuyển từ màu vàng thành màu đỏ rượu). Tiếp tục khuấy từ và làm nguội dung dịch ở<br /> nhiệt độ phòng. Dung dịch hạt vàng được bảo quản trong bình tối ở 4oC.<br /> - Cộng hợp vàng vào kháng thể: dung dịch hạt vàng được chuẩn về pH 9 bằng đệm<br /> borate 0,1 M. Sau đó, bổ sung 100 µl kháng thể C86104M 100 µg/ml vào 1,5 ml dung<br /> dịch hạt vàng đã chuẩn pH, lắc ở tốc độ 650 vòng/phút trong 20 phút. Sau đó, ly tâm<br /> 14.000 vòng/phút ở 4oC. Dịch nổi được loại bỏ và thu lại kháng thể đã cộng hợp vàng ở<br /> đáy ống. Hòa lại kháng thể thu được với 500 µl đệm phosphat 0,01M, pH 7.4.<br /> 2.3.4. Phân tích mẫu bằng que thử<br /> Mỗi mẫu phân tích được nhiễm chủ động độc tố SEA với liều lượng khác nhau trong<br /> 100 µl dung dịch đệm chạy (đệm phosphat 0,01 M, pH 7.4; BSA 0,1%; Tween 20<br /> 0,05%) và được đưa vào giếng ELISA. Tiếp đó, bổ sung kháng thể cộng hợp với một<br /> lượng nhất định và cắm que thử vào giếng, ủ trong 20 phút để toàn bộ lượng dung dịch<br /> được hút cạn. Kết quả phân tích được đánh giá dựa vào việc xuất hiện vạch. Kết quả<br /> được coi là dương tính nếu xuất hiện cả 2 vạch và được coi là âm tính nếu chỉ xuất hiện<br /> 1 vạch (vạch kiểm chứng).<br /> 2.3.5. Đánh giá ngưỡng và thời gian phát hiện của que thử<br /> Thử nghiệm khả năng phát hiện của que thử đối với các nồng độ độc tố SEA khác nhau<br /> từ khoảng 1 ng/ml – 100 ng/ml. Giá trị thấp nhất mà que thử có thể phát hiện được chính<br /> là ngưỡng phát hiện của que thử. Thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần.<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Đánh giá phản ứng kháng nguyên - kháng thể bằng phương pháp ELISA<br /> Kết quả đánh giá phản ứng bắt cặp đặc hiệu giữa SEA - KT1 - KT3 và SEA - KT2 -<br /> KT3 cho thấy, KT1 và KT2 đều có khả năng bắt cặp đặc hiệu với SEA và KT3. Do đó, có<br /> thể sử dụng 3 loại kháng thể này để chế tạo que thử. Tuy nhiên, cần dựa vào kết quả phân<br /> tích ELISA để lựa chọn một trong 2 loại KT1 và KT2 làm kháng thể cộng hợp vàng. Kết<br /> quả cho thấy, khi tăng nồng độ KT2 thì giá trị A450 không có sự thay đổi nhiều. Trong khi<br /> đó, giá trị A450 của KT1 tăng lên đáng kể và ở nồng độ 8 µg/ml là 0,229 cao hơn hẳn KT2<br /> là 0,093 (hình 1). Kết quả này đồng nghĩa với việc KT1 có khả năng bắt cặp tốt hơn với<br /> KT3. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn dùng KT1 làm kháng thể cộng hợp vàng, KT2 để cố định<br /> lên vạch thử nghiệm và KT3 để cố định lên vạch kiểm chứng.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Kết quả phân tích ELISA.<br /> Giếng 1: KT1_2 µg/ml<br /> Giếng 2: KT1_4 µg/ml<br /> Giếng 3: KT1 8 µg/ml<br /> Giếng 4: KT2_2 µg/ml<br /> Giếng 5: KT2_4 µg/ml<br /> Giếng 6: KT2_8 µg/ml<br /> Giếng 7: Đối chứng âm.<br /> 3.2. Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose<br /> KT3 được cố định lên màng nitrocellulose bằng thiết bị phun mẫu bán tự động linomat<br /> (Thụy Sĩ) với lượng 0,4 µg/mm. Việc cố định kháng thể này được kiểm tra bằng phản ứng<br /> <br /> <br /> 128 T. T. T. Quỳnh, …, P. K. Cường, “Nghiên cứu thăm dò khả năng … sắc ký miễn dịch.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> tạo màu của enzyme horseradish peroxidase gắn trên KT3 với cơ chất TMB (Hình 2). Kết<br /> quả cho thấy, ngay sau khi nhỏ 10 µl cơ chất TMB lên màng nitrocellulose thì xuất hiện<br /> vạch màu xanh tại vị trí phun KT3. Điều này chứng tỏ KT3 đã được cố định tốt lên màng<br /> và giữ được hoạt tính. Chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra đồng thời sự cố định của kháng<br /> thể lên màng nitrocellulose bằng phản ứng tạo màu giữa KT3 với kháng thể cộng hợp<br /> vàng (KT1*) (Hình 3).<br /> <br /> <br /> <br /> Phản ứng: KT3 + TMB<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả kiểm tra gắn KT3 lên màng nitrocellulose.<br /> 3.3. Cộng hợp vàng vào KT1<br /> Dung dịch cộng hợp vàng được chuẩn bị theo phương pháp Turkevich [10]. Kết quả<br /> cho thấy, dung dich hạt vàng nano đã được tạo thành từ dung dịch HAuCl4 do dung dịch<br /> này chuyển từ màu vàng sang màu đỏ rượu vang (Hình 3a).<br /> Sau khi tạo được dung dịch hạt vàng, chúng tôi tiếp tục bổ sung KT1 để tạo kháng thể<br /> cộng hợp vàng (KT1*). Kết quả cộng hợp vàng vào KT1 được kiểm tra bằng phản ứng tạo<br /> vạch màu bằng cách nhỏ 5 µl KT1* 20µg/ml lên màng nitrocellulose đã cố định KT3<br /> (hình 3b). Kết quả cho thấy, sau khoảng 1 phút xuất hiện vạch màu đỏ tại vị trí phun KT3.<br /> Điều này chứng tỏ, đã cộng hợp vàng vào KT1 thành công và một lần nữa khẳng định<br /> KT3 đã được cố định lên màng nitrocellulose, tạo thành vạch gọn, rõ và giữ được hoạt<br /> tính. Dựa vào các kết quả này, chúng tôi tiến hành cố định KT2 lên màng nitrocellulose<br /> bằng phương pháp tương tự để tạo que thử và thực hiện các thử nghiệm tiếp theo.<br /> <br /> <br /> <br /> Phản ứng: KT3 + KT1*<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> a b<br /> Hình 3. Kết quả kiểm tra cộng hợp vàng vào kháng thể.<br /> 3a: Dung dịch cộng hợp vàng KT1*<br /> 3b: Phản ứng tạo vạch màu giữu KT3 và KT1*.<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 51, 10 - 2017 129<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> 3.4. Tối ưu lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng<br /> KT3 được cố lên màng nitrocellulose với các nồng độ khác nhau (0,05; 0,1; 0,2; 0,3;<br /> 0,4 µg/mm) để lựa chọn lượng kháng thể thấp nhất dùng cho một que thử mà vạch kiểm<br /> chứng vẫn xuất hiện rõ. Sau khi đã cố định KT3, các que thử được nhỏ trực tiếp 5 µl KT1*<br /> 20 µg/ml vào đầu của mỗi que. Kết quả phân tích chỉ ra rằng, sau khoảng 1 phút xuất hiện<br /> vạch kiểm chứng rõ ở que thử số 3, 4, 5 còn que thử số 1 và 2 tuy vẫn nhìn thấy vạch<br /> nhưng không được rõ nét (hình 4). Để tiết kiệm chi phí cho việc sản xuất que thử trong các<br /> thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi lựa chọn nồng độ KT3 sử dụng cho mỗi lần cố định lên<br /> màng nitrocellulose là 0,2 µg/mm, tương đương với 0,6 µg/que.<br /> <br /> <br /> <br /> Vạch kiểm chứng:<br /> KT3 + KT1*<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 1 2 3 4 5<br /> Hình 4. Kết quả tối ưu lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng.<br /> 1. Nồng độ kháng thể là 0,05 µg/mm<br /> 2. Nồng độ kháng thể là 0,1 µg/mm<br /> 3. Nồng độ kháng thể là 0,2 µg/mm<br /> 4. Nồng độ kháng thể là 0,3 µg/mm<br /> 5. Nồng độ kháng thể là 0,4 µg/mm.<br /> 3.5. Tối ưu lượng kháng thể cố định lên vạch thử nghiệm<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5. Kết quả tối ưu lượng kháng thể vạch thử nghiệm.<br /> 1. Nồng độ kháng thể là 0,05 µg/mm<br /> 2. Nồng độ kháng thể là 0,1 µg/mm<br /> 3. Nồng độ kháng thể là 0,2 µg/mm<br /> 4. Nồng độ kháng thể là 0,3 µg/mm<br /> 5. Nồng độ kháng thể là 0,4 µg/mm.<br /> Sau khi lựa chọn được lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng, chúng tôi tiếp tục<br /> tối ưu lượng KT2 cố định lên vạch thử nghiệm với phương pháp tương tự như sau:<br /> <br /> <br /> 130 T. T. T. Quỳnh, …, P. K. Cường, “Nghiên cứu thăm dò khả năng … sắc ký miễn dịch.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> Cố định KT3 lên màng nitrocellulose tại vị trí vạch kiểm chứng với lượng 0,6 µg/que.<br /> Đồng thời cố định KT2 tại vị trí vạch thử nghiệm với các nồng độ khác nhau là: 0,05; 0,1;<br /> 0,2; 0,3; 0,4 µg/mm. Sau đó, que thử được nhúng vào giếng có chứa dung dịch bao gồm: 5<br /> µl SEA 100 ng/ml và 5 µl KT*1 20µg/ml.<br /> Dựa trên kết quả phân tích thu được (Hình 5), chúng tôi lựa chọn nồng độ KT sử dụng<br /> cho mỗi lần cố định lên màng nitrocellulose là 0,3 µg/mm, tương đương với 0,9 µg/que.<br /> Ngoài xác định lượng kháng thể tối ưu trên vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm, việc<br /> xác định lượng kháng thể cộng hợp (KT1*) tối ưu cũng đóng vai trò rất quan trọng trong<br /> việc hình thành vạch màu của que thử. Vì vậy, sau khi tối ưu lượng kháng thể gắn lên<br /> màng nitrocellulose tại vị trí vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm, chúng tôi tiếp tục tối<br /> ưu lượng KT1* cần dùng cho một que thử để giảm thiểu chi phí mà vẫn đảm bảo tín hiệu<br /> của mỗi lần phân tích.<br /> 3.6. Đánh giá ngưỡng và thời gian phát hiện của que thử<br /> Để xác định ngưỡng và thời phát hiện của que thử với độc tố SEA, các mẫu độc tố<br /> SEA tinh khiết với nồng độ từ 0-100 ng/ml (0, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 ng/ml) trong nước<br /> được chuẩn bị. Sau đó, cho lần lượt bổ sung 30 µl mỗi mẫu độc tố đã chuẩn bị và 5µl<br /> KT1* 20 µg/ml vào giếng rồi nhúng que thử vào. Kết quả cho thấy rằng, sau khoảng 10<br /> phút bắt đầu xuất hiện vạch kiểm chứng trên que thử và sau khoảng 20 phút các vạch<br /> màu xuất hiện rõ. Đồng thời, tín hiệu vạch thử nghiệm có xu hướng giảm dần khi giảm<br /> nồng độ độc tố SEA và nồng độ thấp nhất mà que thử có khả năng phát hiện là 1ng/ml<br /> (hình 6). Kết quả này tương đương với công trình nghiên cứu gần đây của Wachun Jin<br /> và cộng sự [11], nhóm tác giả đã chế tạo que thử dựa trên phương pháp sắc ký miễn dịch<br /> kẹp đôi có khả năng phát hiện SEA trong đệm PBS ở nồng độ 1ng/ml. Bên cạnh đó,<br /> Trần Thị Sao Mai và cộng sự [1] cũng đã nghiên cứu thành công que thử phát hiện 05<br /> loại độc tố tụ cầu vàng trong thịt và sữa bằng phương pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh<br /> với ngưỡng phát hiện 3-10 ng/ml.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện độc tố SEA của que thử trong nước.<br /> 1-8 tương ứng với nồng độ SEA là 0, 1, 2, 5, 10, 20, 30 và 50 ng/ml.<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Đã cố định kháng thể lên màng nitrocellulose bằng thiết bị phun mẫu bán tự động với<br /> tốc độ phun 40 nl/s, với KT2 (C86411M) tại vị trí vạch thử nghiệm và KT3 (ab6789) tại vị<br /> trí vạch kiểm chứng.<br /> Đã cộng hợp vàng vào KT1 (C86104M) bằng phương pháp Turkevich.<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 51, 10 - 2017 131<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> Đã tối ưu được lượng kháng thể phun lên vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm lần lượt<br /> tương ứng là 0,6 và 0,9 µg/que.<br /> Que thử có khả năng phát hiện độc tố SEA trong nước với ngưỡng phát hiện là 1 ng/ml<br /> trong 20 phút.<br /> Đây là những kết quả bước đầu cho thấy triển vọng trong việc chế tạo que thử để phát<br /> hiện độc tố SEA của vi khuẩn Staphylococcus aureus. Để có thể ứng dụng vào thực tiễn<br /> cần phải hoàn thiện que thử với 4 loại màng là: màng hút mẫu, màng cộng hợp, màng<br /> nitrocelloluse và màng thấm hút trên. Đồng thời, cũng cần nghiên cứu thêm khả năng phát<br /> hiện của que thử đối với các loại thực phẩm khác nhau.<br /> Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu khoa<br /> học định hướng cho cán bộ trẻ năm 2016: "Nghiên cứu thăm dò khả năng chế tạo kit phát hiện<br /> nhanh độc tố tụ cầu vàng bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch".<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2015), “Nghiên cứu<br /> phát triển hệ thống sắc ký miễn dịch cạnh canh phát hiện các độc tố ruột tụ cầu trong<br /> sữa”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, ĐHQGHN.<br /> [2]. Argudin, M.A., Mendoza, M.C., Rodicio, M.R., (2010), “Food poisoning and<br /> Staphylococcus aureus enterotoxins”, Toxins (Basel) 2, 1751–1773.<br /> [3]. Casman, E.P., (1965), “Staphylococcal enterotoxin”, Ann. N. Y. Acad. Sci. 128, 124–<br /> 131.<br /> [4]. Cha, J.O., Lee, J.K., Jung, Y.H., Yoo, J.I., Park, Y.K., Kim, B.S., Lee, Y.S., (2006),<br /> “Molecular analysis of Staphylococcus aureus isolates associated with<br /> staphylococcal food poisoning in South Korea”, J. Appl. Microbiol. 101, 864.<br /> [5]. Hennekinne, J.A., Ostyn, A., Guillier, F., Herbin, S., Prufer, A.L., Dragacci, S.,<br /> (2010), “How should staphylococcal food poisoning outbreaks be characterized?”<br /> Toxins (Basel) 2, 2106–2116.<br /> [6]. Irina V. P., Ellen J. B. and Victor E. R. (2010), “Staphylococcal Enterotoxins”,<br /> Toxins 2, 2177-2197; doi:10.3390/toxins2082177<br /> [7]. Kerouanton, A., Hennekinne, J.A., Letertre, C., Petit, L., Chesneau, O., Brisabois, A.,<br /> De Buyser, M.L., (2007), “Characterization of Staphylococcus aureus strains<br /> associated with food poisoning outbreaks in France”, Int. J. Food Microbiol. 115,<br /> 369–375.<br /> [8]. Shimizu, A., Fujita, M., Igarashi, H., Takagi, M., Nagase, N., Sasaki, A., Kawano, J.,<br /> (2000), “Characterization of Staphylococcus aureus coagulase type VII isolates from<br /> staphylococcal food poisoning outbreaks (1980–1995) in Tokyo, Japan, by pulsed-field<br /> gel electrophoresis”, J. Clin. Microbiol. 38, 3746.<br /> [9]. Thomas, D., Chou, S., Dauwalder, O., Lina, G., (2007), “Diversity in Staphylococcus<br /> aureus enterotoxins”, Chem. Immunol. Allergy 93, 24–41.<br /> [10]. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillie, J. (1951), “A study of the nucleation and<br /> growth processes in the synthesis of colloidal gold”, Discuss. Faraday Soc., 55-75.<br /> [11]. Wanchun J.,, Keiko Y., Mai I., Noritada K., Manabu T., Yusuke A., Makoto M.,<br /> Atsushi M., Akira O., Takao N., Yoshinobu B., Michio O. (2013), “Application of IgY<br /> to sandwich enzyme-linked immunosorbent assays, lateral flow devices, and<br /> immunopillar chips for detecting staphylococcal enterotoxins in milk and dairy<br /> products”, Journal of Microbiological Methods 92 (2013) 323–331.<br /> [12]. Wieneke, A.A., Roberts, D., Gilbert, R.J., (1993), “Staphylococcal food poisoning in<br /> the United Kingdom”, 1969–90. Epidemiol. Infect. 110, 519–531.<br /> [13]. http://www.baomoi.com/quang-ngai-banh-mi-gay-ngo-doc-nhiem-khuan-tu-cau-<br /> <br /> <br /> 132 T. T. T. Quỳnh, …, P. K. Cường, “Nghiên cứu thăm dò khả năng … sắc ký miễn dịch.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> vang/c/16539058.epi<br /> [14]. http://doanhnghiepvn.vn/hon-200-cong-nhan-ngo-doc-do-thuc-an-nhiem-vi-khuan-tu-<br /> cau-vang-d21678.html<br /> ABSTRACT<br /> SERVEY RESEARCH FOR PRODUCTION ABILITY<br /> OF IMMUNOCHROMATOGRAPHIC TEST TRIPS FOR QUICK DETECTION<br /> OF STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN<br /> Staphylococcal enterotoxins (SEs), produced by Staphylococcus aureus, are the<br /> major cause of staphylococcal food poisoning. There are more than 20 types of SEs<br /> that were reported. Among them, SEA is a well-known major causative toxin of food<br /> poisoning. In this study, we used immunochromatographic techiniques to design test<br /> trips for detecting SEA toxin with commerical antigen and antibodies. The results<br /> showed that the test trips could detect SEA at a low concentration up to 1ng/ml<br /> within 20 min in water.<br /> Keywords: Staphylococcus enterotoxin, Test trip, SEA toxin.<br /> <br /> Nhận bài ngày 13 tháng 02 năm 2017<br /> Hoàn thiện ngày 17 tháng 4 năm 2017<br /> Chấp nhận đăng ngày 25 tháng 10 năm 2017<br /> <br /> Địa chỉ: Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học và Công nghệ quân sự.<br /> *<br /> Email: tranthithanhquynhk55b2@gmail.com.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 51, 10 - 2017 133<br />