Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và ảnh hưởng của nó đến tế bào ung thư nuôi cấy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Quang Hòa

NGHIÊN CỨ U TINH SẠCH PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤ M MEN PICHIA PASTORIS X33-36 VÀ Ả NH HƯỞ NG CỦ A NÓ ĐẾ N TẾ BÀ O UNG THƯ NUÔI CẤY

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Quang Hòa

NGHIÊN CỨ U TINH SẠCH PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤ M MEN PICHIA PASTORIS X33-36 VÀ Ả NH HƯỞ NG CỦ A NÓ ĐẾ N TẾ BÀ O UNG THƯ NUÔI CẤY

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đinh Nho Thái

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đinh Nho Thái đã trực tiếp giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô trong Bộ môn Di truyền học đã truyền đạt cho tôi những tri thức quý báu trong thời gian tôi học tập và nghiên cứu tại trường.

Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn ThS. Bùi Thị Vân Khánh đã hướng dẫn tôi

trong quá trình làm thí nghiệm nuôi cấy tế bào và thử nghiệm độc tính trên tế bào.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô thuộc Phòng thí nghiệm Môi trường Đất, Khoa Môi Trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã cho phép sử dụng thiết bị trong nuôi cấy vi sinh. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các học viên cao học và các em sinh viên trong Bộ môn Di truyền học cùng các cán bộ và các em sinh viên trong Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã nhiệt tình hỗ trợ tôi rất nhiều trong thời gian làm việc tại phòng thí nghiệm.

Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên, chia sẻ kinh nghiệm và ủng hộ tôi hoàn thành tốt nhất đề tài nghiên cứu này.

Hà Nội, ngày 15 tháng 02 năm 2020

Học viên

Nguyễn Quang Hòa

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Acquired immuno deficiency syndrome AIDS

BMMY Buffered methanol complex medium

Bps Base pairs

CI 24 Chloroform : 1 isopropanol

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxy ribonucleotide triphosphates

EtBr Ethidium bromide

FBS Fetal bovine serum

HBV Hepatitis B virus

HIV Human immunodeficiency virus

HPV Human papilloma virus

kDa Kilo Daltons

NST Nhiễm sắc thể

PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

PMS Phenazine methyl sulfate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis

TAE Tris base-acetic-EDTA

TBE Tris base-axit boric-EDTA

WHO World Health Organization

YPD Yeast extract-peptone-dextrose medium

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt Nam .................................................................................................................... 3

1.1. Tình hình ung thư trên thế giới ........................................................ 3

1.2. Tình hình ung thư ở Việt Nam ......................................................... 3

1.3. Các nguyên nhân gây ung thư .......................................................... 4

1.4. Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư ......................................... 4

2. Tổng quan về gen TP53 và protein p53 .................................................. 5

2.1. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53 ............................................. 5

2.2. Cấu trúc không gian của protein p53 ............................................... 6

2.3. Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục tiêu .... 7

2.4. Chức năng của protein p53 .............................................................. 8

2.5. Cơ chế protein p53 gây nên apoptosis và ảnh hưởng đến sự ức chế tế bào khối u ..................................................................................................... 9

2.6. Tổng quan về các nghiên cứu biểu hiện protein cho liệu pháp điều trị đích trong ung thư ........................................................................................... 11

2.6.1. Liệu pháp điều trị ung thư dựa vào protein p53 ....................... 13

3. Nghiên cứu biểu hiện protein p53 trong nấm men trên thế giới và ở Việt Nam ................................................................................................................... 13

4. Vector pPicZαA-TAT-p53-his và cơ chế thử nghiệm protein p53 tái tổ hợp trên mức độ tế bào ....................................................................................... 14

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 16

2.1. Vật liệu và hóa chất .......................................................................... 16

2.1.1. Vật liệu ................................................................................... 16

2.1.2. Hóa chất .................................................................................. 18

2.1.3. Các dung dịch và đệm ............................................................. 18

2.1.4. Thiết bị dùng trong nghiên cứu................................................ 19

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 20

2.2.1. Kiểm tra chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và nuôi biểu hiện thu sinh khối protein p53 tái tổ hợp ...................................................... 20

2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của nấm men ................ 20

2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose ............................ 21

2.2.4. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS- PAGE) ......................................................................................................... 22

2.2.5. Phương pháp sắc ký ái lực ....................................................... 23

2.2.6. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ..................... 24

2.2.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư trong điều kiện in vitro . 25

2.2.8. Phương pháp kiểm tra sự ảnh hưởng của dung dịch P lên tế bào ung thư trong điều kiện in vitro .................................................................... 25

2.2.9. Phương pháp thử độc tính tế bào MTS (3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) ....... 25

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 29

3.1. Kết quả nuôi biểu hiện protein p53 trong nấm men Pichia pastoris X33-36. .............................................................................................................. 29

3.1.1. Kết quả kiểm tra gen TAT-p53-His chứa trong hệ gen nấm men Pichia pastoris X33-36 ................................................................................ 29

3.1.2. Kết quả nuôi biểu hiện chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 .................................................................................................................... 30

3.1.3. Kết quả điện di dịch nuôi biểu hiện thô và sau khi tinh sạch .... 31

3.1.4. Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford ......... 33

3.2. Kết quả nuôi tế bào ung thư in vitro .................................................. 35

3.2.1. Kết quả kiểm tra khả năng ảnh hưởng của môi trường pha thuốc tới tế bào ung thư nuôi cấy ........................................................................... 36

3.2.2. Kết quả thử độc tính tế bào và khả năng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư với thuốc thử là protein p53 tái tổ hợp ...................................... 38

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 42

KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 43

PHỤ LỤC ............................................................................................................... 1

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Cấu trúc của protein p53 ở người ................................................................ 5

Hình 2. Cấu trúc phân tử của protein p53................................................................. 7

Hình 3: Các khảo sát nghiên cứu protein p53 từ 319 nghiên cứu độc lập. ................ 8

Hình 4: Điều chỉnh mức độ biểu hiện của protein p53 trong tế bào bị tác động bất lợi và bình thường. ................................................................................................ 10

Hình 5: Hai con đường phổ biến nhất dẫn tới apoptosis [3]. .................................. 11

Hình 6: Cấu trúc vector pPicZαA-TAT-p53-his. .................................................... 15

Hình 7: Tế bào HeLa dưới kính hiểm vi soi ngược Axiovert 40 CFL ..................... 17

Hình 8: Tế bào KMS-20 dưới kính hiểm vi soi ngược Axiovert 40 CFL ................ 17

Hình 9: Cấu trúc hóa học của muối MTS và sản phẩm Formazan .......................... 26

Hình 10: Hình ảnh điện di kết quả kiểm tra gen bằng phản ứng PCR ..................... 29

Hình 11: Đường sinh trưởng của chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 mang đi nuôi biểu hiện ........................................................................................................ 30

Hình 12. Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm protein tinh sạch .......................... 31

Hình 13: Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh sạch protein p53 ở các nồng độ Imidazol khác nhau. .............................................................................................. 32

Hình 14: Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm protein thu được và sau tinh sạch ở 2 điều kiện pH 6.0 và 8.0 ....................................................................................... 33

Hình 15. Đường chuẩn Bradford............................................................................ 34

Hình 16: Tế bào HeLa (A) và tế bào KMS-20 (B) sau 48h nuôi cấy in vitro (VK10, room 5.6) ............................................................................................................... 36

Hình 17: Tế bào HeLa trong điều kiện có môi trường pha mẫu P và không có môi trường pha mẫu P soi dưới kính hiển vi (VK10, room 5.6) .................................... 37

Hình 18: Tế bào KMS-20 trong điều kiện có môi trường pha mẫu P và không có môi trường pha mẫu P soi dưới kính hiển vi (VK10, room 5.6) ............................. 37

Hình 19: Hình thái tế bào HeLa sau 48h ủ với chế phẩm p53 với các nồng độ thử nghiệm khác nhau (VK10, room 5.6) ..................................................................... 38

Hình 20: Hình thái tế bào KMS-20 sau 48h ủ với chế phẩm p53-his với các nồng độ thử nghiệm khác nhau (VK10, room 5.6) .......................................................... 39

Hình 21: Dải màu sau khi thêm MTS vào dòng tế bào KMS-20 sau khi thử hoạt tính của protein p53 tái tổ hợp ...................................................................................... 40

Hình 22: Biểu đồ mối tương quan giữa logarit nồng độ chất thử và chỉ số tăng sinh A% ........................................................................................................................ 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

Bảng 2: Thành phần các dung dịch, đệm và môi trường nuôi cấy

Bảng 3: Thành phần gel polyacrylamide 12%

Bảng 4: Thành phần của phản ứng Bradford

Bảng 5: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thử nghiệm

Bảng 6: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS

Bảng 7: Kết quả đo OD595 nm dựng đường chuẩn

Bảng 8: Kết quả Bradford của quá trình tinh sạch

Bảng 9: Kết quả đo OD490 nm với dòng tế bào KMS-20 thử nghiệm thuốc

MỞ ĐẦU

Ung thư là tên bệnh dùng chung để mô tả một nhóm các bệnh phản ảnh

những sự thay đổi về sinh sản, tăng trưởng và chức năng của tế bào không kiểm

soát. Khi ung thư phát triển, tế bào bị phân chia mất kiểm soát và hình thành khối u

gây chèn ép lên các mô, cơ quan bên cạnh. Khối u có thể là lành tính hay ác tính

trong đó các khối u ác tính có khả năng di căn sang các phần khác của cơ thể thông

qua máu hoặc hệ bạch huyết. Trong khi đó khối u lành tính lại không di căn đồng

thời sau khi loại bỏ chúng thường sẽ không phát triển trở lại và ít gây nguy hiểm

cho người. Loại bỏ khối u ác tính cần phải sử dụng phương pháp phức tạp hơn như

thường được điều trị bởi sự kết hợp của các phương pháp như phẫu thuật, hóa trị, xạ

trị, miễn dịch, hormone, hoặc điều trị đích.

Ở Việt Nam, số ca mắc bệnh ung thư ngày một tăng, xuất hiện ở mọi lứa

tuổi, ngành nghề. Nguyên nhân mắc bệnh có thể do các tác nhân như vật lý, hóa

học, sinh học,… Thường khi phát hiện bệnh thì bệnh đã ở tình trạng nặng gây khó

khăn và tốn kém trong chữa trị. Trong khi đó các liệu pháp như hóa trị hay xạ trị chi

phí điều trị cao, gây nhiều tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân trong

và sau điều trị, với tỉ lệ thành công thấp. Vì thế, vấn đề cấp thiết hiện nay là tìm ra

một giải pháp điều trị ung thư hiệu quả, ít tốn kém và hạn chế gây ra tác dụng phụ.

Trước tình hình thực tế hiện nay, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang

nghiên cứu các phương pháp điều trị đích – Tiêu diệt hoặc ức chế tế bào ung thư mà

không làm ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào bình thường khác. Trong đó

protein p53 cũng được lựa chọn dựa vào những chức năng của nó như kiểm soát

chu trình tế bào, sửa chữa DNA và kích hoạt quá trình apoptosis. Protein p53 tái tổ

hợp cũng được báo cáo là có hoạt tính sinh học trong việc ức chế khối u [31]. Tuy

vậy, ở Việt Nam phương pháp điều trị đích chưa được ứng dụng mạnh mẽ đồng thời

chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam báo cáo về việc sử dụng protein p53 ngoại lai

như là một phương pháp điều trị đích đối với tế bào ung thư.

Từ những lý do trên, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã thực hiện đề tài

“Nghiên cứ u tinh sa ̣ch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấ m men Pichia pastoris

X33-36 và ả nh hưở ng củ a nó đế n tế bào ung thư nuôi cấy” nhằm nghiên cứu

tăng cường độ tinh sạch và bước đầu kiểm tra khả năng tác động ức chế của protein

p53 tái tổ hợp lên sự phát triển của tế bào ung thư, là cơ sở cho các thử nghiệm ở

mức độ cao hơn như ở các cấp độ mô và cơ thể.

Mục tiêu nghiên cứu:

 Kiểm nghiệm các điều kiện nuôi cấy nấm men Pichia pastoris X33-36

đã được tối ưu hóa biểu hiện trong nghiên cứu trước đây.

 Tối ưu hóa quá trình tinh sạch sản phẩm protein p53 tái tổ hợp nhằm

tạo ra một lượng protein p53 tái tổ hợp có độ tinh sạch cao và đủ lớn

cho thử nghiệm ở mức độ tế bào và cao hơn.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt

Nam

1.1. Tình hình ung thư trên thế giới

Ung thư là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu trên toàn thế

giới, với khoảng 18,1 triệu trường hợp mới vào năm 2018. Số ca tử vong do ung thư

lên đến 9,6 triệu người, chiếm gần 1/6 các ca tử vong. Trong cả hai giới, số ca mắc

bệnh do ung thư phổi chiếm tỷ lệ lớn nhất chiếm 11,6% trong tổng số ca và chiếm

18,4% trong tổng số ca tử vong do ung thư. Theo sau đó là ung thư vú ở nữ với

11,6% số ca mắc, ung thư tuyến tiền liệt với 7,1%...[10]. Đa số các ca mắc bệnh

thường được chuẩn đoán ở giai đoạn cuối khi mà không thể can thiệp và điều trị

được nữa. Khoảng 70% số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có thu nhập

thấp và trung bình. Năm 2017, chỉ có 26% các quốc gia có thu nhập thấp báo cáo có

dịch vụ khám bệnh công cộng trong khi ở các nước có thu nhập cao là 90%. Áp lực

của ung thư đến nền kinh tế là vô cùng đáng kể và đang ngày một gia tăng. Tổng

kinh phí hàng năm chi trả cho điều trị trong năm 2010 ước tính khoảng 1,16 nghìn tỉ

USD [26]. Dù vậy cũng chỉ có 1 trong 5 nước có thu nhập thấp và trung bình có

những dữ liệu cần thiết để thúc đẩy các chính sách phòng chống ung thư.

1.2. Tình hình ung thư ở Việt Nam

Năm 2018, theo dữ liệu từ cơ quan nghiên cứu quốc tế về ung thư (IARC). Ở

Việt Nam, số ca được chuẩn đoán mắc bệnh ung thư mới là 164 671người ( không

tính du học sinh ), và 114 871 theo số liệu ước tính từ hệ thống ghi nhận ung thư từ

6 tỉnh, thành phố năm 2010. Dự báo vào năm 2020 sẽ có ít nhất 189 344 ca ung thư

mới mắc. Trong số ca ung thư, 5 loại ung thư hàng đầu ở nam giới Việt Nam là ung

thư gan (21,5%), phổi (18,4%), dạ dày (12,3%), đại trực tràng (8,4%) và vòm họng

(5,0%) và ở phụ nữ là ung thư vú (20,6%), đại trực tràng (9,6%), phổi (9,4%), dạ

dày (8,6%) ) và gan (7,8%). Tỷ lệ bệnh nhân ung thư đến khám và điều trị sớm còn

thấp, năm 2009 một nghiên cứu tại 5 bệnh viện ung thư cho thấy chung các loại ung

thư 28,6% bệnh nhân đến giai đoạn I và II, đối với ung thư vú 50,5% đến sớm, ung

thư cổ tử cung 46,0% đến sớm và ung thư đại trực tràng 32,2% đến sớm Số người

chết vì ung thư trên năm là 94 700 người [26].

Dự án phòng chống ung thư là một dự án trong Chương trình mục tiêu quốc

gia phòng, chống một số bệnh xã hội, bệnh dịch nguy hiểm và HIV/AIDS giai đoạn

2006-2010, được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt ngày 17/7/2007 tại quyết định số

108/2007/QĐ-TTG. Mục tiêu của dự án là từng bước giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết

do ung thư và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân ung thư. Giai đoạn

2012-2015 mục tiêu khiêm tốn hơn, cụ thể là nâng cao nhận thức của cộng đồng về

phòng và phát hiện sớm bệnh ung thư và tăng 10-15% tỷ lệ bệnh nhân ung thư được

phát hiện ở giai đoạn sớm, đồng thời giảm tỷ lệ tử vong của một số loại ung thư: vú,

cổ tử cung, khoang miệng và đại trực tràng [35]

1.3. Các nguyên nhân gây ung thư

Ung thư xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau. Là quá trình chuyển đổi từ

tế bào bình thường thành tế bào khối u bằng một chuỗi các quá trình biến đổi sinh

hóa khác nhau, thường phát triển từ các tổn thương tiền ung thư cho đến ung thư ác

tính. Những thay đổi này là do sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của một người

với các tác nhân bên ngoài như: tác nhân vật lý với tia cực tím, bức xạ ion; tác nhân

hóa học như khói thuốc lá, aflatoxin, arsenic; và các tác nhân sinh học do nhiễm vi

khuẩn, virus. Tuổi tác cũng là nguyên nhân cơ bản cho sự phát triển ung thư. Tỷ lệ

mắc bệnh ung thư tăng đáng kể theo độ tuổi. Khoảng 1/3 số ca tử vong do ung thư

do lối sống và chế độ ăn uống với: các chỉ số trong cơ thể tăng cao bất thường, ăn ít

trái cây và rau quả, thiếu hoạt động thể lực, sử dụng thuốc lá và rượu. Trong đó sử

dụng thuốc lá là yếu tố gây nguy cơ cao nhất đến ung thư với khoảng 22% số ca tử

vong do ung thư [12]. Ung thư cũng có thể do vi khuẩn hoặc virus ví dụ HPV gây

ung thư cổ tử cung với khoảng 25% số ca ở các nước có thu nhập thấp và trung bình

[23].

1.4. Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư

Từ các nguyên nhân kể trên, các biện pháp làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung

thư bao gồm: tránh các tác nhân có nguy cơ mắc bệnh cao như sử dụng thuốc lá,

rượu, thừa cân – béo phì, chế độ ăn không lành mạnh với ít rau củ quả, thiếu hoạt

động thể chất, nhiễm HPV, HBV do lây nhiễm qua đường tình dục, bức xạ ion, tia

cực tím dưới ánh mặt trời, ô nhiễm không khí [5]. Đồng thời cũng tăng khả năng

phát hiện sớm ung thư bằng cách khám tổng thể định kỳ thường xuyên bởi điều trị ở

giai đoạn sớm ung thư, các bệnh nhân có nhiều khả năng sống sót cao hơn, chi phí

điều trị cũng thấp hơn. Để làm được điều đó cần tăng cường tuyên truyền cho người

dân nhận thức được nguy cơ tiềm ẩn của bệnh ung thư đồng thời tiếp cận và chăm

sóc, đánh giá lâm sàng cũng như chuẩn đoán và phân giai đoạn kịp thời để đưa ra

hướng điều trị phù hợp nhất.

Mỗi loại ung thư có một phác đồ điều trị cụ thể bao gồm một hoặc nhiều

phương thức như phẫu thuật, hóa trị hay xạ trị. Mục tiêu chính là kéo dài tuổi thọ

đồng thời cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên điều trị ung thư

bằng các phương pháp truyền thống thì lại tốn kém, đồng thời gây ra nhiều tác dụng

phụ cho bệnh nhân. Vì vậy hiện nay các nhà khoa học đang hướng đến nghiên cứu

liệu pháp điều trị đích. Khi đó thuốc chỉ tác động vào các tế bào ung thư mà không

gây ảnh hưởng đến các tế bào khác của cơ thể. Và giúp làm giảm thời gian, chi phí

điều trị ung thư lên nhiều lần giúp cải thiện cuộc sống cho các bệnh nhân ung thư.

2. Tổng quan về gen TP53 và protein p53

2.1. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53

Năm 1979, sáu nhóm nghiên cứu làm việc độc lập cùng công bố phát hiện

một protein có khối lượng 53 kDa có mặt trong các tế bào chuột và người (DeLeo et

al. 1979, Kress et al. 1979, Lane & Crawford 1979, Linzer & Levine 1979, Melero

et al. 1979, Smith et al. 1979). Ngay sau đó nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên

protein này và sau đó với gen mã hóa cho protein là TP53, cho thấy TP53 này là

một gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) [2].

Hình 1: Cấu trúc của protein p53 ở người [34]

Protein p53 là một phosphoprotein dạng tetrameric, là một trong những

protein có vai trò trong chu trình tế bào giúp ức chế quá trình hình thành khối u,

ngăn ngừa đột biến gen và sửa chữa DNA [27]. Tuy nhiên thực tế thì protein p53

dài đầy đủ có kích thước khoảng 43,7 kDa. Sự khác biệt này là do số axit amin

proline lớn nên protein di chuyển chậm hơn trên SDS-PAGE [33]. Ngoài các

protein có độ dài đầy đủ, gen TP53 ở người còn mã hóa cho ít nhất 15 đồng vị

protein có khối lượng từ 3,5 đến 43,7 kDa. Đồng thời các gen TP53 cũng là gen có

tần số đột biến cao nhất (>50%) trong tế bào ung thư ở người [27]. Các nghiên cứu

cũng chỉ ra rằng protein p53 cũng liên kết với DNA và điều chỉnh mức độ hoạt

động của gen và ngăn chặn sự hình thành đột biến [16]. Ở người, gen TP53 nằm

trên cánh ngắn của NST số 17 (17p13.1) [20].

Protein p53 là một polypeptide có độ dài khoảng 400 aa (393 aa với p53 ở

người). Monomer của p53 được gấp nếp bởi trong cơ thể, protein p53 tồn tại ở dạng

tetramers [1, 20, 27]. Cấu trúc protein p53 gồm có: miền kích hoạt phiên mã (1-42),

vùng giàu proline (64-92), khu vực lõi chứa một nguyên tử kẽm (102-292), miền

homo-oligomerisation (OD) cần thiết cho hoạt động của p53 trong cơ thể (307-355),

và vùng đầu mút C (356-393).

2.2. Cấu trúc không gian của protein p53

Protein p53 ở dạng monomer bao bao gồm 2 nếp gấp β song song với nhau.

Trong tế bào, protein p53 thường tồn tại ở dạng tetramer liên kết với nhau thông

qua vùng oligomer ở đầu C và liên kết với DNA tại vùng gắn đặc hiệu với DNA

(hình 2). Mỗi tetramer bao gồm hai dimer liên kết lại với nhau thông qua DNA. Mỗi

dimer lại được hình thành từ hai monomer thông qua liên kết liên phân tử giữa các

tấm β song song. Hai dimer lại liên kết với nhau thông qua tương tác kỵ nước tạo

thành tetramer chặt chẽ và có sự ổn định cao. Trung tâm của tetramer là các chuỗi

bên Leu344 từ tất cả các monomer tiếp xúc trực tiếp với nhau. Phần đầu của vùng

kích hoạt trên bốn monomer có thể liên kết được với bốn phân tử MDM2. Bình

thường trong tế bào, cấu trúc tetramer của protein p53 bao gồm bốn monomer liên

kết với phân tử DNA đích và bốn phân tử MDM2 [1, 11, 28].

Chú thích: A: protein p53 nhìn từ phía trên; B: chồng chất protein không có DNA (vàng)

bên trong phức hợp p53-DNA; C: cấu trúc tinh thể của 2 miền lõi liên kết với DNA; D: lắp

các miền lõi và DNA lại với nhau trong cấu trúc tinh thể [36].

Hình 2. Cấu trúc phân tử của protein p53 [24].

2.3. Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục

tiêu

Protein p53 hoạt động chủ yếu như một nhân tố phiên mã. Được kích hoạt để

đáp ứng các căng thẳng của tế bào như tổn thương DNA, căng thẳng ribosome,

thiếu oxy,… bằng cách ngừng chu trình tế bào hoặc gây ra apoptosis. Thông thường

trong tế bào protein p53 được liên kết với DNA ở dạng tetramer, gồm 2 dimer. Mỗi

dimer liên kết với một trình tự đồng thuận RRRCWWGYYY (R = A / G, W = A /

T, Y = C / T) [7]. Các gen mục tiêu đầu tiên được phát hiện bao gồm CDKN1A

(p21, CIP1, WAF1), GADD45A, và MDM2 [8,9,15]. Các nghiên cứu các mục tiêu

khác của p53 từ nghiên cứu tập trung đến nghiên cứu những gen riêng lẻ và đã đưa

ra khoảng 346 gen được mô tả trong 319 nghiên cứu độc lập được công bố từ năm

1992 đến năm 2016, với tối đa 26 nghiên cứu được công bố năm 2006 (hình 3a).

Trong số 346 gen, có 246 gen được báo cáo là được kích hoạt bởi p53, 26% là bị ức

chế và 3% là cả hai được kích hoạt và bị ức chế (hình 3b). Các nghiên cứu 319 (399

cặp nghiên cứu gen) đã điều tra 358 gen người, 47 gen chuột, 5 gen chuột và 1 gen

bò (Hình 3c). Cuối cùng, dữ liệu về protein của người được tập trung hơn cả.

Chú thích: (a) Số lượng nghiên cứu báo cáo các gen mục tiêu p53 riêng lẻ được

công bố trong một năm cụ thể. (b) Các gen được báo cáo là được kích hoạt, bị ức chế hoặc

cả được kích hoạt và bị ức chế bởi p53. (c) Các thí nghiệm được thực hiện trong các tế bào

từ người, chuột, chuột hoặc bò. Một số nghiên cứu đã sử dụng các tế bào từ nhiều hơn một

loài. (d) Liên kết của p53 nằm ở các phần khác nhau của gen. (e) các vị trí liên kết của p53

được đặt ở các khoảng cách khác nhau từ vị trí khởi đầu phiên mã (Transcriptional start

site, TSS). Một số gen hiển thị nhiều vị trí liên kết của p53. (f) Các phương pháp khác nhau

đã được sử dụng để xác định các vị trí liên kết của p53. (g) Số lượng ấn phẩm đã sử dụng

một phương pháp cụ thể để xác định vị trí liên kết của p53 [18].

Hình 3: Các khảo sát nghiên cứu protein p53 từ 319 nghiên cứu độc lập.

2.4. Chức năng của protein p53

Protein p53 hình thành bởi một homotetrameric đã được báo cáo có thể điều

chỉnh trực tiếp việc phiên mã của khoảng 500 gen mục tiêu. Nó kiểm soát hàng loạt

các quá trình tế bào bao gồm kiểm soát chu trình tế bào, lão hóa tế bào, sửa chữa

DNA, kiểm soát trao đổi chất và chết theo chương trình của tế bào.

Trong các tế bào bình thường mức độ biểu hiện của protein p53 rất thấp, nó

là protein nhắm mục tiêu làm thoái hóa proteosomal của E3 ubiquitin ligase

MDM2. Để đáp ứng với các kích thích căng thẳng khác nhau bao gồm việc kích

hoạt gen gây ung thư, tổn thương DNA hoặc thiếu oxy dẫn tới protein p53 được

kích hoạt để ngừng việc nhân bản của tế bào cũng như kích hoạt quá trình apoptosis

gây chết tế bào theo chương trình, qua đó giúp giảm thiếu tối đa rủi ro do tế bào bị

đột biến, ung thư… gây ra [21].

Protein p53 có nhiều chức năng khác nhau đặc biệt là ức chế tế bào tăng trưởng

tại điểm checkpoint tại G1/S nếu nhận diện thấy sự tổn thương DNA. Hay kích hoạt

quá trình sửa chữa DNA sai hỏng. Mà nếu không thể sửa chữa được nữa thì protein

p53 sẽ kích hoạt apoptosis gây ra chết theo chương trình tế bào. Các p53 hoạt hóa gắn

với DNA và kích hoạt biểu hiện của một số gen bao gồm cả viRNA miR-34a, WAF1 /

CIP1 mã hóa cho p21 và hàng trăm các dòng khác [21]. Protein p21 (WAF1) liên kết

với các phức hợp G1 - S / CDK (CDK4 / CDK6, CDK2 và CDK1) (các phân tử quan

trọng trong quá trình chuyển đổi G1/S trong chu kỳ tế bào) ức chế hoạt động của

chúng. Vì vậy protein p53 trở thành mục tiêu cho các nhà khoa học nghiên cứu về khả

năng điều trị tế bào ung thư dựa vào p53 ngoại lai.

2.5. Cơ chế protein p53 gây nên apoptosis và ảnh hưởng đến sự ức

chế tế bào khối u

Apoptosis là quá trình tế bào chết theo chương trình. Trong đó tế bào chết

theo một quy trình cụ thể, các thành phần của tế bào được đóng gói thành các bao

màng nhỏ để đưa đi xử lý. Khi mà tế bào già đi, bị đột biến hay bị tổn thương, tế

bào sẽ kích hoạt quá trình apoptosis để bảo vệ cơ thể khỏi tác động có hại của các tế

bào này [24].

Để đáp ứng với các kích thích căng thẳng như tổn thương DNA, gen ung thư

hay thiếu dinh dưỡng, mức độ protein p53 được tăng cường đáng kể thông qua việc

ức chế MDM2, một số là sửa đổi như acetyl hóa hay phosphoryl hóa ngay bên trong

protein p53, hình 4.

Hình 4: Điều chỉnh mức độ biểu hiện của protein p53 trong tế bào bị tác động bất

lợi và bình thường [3].

Có 2 con đường chính dẫn tới apoptosis. Con đường đầu tiên được điều hòa

bởi BCL-2, tế bào chết theo chương trình được bắt đầu bằng việc tăng cường dịch

mã và/hoặc sau dịch mã được gọi là pro-apoptotic BH3-only, là một thành viên

thuộc họ BCL-2 protein (BIM, PUMA, BID, BMF, BAD, BIK, NOXA, HRK).

BH3-only liên kết và ức chế nhân tố tiền sống sót BCL-2 protein (BCL-2, BCL-XL,

MCL-1, BCL-W and A1/BFL1). Bằng cách đó mà giải phóng nhân tố gây chết tế

bào là BAX và BAK (nhân tố tiền apoptosis chứa đa cấu trúc BH – một họ thuộc

protein BCL-2, có thể được bắt đầu bởi BOK). Việc kích hoạt BAX/BAK là nguyên

nhân cho việc giải phóng màng ngoài ty thể - điểm mà không thể quay lại trong tín

hiệu apotosis. Ngay sau đó kích hoạt caspase (điển hình là caspase-9) và APAF-1

dẫn tới phá hủy tế bào một cách triệt để [17]. Con đường ngược lại, bằng cách tăng

cường và kích hoạt tiền cấu trúc của caspase-8 thông qua adaptor FADD, và trong

những thành phần gây chết tế bào bên trong màng tế bào như TRADD. Trong dòng

tế bào gọi là tế bào type-1, việc kích hoạt caspase-8 thông qua caspase-3 và

caspase-7 là đủ để tiêu diệt tế bào [32]. Tuy nhiên đối với tế bào type-2, việc kích

hoạt caspase-8 phải thông qua việc kích hoạt của họ BCL-2 thông qua BH3-only,

hình 5.

Hình 5: Hai con đường phổ biến nhất dẫn tới apoptosis [3].

2.6. Tổng quan về các nghiên cứu biểu hiện protein cho liệu pháp

điều trị đích trong ung thư

Phương pháp điều trị đích (Targeted therapy) là một phương pháp điều trị ung thư bằng cách nhắm đến các mục tiêu là các gen, protein cụ thể nằm trong tế bào ung thư hoặc môi trường mô có liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến bệnh ung thư. Có 2 loại liệu pháp điều trị đích chủ yếu bao gồm:

 Kháng thể đơn dòng: nhắm vào các kháng nguyên cụ thể được tìm thấy trên bề mặt tế bào, chẳng hạn như thụ thể xuyên màng hoặc các yếu tố tăng trưởng ngoại bào.

 Các phân tử nhỏ: có thể xâm nhập màng tế bào để tương tác với các mục tiêu bên trong tế bào. Các phân tử nhỏ thường được thiết kế để can thiệp vào hoạt động enzyme của protein mục tiêu.

Chất kích thích miễn dịch: là các cytokine giúp cơ thể chống lại nhiễm trùng và ung thư. Sự phát triển của các sản phẩm kích thích các tế bào miễn dịch thích ứng và đáp ứng miễn dịch bẩm sinh dẫn đến khả năng sử dụng chúng cho các liệu pháp điều trị ung thư lâm sàng [17]. Các thuốc tái tổ hợp đầu tiên được phát triển là interferon-α2a (IFN-α2a) và interferon-α2b (IFN-α2b), được chấp thuận vào năm 1986. Các chỉ định điều trị của các loại thuốc này là để điều trị bệnh bạch cầu tế bào lông, Kaposi sarcoma, bệnh bạch cầu mãn tính. Thuốc tái tổ hợp tiếp theo được FDA phê chuẩn là interleukin-2, còn được gọi là aldesleukin cũng được sản xuất từ Escherichia coli. Interleukin-2 đóng vai trò kích hoạt sản xuất và kích thích sự mở rộng của các tế bào T, chỉ định điều trị ung thư biểu mô tế bào thận di căn và u ác tính di căn [9].

Vaccine: Hầu hết các loại vaccine nhằm mục đích tăng cường hoặc kích thích phản ứng miễn dịch chống lại khối u bằng các tế bào lympho T tế bào lympho T đặc hiệu kháng nguyên khối u. Kháng nguyên đặc hiệu khối u là một mục tiêu hoàn hảo cho vaccine ung thư. Các loại vaccine ung thư khác nhau bao gồm vaccine vector tái tổ hợp (virus và / hoặc vi khuẩn), vaccine axit nucleic (DNA và / hoặc RNA sao chép), vaccine protein và peptide, vaccine giống virus, vaccine toàn tế bào (vaccine tế bào DC- hoặc dựa trên tế bào khối u), vaccine ăn được và phương pháp kết hợp [6].

Kháng thể: kháng thể với mục đích trị liệu là các protein có đặc tính tốt nhất và là một trong những công cụ mạnh mẽ và thành công nhất mà các bác sĩ sử dụng để điều trị bệnh nhân ung thư, viêm hoặc bệnh truyền nhiễm. Một số kháng thể này giúp tăng cường hệ thống miễn dịch một lần trong cơ thể, nhưng những loại khác không thực sự ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch. Thay vào đó, các kháng thể này nhắm vào các bộ phận cụ thể của tế bào ung thư, ngăn chặn các tế bào phát triển hoặc khiến các tế bào chết. Kháng thể đơn dòng (mAbs) là nhóm kháng thể hiện đóng góp nhiều nhất cho các sản phẩm tái tổ hợp [36].

Miễn dịch độc tố: Một loại độc tố miễn dịch được tạo ra từ sự kết hợp của một phối tử tế bào có tính chọn lọc cao, được gọi là một phân tử đích (như kháng thể hoặc các mảnh của nó, một yếu tố tăng trưởng, một kháng nguyên carbohydrate hoặc một kháng nguyên liên quan đến khối u). Gần như tất cả các độc tố miễn dịch hoạt động bằng cách ức chế tổng hợp protein [4]. Hiện tại chỉ có một loại độc tố miễn dịch được FDA phê chuẩn, được gọi là denileukin Diftitox.

Protein tổng hợp: Hầu hết các protein tổng hợp được thiết kế từ một miền ngoại bào thụ thể và phần Fc của một loại IgG. Những protein này có thể ức chế một hoặc nhiều thụ thể, hoạt động trong sự hình thành khối u liên quan đến khối u, can thiệp vào tín hiệu EGFR và kích thích sự tăng trưởng các tế bào miễn dịch [19].

2.6.1. Liệu pháp điều trị ung thư dựa vào protein p53

Ba mươi năm nghiên cứu về p53 đã tạo ra một sự hiểu biết chi tiết về cấu trúc và chức năng của nó. Sự mất gần như hoàn toàn của hoạt động p53 trong các khối u đã thúc đẩy một nỗ lực to lớn để phát triển các phương pháp điều trị ung thư mới dựa trên thực tế này. Việc chuyển gen TP53 kiểu dại vào nhiều loại tế bào khối u ở người đã được thể hiện vào cuối những năm 1980 và đầu những năm 1990 để gây ra apoptosis và ức chế tăng trưởng. Jack Roth là người đầu tiên thử liệu pháp gen TP53 ở người. Năm 1996, ông đã sử dụng tiêm trực tiếp một vectơ retrovirus biểu hiện gen TP53 ở người dưới sự kiểm soát của chất kích thích Actin để điều trị ung thư biểu mô tế bào phổi [25].

Các phương pháp sinh học khác bao gồm sự phát triển của virus oncolytic được thiết kế để sao chép và tiêu diệt chỉ các tế bào khiếm khuyết p53 và cả sự phát triển của siRNA và RNA antisense kích hoạt p53 bằng cách ức chế chức năng của các chất điều hòa âm tính Mdm2, MdmX và HPV E6. Việc xử lý thay đổi p53 xảy ra trong các tế bào khối u có thể gợi ra phản ứng của tế bào T và tế bào B với p53 có thể có hiệu quả trong việc loại bỏ tế bào ung thư và vaccine dựa trên p53 hiện đang được thử nghiệm lâm sàng. Một số phân tử nhỏ kích hoạt trực tiếp hoặc gián tiếp kích hoạt phản ứng p53 cũng đã được thử nghiệm, trong đó tiên tiến nhất là các chất ức chế tương tác p53-mdm2.

3. Nghiên cứu biểu hiện protein p53 trong nấm men trên thế giới và ở

Việt Nam

Nghiên cứu của Yan và cộng sự trong bài báo: “Expression and purification

of human TAT-p53 fusion protein in Pichia pastoris and its influence on HepG2

cell apoptosis”, được báo cáo năm 2012 đăng trên Tạp chí Biotechnology Letter

[31]. Nghiên cứu này đã tạo thành công hệ thống biểu hiện protein TAT-p53 trên

nấm men Pichia pastoris với tín hiệu peptide HSA và thu được một lượng lớn

protein tái tổ hợp TAT-p53, với 104 mg TAT-p53 trên 2 lít môi trường nuôi biểu

hiện. Hiệu suất tinh sạch sản phẩm protein tái tổ hợp là >87%. Bên cạnh đó, chuyển

nạp protein TAT-p53 chức năng vào tế bào ung thư cho thấy hiệu quả ức chế tế bào

khối u rõ rệt với quá trình apoptosis.

Năm 2017, trong báo cáo:” Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở

nấm men Pichia pastoris X33”, chúng tôi đã tạo thành công chủng nấm men Pichia

pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT-p53-His và tối ưu quy trình biểu hiện

p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33-36. Protein p53 tái tổ hợp được xác

định bám đặc hiệu của protein lên trình tự promoter của gen MDM2 bằng phương

pháp EMSA. Và đã tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp tại pH 6.0 thu

được với hiệu suất tinh sạch là 56%.

Tuy nhiên hiệu suất tinh sạch protein trong nghiên cứu của chúng tôi chưa

cao chỉ đạt được độ tinh sạch thấp (56%), cần thiết phải cải tiến quy trình tinh sạch

protein p53 tái tổ hợp này để thu được sản phẩm protein với độ tinh sạch cao hơn.

Cụ thể có thể tăng pH tinh sạch từ 6.0 lên 8.0 cho hiệu quả bám đặc hiệu của

imidazol cao hơn đồng thời thử nghiệm nồng độ imidazol ở các nồng độ khác nhau

cho hiệu quả đẩy protein tốt hơn. Cần thử nghiệm các hoạt tính của protein này trên

mức độ tế bào và cơ thể để đánh giá khả năng xâm nhập của protein này vào tế bào

ung thư cũng như khả năng ức chế khối u như các nghiên cứu của Yan đã báo cáo

trước đó.

4. Vector pPicZαA-TAT-p53-his và cơ chế thử nghiệm protein p53

tái tổ hợp trên mức độ tế bào

Vector pPicZαA-TAT-p53-his có cấu trúc như sau:

Hình 6: Cấu trúc vector pPicZαA-TAT-p53-his.

Trong nghiên cứu trước đó, plasmid pPicZαA-TAT-p53-his được chế tạo và protein p53 tái tổ hợp được biểu hiện thông qua chủng nấm men Pichia pastoris X33-36. Plasmid pPicZαA-TAT-p53-his có thể đi qua màng tế bào vào trong nhân do cấu trúc TAT giúp tải nạp plasmid qua màng đã được báo cáo từ những nghiên cứu trước đây. Protein p53 sẽ được dịch mã trong nhân và đưua ra màng tế bào để tiết ra ngoài. Nhờ đuôi histag trong cấu trúc protein này mà ta có thể tinh sạch protein dựa vào cột niken-resin. Protein sẽ đi vào tế bào thông qua tải nạp bằng cơ chế của tế bào sông. Gây ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào và bắt giữ chu kỳ tế bào tại pha G2.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và hóa chất

2.1.1. Vật liệu

 Chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 mang đoạn gen mã hóa cho protein

p53 tái tổ hợp được kế thừa từ kết quả của đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện

protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33” của Thạc sĩ Trần Thị

Thúy Nga.

 Tế bào ung thư HeLa được mua từ Bảo tàng Giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC,

Hoa Kỳ) và KMS-20 được mua ở Hàn Quốc và được duy trì, nuôi cấy trên

môi trường in vitro trên phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào động vật.

 Đĩa nuôi cấy tế bào, pipet và đầu tip cùng các vật liệu tiêu hao khác sử dụng

trong nghiên cứu đều được mua từ các hãng uy tín.

2.1.1.1. Tế bào ung thư cổ tử cung HeLa Nguồn gốc: Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa có nguồn gốc từ tế bào

ung thư cổ tử cung vào ngày 8 tháng 2 năm 1951 từ Henrietta Lacks , một

bệnh nhân đã chết vì ung thư vào ngày 4 tháng 10 năm 1951.

Hình dạng: có dạng hình sao do có sống bám dính (hình 6).

Thời gian nhân đôi: ̴ khoảng 22 giờ trong điều kiện nuôi cấy ở 37oC, 5%

CO2.

Môi trường nuôi cấy: DMEM low glucose (1g/L) + 10% FBS + 1% kháng

sinh (penicillin + streptomycin).

Hình 7: Tế bào HeLa dưới kính hiểm vi soi ngược Axiovert 40 CFL

2.1.1.2. Tế bào ung thư máu KMS-20 Nguồn gốc: Được lấy từ dòng tế bào ung thư tủy ở người.

Hình dạng: Có hình cầu tròn nhỏ, một phần là tế bào đa nhân, sống trôi nổi

nhiều lớp trong môi trường nuôi cấy (hình 7).

Thời gian nhân đôi: trung bình khoảng 60 giờ trong điều kiện nuôi cấy ở

37oC, 5% CO2.

Môi trường nuôi cấy: RPMI1640 + 10% FBS + 1% kháng sinh (ampicillin +

streptomycin).

Hình 8: Tế bào KMS-20 dưới kính hiểm vi soi ngược Axiovert 40 CFL

2.1.2. Hóa chất

Bảng 1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

Số thứ tự

Tên hóa chất

Hãng sản xuất

1. Gel tinh sạch Niken – Sepharose

GElife-Sciences

protein Unstained Protein

Thermo, Mỹ

Molecular Weight Marker

3. DMEM (Dulbecco’s Modified

Gibco, Mỹ

Eagle Medium) 11885

4. RPMI (Roswell Park Memorial

Gibco, Mỹ

Institute Medium) 1640

FBS (Fetal Bovine Serum)

Invitrogen, Mỹ

P-S (penicillin + Streptomycin)

Invitrogen, Mỹ

L-glutamine

Invitrogen, Mỹ

8. DMSO (Dimethyl sulfoxide)

Gibco, Mỹ

Trypsin

Invitrogen, Mỹ

10.

PBS (Phosphate Buffered Saline)

Gibco, Mỹ

11. Blue Trypan

Gibco, Mỹ

12. MTS

Promega, Mỹ

13.

PMS (Phenazine Methyl Sulfate)

Promega, Mỹ

 Các hóa chất cơ bản khác sử dụng trong nghiên cứu này đều đạt độ

tinh khiết cần thiết dùng cho thí nghiệm ở mức độ sinh học phân tử.

2.1.3. Các dung dịch và đệm Các dung dịch và đệm đã sử dụng trong thí nghiệm đều được pha theo các

quy trình và công thức chuẩn, có thành phần và nồng độ như đã trình bày trong

bảng sau:

Bảng 2: Thành phần các dung dịch, đệm và môi trường nuôi cấy

Dung dịch

Thành phần, nồng độ

4X Tris-HCl/SDS pH 8.8

Đệm 1,5M Tris-HCl, pH 8,8; 0,4% SDS

4X Tris-HCl/SDS pH 6.8

Đệm 0,5M Tris-HCl, pH 6,8; 0,4% SDS

30% Polyacrylamide

30% Acrylamide; 0,8% Bis-acrylamide

Đệm điện di protein

20mM Tris-HCl; 192mM Glycine; 0,1% SDS, pH 8,3

Đệm 5X TBE

1,1M Tris; 25mM EDTA ; 900mM Borate, pH 8,0

Đệm gắn cột N1

50mM NaH2PO4; 0,5M NaCl ; 0,5mM Imidazole, pH 8,0

Đệm rửa cột N2

50mM NaH2PO4 ; 0,5M NaCl ; 20mM Imidazole, pH 8,0

50mM NaH2PO4 ; 0,5M NaCl ; 200mM Imidazole, pH

Đệm đẩy N3

8,0

Dung dịch tẩy CBB

30% (v/v) Methanol; 10% (v/v) Acid Acetic

Môi trường nuôi cấy YPD

2% Peptone; 1% Cao nấm men; 2% Glucose

Môi

trường

nuôi

cấy

YP; 1,34% YNB; 4.10-5 Biotin; 0,5% Methanol

BMMY

0,1 M Phosphate Buffer, pH 6,0;

Dịch bảo quản protein (P)

20% glycerol; 1% BSA; 0,01% Sucrose

0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue;

Dung dịch nhuộm CBB

30% (v/v) Methanol; 10% (v/v) Acid Acetic

24 Chloroform : 1 Isopropanol (v/v)

5% Ethanol; 0,01% Coomassie Brilliant Blue G250;

Bradford buffer

8,5% Phosphoric Acid

2% Triton X-100; 1% SDS; 100mM NaCl; 10mM Tris,

Breaking buffer

pH 8,0; 1mM EDTA, pH 8,0.

2.1.4. Thiết bị dùng trong nghiên cứu

 Bể ổn nhiệt Memmert WNB14; máy lắc cỡ lớn; máy đo OD Bionate 3, máy

đo Nanodrop của Spectrophotometer, hệ thống điện di protein của hãng

BioRad.

 Máy nuôi lắc tạo giống tại Khoa môi trường.

 Tủ ấm 37oC, 5% CO2 của hãng Shel Lab, Mỹ.

 Tủ an toàn sinh học cấp 2 của hãng Esco, Mỹ.

 Kính hiểm vi quang học, Kính hiểm vi soi ngược Axiovert 40 CFL của hãng

Carl Zeiss, Đức.

 Đĩa, chai nuôi cấy tế bào, đĩa nuôi cấy đa giếng 96 giếng của hãng Corning,

Mỹ.

 Các thiết bị, máy móc cần thiết khác tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền

học và Phòng thí nghiệm nuôi tế bào động vật, Bộ môn Sinh học Tế bào,

Khoa Sinh học; Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein

và Phòng thí nghiệm Môi trường Đất, Khoa Môi Trường, Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Kiểm tra chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và nuôi biểu hiện

thu sinh khối protein p53 tái tổ hợp

Chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 sau khi được lấy ra từ tủ lạnh âm

sâu (- 80oC) cho ngay vào hộp chứa đá lạnh để rã đông mẫu từ từ trong 15 phút. Sau

khi được rã đông, hỗn hợp chứa chủng nấm men và dung dịch bảo quản được hút

ngay sang ống fancol 15 ml đã chứa 5 ml môi trường nuôi khởi động YPD đã chuẩn

bị sẵn từ trước. Ống fancol hỗn hợp được nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 30oC, 220

vòng. Sau 24 giờ thu sinh khối dịch nuôi khởi động đem đo OD600 và dùng một

phần dịch nuôi khởi động đem đi tách chiết DNA tổng số và làm PCR kiểm tra sự

có mặt của vector tái tổ hợp pPicZ-αA-p53 không. Sau khi kiểm tra chắc chắn sự có

mặt của gen mong muốn, trích 2ml dịch nuôi khởi động cho vào bình nuôi chứa môi

trường BMMY đã chuẩn bị sẵn để đem đi nuôi biểu hiện ở điều kiện lắc vòng 220

vòng/phút, 30oC. Cứ sau mỗi 24 giờ lại trích dịch nuôi đi đo OD600 và bổ sung 0,5%

(v/v) methanol. Dịch nuôi được thu lại sau 72 giờ, loại bỏ tế bào chết bằng cách ly

tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó, protein trong dịch nuôi được tủa lại

bằng acetone 100%, biến tính và điện di trên gel polyacrylamide 12%.

2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của nấm men Nguyên lý của phương pháp tách chiết là màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm

và các chất tẩy mạnh. Protein được loại bằng hỗn hợp CI ((24 Chloroform : 1

isopropanol) và DNA tổng số của nấm men được thu bằng cách kết tủa với

isopropanol và ethanol lạnh. Các bước tiến hành của phương pháp như sau: tế bào

nấm men được nuôi lắc trong 5ml môi trường YPD qua đêm ở 30oC với tốc độ 250

vòng/phút. Dịch nuôi được ly tâm 8.000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào.

300 μl đệm breaking buffer được bổ sung và lắc nhẹ cho tới khi hòa tan hoàn toàn

tủa. Hỗn hợp được ủ -80oC trong 15 phút, sau đó cho ngay vào 95oC, ủ 1 phút. Bước

này được lặp lại 3 lần. Hỗn hợp sau đó được bổ sung tiếp 250 μl dung dịch CI, lắc kỹ

và ly tâm 12.000 vòng/phút, trong 20 phút. Dịch nổi phía trên được thu sang ống mới,

bổ sung 300 μl ammonium acetate, để lạnh 15 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10

phút và thu dịch ở phía trên. DNA được tủa bằng 600 μl isopropanol, ủ ở -80oC trong

10 phút. Tủa DNA được thu lại bằng ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa

được rửa với ethanol 70%, sau đó ly tâm thu lại tủa và để khô ở nhiệt độ phòng. Cuối

cùng, tủa DNA được hòa tan trong 30 μl TE và 0,25 μl RNase, ủ 37oC trong 15 phút.

DNA tổng số được bảo quản ở -20oC để sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR

kiểm tra thể biến nạp.

2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose

Nguyên tắc của kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose là dựa trên tính chất

của các phân tử DNA tích điện âm nên trong môi trường trung tính và kiềm, dưới

tác dụng của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức độ di chuyển của

các phân tử DNA trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước (hay khối

lượng phân tử) của chúng. Phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh còn phân

tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm. Sử dụng thang chuẩn DNA với kích thước

đã biết có thể dễ dàng xác định được kích thước tương đối của DNA mẫu. Quy trình

tiến hành của kĩ thuật điện di như sau: 1,0 g agarose được đun nóng trong 100ml

đệm TAE và đúc vào khuôn. Sau khi gel agarose đông hoàn toàn, hỗn hợp gồm 5μl

mẫu DNA được trộn với 1 μl đệm (có chứa chất chỉ thị màu bromophenol xanh,

xylence cyanol và EtBr ở nồng độ 50 μg/μl) được tra vào các giếng trên bản gel.

Quá trình điện di với hiệu điện thế ổn định là 100V kéo dài đến khi vạch màu

bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2cm thì dừng lại. Sau đó, gel được lấy ra

và soi dưới ánh sáng tử ngoại. Các đoạn DNA gắn với EtBr có thể quan sát được

dưới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.

2.2.4. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-

PAGE)

Nguyên lý của phương pháp SDS-PAGE sử dụng gel polyacrylamide để điện

di protein theo phương pháp điện di biến tính của Leammli và cộng sự (1970). Theo

đó, các phân tử protein trong môi trường có SDS bị duỗi thẳng và tích điện âm, do

vậy chúng sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào

khối lượng phân tử của chúng. Thành phần acrylamide trong gel phụ thuộc vào khối

lượng phân tử của protein được điện di.

Bảng 3. Thành phần gel polyacrylamide 12%

Thành phần

Gel tách 12% (µl)

Gel cô 5% (µl)

1293

675

H20 khử trùng

1520

200

30% polyacrylamide

950

4X Tris – HCl pH 8.8

300

4X Tris – HCl pH 6.8

10% APS

TEDMED

Tổng

3800

1200

Quy trình thực hiện như sau: bản gel điện di gồm hai lớp, lớp dưới là gel tách

có chứa 12% polyacrylamide được đổ cách vị trí cắm lược điện di 1,5 cm, để đông

hoàn toàn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cô (có 5% polyacrylamide) phía trên, cài

lược để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đông hoàn toàn và ổn

định. Thành phần của hai lớp gel được trình bày như trong bảng 2.6. Bản gel sau đó

được lắp vào hệ thống điện di BioRad và chạy với điện áp 150V cho tới khi dye ra

khỏi bản gel. Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng CBB

trong 1-3 giờ và tẩy màu bằng dung dịch tẩy. Bản gel được rửa với nước cất và

quan sát kết quả bằng mắt thường.

2.2.5. Phương pháp sắc ký ái lực

Phương pháp sắc ký là phương pháp phổ biến nhất để tinh sạch protein. Các

protein thường dễ mất hoạt tính sinh học khi bị tách ra khỏi tế bào hay cơ thể. Mỗi

protein khác nhau lại nhạy cảm với những tác nhân ở các mức độ khác nhau. Vì vậy

cần lựa chọn phương pháp tinh sạch protein đơn giản mà hiệu quả nhất đồng thời

không làm mất hoạt tính của protein cần tinh sạch. Nguyên tắc chung của hệ thống

sắc ký bao gồm 2 pha: Pha cố định (A) và pha chuyển động (B). Các chất cần tách

ra khỏi nhau phải có tỷ số hệ số phân bố trong pha A và B khác nhau. Lựa chọn A

và B dựa vào sự khác nhau của các chất cần tách. Các bước chính trong quá trình

sắc ký bao gồm: Nhồi cột, cân bằng cột, nạp mẫu, rửa cột, rửa chiết, phân đoạn. Sau

đó phân tích và đánh giá kết quả hàm lượng, hoạt tính, độ sạch của chế phẩm. Trong

đó sắc ký ái lực phân tách protein dựa trên nguyên tắc tương tác đặc hiệu sinh học,

thuận nghịch giữa protein với phối tử đặc hiệu gắn trên gel. Cho phép tinh sạch hợp

chất cần quan tâm một cách khá đặc hiệu, có thể chỉ cần một bước đã thu được chế

phẩm tinh sạch. Quá trình tinh sạch còn cho phép cô đặc mẫu, rất cần thiết đối với

những chất có nồng độ thấp.

Thí nghiệm của chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký ái lực với protein tái

tổ hợp được tinh sạch bằng cột resin gắn Niken đặc hiệu cho các protein tái tổ hợp

có đuôi polyhistidine. Trong đó, resin là chất mang dạng liên kết chéo, chứa thụ thể

iminodiacetic acid và chất này làm cầu nối với Ni2+. Cột Resin-Niken có ái lực cao

với đuôi polyhistidine. Việc gắn kết hình thành thông qua liên kết giữa ion Ni2+ và

đuôi 6X-His trong phân tử protein. Tinh sạch protein được thực hiện dưới điều kiện

không biến tính như chỉ dẫn của Invitrogen. Protein liên kết với resin được rử a giải

bằng đệm pH thấp hoặc bằng đệm chứa muối imidazol. Quy trình tinh sạch được

tiến hành như sau: 3ml mẫu cô từ dịch nuôi biểu hiện p53 ở nấm men được pha

loãng 3 lần với đệm gắn cột N1 để đưa lên cột chứa 2 ml Niken-Sapharose đã được

cân bằng với đệm gắn cột N1. Sau đó, cột được rửa 3 lần, mỗi lần với 8 ml đệm rửa

N2 cho tới khi OD280 nm < 0,05 (mức tin tưởng không còn protein trôi ra trong

dịch rửa). Cuối cùng, mẫu được thu lại bằng 6-8 ml đệm N3 (1 ml/phân đoạn). Sản

phẩm protein tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 15%. Bảo

quản protein bằng dung dịch P (glycerol 20%, BSA 1%) ở nhiệt độ -20oC.

2.2.6. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Nguyên tắc của phương pháp Bradford là khi protein phản ứng với CBB sẽ

tạo phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm.

Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein

tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết

thanh bò BSA đã biết trước nồng độ.

Thí nghiệm được tiến hành như sau: pha loãng BSA 100X (nồng độ

10mg/ml) xuống còn nồng độ 1,0 mg/ml. Chuẩn bị các ống eppendorf 1,5 ml có bọc

giấy bạc (do CBB nhạy cảm với ánh sáng) và đánh số từ 1 đến 7 và một số ống khác

chứa mẫu protein cần định lượng. Mỗi ống eppendorf được pha với dung dịch

Bradford và đệm theo thành phần như trình bày trong bảng 2.9 để thu được nồng độ

BSA từ 0 µg/ml đến 50 µg/ml. Khi ống thứ nhất ủ được 5 phút thì tiếp tục pha ống

thứ hai và cứ như thế cho đến hết. Các mẫu được đảo đều và ủ trong nhiệt độ phòng

cho tới khi ống thứ nhất được 40 phút thì bắt đầu tiến hành đo OD595 nm, tiếp tục

lặp lại với mẫu thứ hai khi đạt được 40 phút cho đến khi hết mẫu. Kết quả đo OD595

nm được ghi nhận và sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Chỉ số tin cậy R2 càng gần

1 thì kết quả xây dựng đường chuẩn càng đáng tin cậy.

Bảng 4: Thành phần của phản ứng Bradford

Ống số

1

2

3

4

5

6

7 mBSA (µg)

VBSA (µl)

400

395

390

380

370

360

350

Elution buffer

600

Bradford buffer

Tổng (µl)

1000

Đường chuẩn có phương trình y = ax + b. Trong đó, y là độ hấp phụ ở bước

sóng 595 nm (OD595) và x là hàm lượng protein (mg). Dựa vào đường chuẩn có thể

tính được tương đối lượng protein thu được trong mẫu cần định lượng.

2.2.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư trong điều kiện in vitro

Tế bào ung thư được nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy cơ bản, bổ sung thêm

10% FBS và 1% kháng sinh (ampicillin và streptomycin). Trong đó bào sau khi

được lấy ra từ tủ -80oC sẽ được rã đông từ từ bằng nước ấm đến nhiệt độ 37oC.

Ngay sau đó pha loãng dung dịch tế bào có chứa chất bảo quản DMSO (vì DMSO

gây độc cho tế bào) với dịch nuôi tế bào đã pha. Tiếp đó ly tâm ống hỗn hợp ở 1000

vòng trong 5 phút. Thu lấy cặn tế bào rồi nuôi lên đĩa hoặc chai nuôi tế bào có chứa

dịch nuôi. Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của tế bào ung thư. Xem xét kỹ

hình dạng tế bào cũng như sức sống, sức tăng trưởng của tế bào. Đến khi nào tế bào

phủ kín khoảng 80% bề mặt đĩa (chai) nuôi cấy thì mới bắt đầu cho lên đĩa 96 giếng

đem đi thử nghiệm chế phẩm.

2.2.8. Phương pháp kiểm tra sự ảnh hưởng của dung dịch P lên tế bào

ung thư trong điều kiện in vitro

Để chắc chắn rằng dung dịch P không ảnh hưởng đến khả năng sống sót và

sinh trưởng của tế bào, dung dịch P được pha loãng với nước cho đến nồng độ 50%.

Sau đó lấy 2ml dung dịch 50% P cho vào 4 giếng của hai dòng tế bào HeLa và dòng

tế bào KMS-20 đã được nuôi ổn định chứa 198ml dung dịch nuôi cấy cùng tế bào.

Được nồng độ dung dịch P cuối cùng ở trong mỗi giếng là 5%. Sau đó đem đĩa thử

96 giếng đi nuôi ở điều kiện 37oC, 95% O2, 5% CO2 và kiểm tra sự sinh trưởng và

phát triển của tế bào sau 24h, 48h và 72h. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần, với mỗi

lần lặp lại với 4 giếng thí nghiệm.

2.2.9. Phương pháp thử độc tính tế bào MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-

yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)

Phương pháp MTS dựa trên sự chuyển màu của chất MTS (3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-

tetrazolium) có màu vàng thành MTS-formazan có màu từ xanh đậm đến cam vàng

bởi enzyme trong ty thể của tế bào sống. Số lượng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng

độ formazan, thể hiện qua giá trị OD490 nm của dung dịch. Trong đó formazan sau

khi được tạo ra từ quá trình chuyển hóa MTS thành sẽ có điện tích âm và có thể hòa

tan trong môi trường nuôi cấy tế bào mà không cần thêm thuốc thử thứ hai để hòa

tan tủa formazan. Thuốc thử MTS được dùng kèm với thuốc nhận điện tử trung gian

như phenazine methyl sulfate (PMS) hoặc phenazine ethyl sulfate (PES) có thể xâm

nhập vào các tế bào sống (Trong thí nghiệm này chúng tôi dùng chất nhận điện tử

trung gian là PMS). Khử hidro hóa xảy ra trong tế bào chất hoặc bề mặt tế bào và

thoát ra khỏi tế bào có thể chuyển đổi tetrazolium thành sản phẩm formazan hòa tan

[22].

Hình 9: Cấu trúc hóa học của muối MTS và sản phẩm Formazan

Sau một thời gian nuôi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào

HeLa được tách rời bằng dung dịch trypsin/EDTA, ly tâm ở 1500 vòng/phút ở 30oC

với tế bào dạng trôi nổi KMS-20 thu sinh khối tế bào. Sau đó cả 2 dòng tế bào HeLa

và KMS-20 được cấy vào các đĩa 96 giếng khác nhau, mỗi giếng gồm 100µl dịch

huyền phù chứa 104 tế bào. Tế bào được ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 24h để ổn định lại

tế bào. Môi trường cũ được thêm vào 100 µl bằng môi trường chứa protein p53 tái

tổ hợp với dãy nồng độ 0,109375 µg/ml – 7 µg/ml (bước nhảy nồng độ 2x) chứa

0,5% dung dịch P với cả 2 dòng tế bào được thử nghiệm và đối chứng.

Bảng 5: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thử nghiệm

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 Thuốc (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml)

P53-his 7 3.5 1.75 0.875 0.4375 0.21875 0.109375

Cả 2 lô đều được ủ 48 giờ trong điều kiện nhiệt độ 37oC, 95% O2, 5% CO2

cho đến khi tế bào tại giếng đối chứng sinh trưởng khoảng 70% bề mặt giếng. Sau

thời gian ủ, thêm vào mỗi đĩa 30µl dung dịch MTS chứa PMS. Sau 2 giờ ủ với MTS

ở 37oC, đo OD490 nm của cả 2 lô thí nghiệm và lô đối chứng.

Bảng 6: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS

Các bước Chi tiết Ghi chú chính

Chuẩn bị đĩa 96 giếng và tế bào khỏe

mạnh

Thu tế bào bằng Trypsin-EDTA 1x, sau 1. Chuẩn bị tế đó ly tâm ở 1500 rpm, 5 phút. bào

Đảm bảo tế bào ở mỗi Sử dụng pipet đa kênh để nhả vào mỗi giếng khoảng 5000 tế bào/180 µl môi giếng được dàn đều trường/ giếng

Pha dung dịch thuốc trung gian và đối chứng dung môi (ĐCDM) với nồng độ Nồng độ DMSO cuối

gấp 10 lần nồng độ cuối cùng thử ở các là 0,5%

giếng.

Bổ sung 20 µl thuốc tương ứng lên các Hòa đều vào môi trường, tránh làm ảnh 2. Pha thuốc và thuốc thử

giếng thử

hưởng đến sức sống của tế bào trong giếng

Đặt đĩa 96 giếng trong tủ 37oC, 5% CO2, theo dõi đối tượng trong 48h

Tránh ánh sáng 3. Ủ MTS Chuẩn bị dung dịch MTS/PMS với tỉ lệ 1 PMS : 20 MTS

Tránh ánh sáng

Thêm 30µl hỗn hợp trên vào mỗi giếng, ủ trong 3 giờ với điều kiện 37oC, 5% CO2

Sử dụng máy Microplate Reader Model

4. Đo OD490

680 để đo kết quả OD490 nm của từng giếng

Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Sử dụng phần mềm excel để xử lý số liệu, tính

chỉ số IC50. Chỉ số này là giá trị mà tại đó nồng độ chất thử gây chết/ức chế 50% tế

bào.

Chỉ số IC50 của một chất được tính từ nghiệm phương trình hồi quy thể hiện

mối tương quan giữa x là nồng độ (hoặc logarit nồng độ) chất thử và y là chỉ số tăng

sinh A(%) được tính theo công thức:

A (%) = V/Vh x 100 (%)

Trong đó: V: chỉ số OD490 nm trung bình ở các giếng thử thuốc; Vh: chỉ số

OD490 trung bình ở các giếng đối chứng dung môi (ĐCDM).

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nuôi biểu hiện protein p53 trong nấm men Pichia

pastoris X33-36.

3.1.1. Kết quả kiểm tra gen TAT-p53-His chứa trong hệ gen nấm men

Pichia pastoris X33-36

Tế bào nấm men từ tủ bảo quản (-80oC) được rã đông từ từ và nuôi khởi động trong môi trường YPD ở 30oC, tốc độ lắc 100-200 rpm qua đêm. Một lượng

nhỏ tế bào (200 µl) được sử dụng để tách DNA tổng số. DNA sau khi tinh sạch

được dùng cho phản ứng PCR sử dụng 2 cặp mồi AOXI_Fw/AOXI_Rv và

EcoRI_Fw/XhoI_Rv. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR được trình bày như

Hình 9.

Chú thích: DNA: DNA tổng số; M: thang chuẩn DNA 1kb; giếng 1,2,3,4: sản phẩn PCR

với cặp mồi AOX1_Fw/AOX1_Rv; 5,6,7: sản phẩm PCR với cặp mồi EcoRI_Fw/XhoI_Rv.

Hình 10: Hình ảnh điện di kết quả kiểm tra gen bằng phản ứng PCR

Từ kết quả điện di trên gel agarose 1% với sản phẩm là DNA tổng số được

tách ra từ chủng nấm men Pichia pastoris X33-36. Chúng tôi nhận thấy chủng nấm

men vẫn giữ được gen đúng như mong muốn.

Với cặp mồi EcoRI_Fw/XhoI_Rv, chúng tôi thu được 1 băng điện di có kích

thước khoảng 1,2 kb tương ứng với kích thước gen TAT-p53-His đã thiết kế (giếng

5,6,7- Hình 9). Đối với cặp mồi AOX1_Fw/AOX1_Rv, sản phẩm PCR đều cho 2

băng có kích thước khoảng 2,2kb tương ứng với vùng AOX1 có sẵn trong hệ gen

của nấm men và băng có kích thước khoảng 1,8kb tương ứng với đoạn gen TAT-

p53-His (1247bp) cùng với 600bp nằm giữa 2 trình tự mồi xuôi (5’-AOX1) và mồi

ngược (3’-AOX1) trên vector pPICZαA (giếng 1,2,3,4 – hình 9). Kết quả này đúng

như đã công bố trước đây.

Như vậy có thể kết luận rằng đoạn trình tự pPICZαA-TAT-p53-His vẫn tồn

tại ổn định trong chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và có thể sử dụng để nuôi

biểu hiện tạo ra sản phẩm protein p53- tái tổ hợp.

3.1.2. Kết quả nuôi biểu hiện chủng nấm men Pichia pastoris X33-36

Để kiểm tra tốc độ tăng trưởng của chủng nấm men Pichia pastoris X33-36

với nguồn dinh dưỡng là methanol nồng độ 0,5% nuôi trong môi trường YPM.

Chúng tôi đã đo OD600 nm sau mỗi 24h nuôi cấy, với 3 lần lặp lại thí nghiệm và thu

được kết quả như sau:

m n 0 0 6 D O

Thời gian (h)

lần 1

lần 2

lần 3

Hình 11: Đường sinh trưởng của chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 mang đi nuôi biểu hiện

Từ kết quả thu được nhận thấy khả năng tăng trưởng của chủng nấm men

Pichia pastoris X33-36 khá tốt. Không có sự khác biệt quá lớn giữa các lần lặp lại

thí nghiệm nuôi cấy và so với kết quả đã báo cáo trước đây. Đảm bảo được chất

lượng nấm men đủ điều kiện sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.3. Kết quả điện di dịch nuôi biểu hiện thô và sau khi tinh sạch

Sau khi nuôi cấy, các tế bào bị loại bỏ bởi ly tâm ở tốc độ 5.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC và thu lấy dịch nổi ở trên (dịch nuôi biểu hiện). Sau đó sử dụng

cột vivaspin 20 (Pierce™ Protein Concentrator PES, 30K MWCO, 5-20 mL) với

mỗi ống chứa 15ml dung dich nuôi biểu hiện đã loại bỏ tế bào, đem ly tâm ở

6000rpm, 30 phút, lặp lại 3 lần. Từ 1 lít dịch nuôi biểu hiện chúng tôi thu lại được

400ml dịch nuôi biểu hiện thô. Dịch nuôi biểu hiện thô sẽ tiếp tục được cô lại bằng

acetone tỉ lệ 1:3 (1 mẫu : 3 acetone). Dịch cô được sử dụng cho quá trình tinh sạch

sử dụng cột Niken sepharose với pH 8.0. Điện di sản phẩm protein trên gel

acrylamide sử dụng phương pháp SDS-PAGE thu được kết quả như sau:

Hình 12. Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm protein tinh sạch

Chú thích: M: thang chuẩn marker protein không màu; 1: dịch cặn; 2: Dịch tinh

sạch; 3: dịch cô mẫu dịch thu; 4: Dịch thu ban đầu.

Từ kết quả điện di cho thấy khả năng tinh sạch của protein p53 thu được từ

nuôi biểu hiện protein p53 trong chủng Pichia pastoris X33-36 cho kết quả như

mong đợi (dịch tinh sạch chỉ mang một băng duy nhất có kích thước 47kDa). Xuất

hiện băng có kích thước lớn hơn 66,2kDa là protein của tế bào nấm men Pichia

pastoris X33-36 tiết ra ngoài môi trường mà không phải protein p53. Trong quá

trình cô mẫu sử dụng cột cô vivaspin 20 chỉ loại bỏ được các protein có kích thước

nhỏ hơn 30kDa. Vì vậy vẫn còn lại protein này trong dịch cô. Tuy nhiên trong qua

trình tinh sạch, protein này đã bị loại bỏ hoàn toàn. Khả năng bám đặc hiệu của

imidazol với protein ở pH=8.0 cao hơn so với kết quả sử dụng ở pH=6.0. Băng điện

di cho sáng rõ ràng, không có sản phẩm phụ cũng như protein tạp trong dịch tinh

sạch. Có thể sử dụng dịch tinh sạch này sử dụng tiếp cho quá trình thử hoạt tính

sinh học của protein p53 đối với khả năng ảnh hưởng của protein p53 tái tổ hợp này

với khả năng ức chế tăng trưởng đối với tế bào của nó.

Thử nghiệm ở các nồng độ Imidazol trong dịch gắn cột N1 ở các nồng độ

khác nhau cho kết quả như sau:

66,2 kDa

45 kDa

Hình 13: Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh sạch protein p53 ở các

nồng độ Imidazol khác nhau.

Chú thích: 1: Dịch cặn; M: marker protein không màu; 2-6: tinh sạch ở các

nồng độ imidazol khác nhau. 2: 0 mM, 3: 0,5 mM; 4: 1mM; 5: 5mM; 6: 7mM.

Kết quả cho thấy: với dịch gắn cột N1 có nồng độ imidazol 0 mM cho hiệu quả tinh sạch tốt, tuy nhiên vẫn còn xuất hiện băng phụ. Trong khi đó với nồng độ imidazol tăng lên 1 mM, 5mM và 7mM thì hiệu suất tinh sạch giảm dần rõ rệt, chứng tỏ ngoài protein p53 gắn vào gel thì imidazol cũng cạnh tranh 1 phần, vì vậy có 1 lượng protein p53 nhất định không gắn được với gel bị rửa trôi ra ngoài trong quá trình lên mẫu vào cột. Trong khi đó nồng độ 0,5 mM imidazol cho kết quả băng

với nồng độ protein tốt nhất, không chứa băng phụ. Tối ưu nhất cho tinh sạch mẫu protein p53 này.

So sánh khả năng tinh sạch và nồng độ mẫu giữa protein thu được ở 2 thí

nghiệm ở pH=8 và pH=6, kết quả như sau:

Hình 14: Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm protein thu được và sau

tinh sạch ở 2 điều kiện pH 6.0 và 8.0

Chú thích: M: marker protein không màu; 1: dịch cô thu được; 2: dịch cặn; 3, 4:

dịch tinh sạch ở pH=8; 5: dịch thô môi trường; 6: dịch cô thu được; 7, 9: dịch tinh

sạch ở pH=6; 8: dịch cặn.

Kết quả thu được cho thấy protein thu được bằng phương pháp sử dụng

pH=8 cho hiệu suất tinh sạch cao hơn, đạt nồng độ protein cao hơn so với phương

pháp pH=6.

3.1.4. Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Để xác định hiệu suất tinh sạch qua cột Niken-Sepharose, hàm lượng protein

trong các dịch mẫu theo các bước tinh sạch được xác định theo phương pháp

Bradford. Kết quả đo mức hấp thụ ánh sáng OD595 nm (bảng 7) được ghi nhận sau

40 phút ủ ở nhiệt độ phòng được chúng tôi sử dụng để xây dựng đường chuẩn

Bradford. Chỉ số tin cậy R2 đạt 0,9392 cho thấy đường chuẩn xây dựng được đạt độ

tin cậy cao.

Bảng 7: Kết quả đo OD595 nm dựng đường chuẩn

0

5

10

20

30

40

50 mBSA (µg)

0.34

0.46

0.622

0.83

0.95

1.102

OD595 nm

Đường chuẩn Bradford xây dựng được có phương trình là y = 0.0198x +

1.4

1.2

y = 0.0198x + 0.1764 R² = 0.9392

0.8

OD595 nm

0.6

0.1764.

m n 5 9 5 D O

Linear (OD595 nm)

0.4

0.2

30 mBSA

Hình 15. Đường chuẩn Bradford

Dựa vào phương trình đường chuẩn (Hình 3.14), chúng tôi xác định được

nồng độ trong mẫu cần định lượng (X) bằng công thức sau:

(𝑦−0,1764)

0,0198.𝑉

X (mg/ml) =

Trong đó, y là giá trị OD595 nm đã đo được ở mẫu, V (µl) là thể tích mẫu đã

sử dụng trong phản ứng Bradford.

Với 6 ml dịch cô được đưa lên cột, chúng tôi thu lại được 3 ml dịch tinh sạch

chứa protein p53 tái tổ hợp và sử dụng để làm mẫu đo trong phản ứng định lượng

Bradford. Kết quả đo OD595 nm và nồng độ protein tương ứng được trình bày trong

Bảng 8

Bảng 8: Kết quả đo nồng độ protein bằng phương pháp Bradford của quá trình tinh sạch Dịch trôi cột FT

TAT-p53-His

Dịch cô

Hiệu suất (%)

V (µl)

0.825

0.188

1.185

OD595 nm

0.655

0.011

1.019

77.8

Nồng độ (mg/ml)

Lượng protein tổng số trong 6ml dịch cô là:

mprotein tổng số = 0.655 x 6 = 3.93 (mg)

Lượng protein p53 tái tổ hợp thu được trong 3ml dịch tinh sạch là:

mp53 = 1.019 x 3 = 3.057 (mg)

Hiệu suất tinh sạch là:

H = mp53: mprotein tổng số = 3.057/3.93 = 77.8%

Với 60ml dịch cô, lượng protein tổng số là:

mprotein tổng số = 60 x 0,655 = 39.3 (mg)

Với hiệu suất H= 0,778, tổng lượng p53 tái tổ hợp thu được từ 60ml dịch cô là:

mp53 = 39.3 x 0.778 = 30.5754 (mg)

Do vậy, với 400ml môi trường nuôi biểu hiện (tương đương với 60ml dịch

cô) thì nồng độ p53 tái tổ hợp thu hồi được là 30.5754 mg. Từ kết quả này so sánh

với kết quả của các nghiên cứu trước cũng như nghiên cứu của Thạc sĩ Trần Thị

Thúy Nga năm 2017, chúng tôi đưa ra kết luận rằng đã tinh sạch được protein p53

tái tổ hợp với nồng độ cao hơn, khả năng tinh sạch cũng như hiệu quả tinh sạch cao

hơn. Tại điều kiện tinh sạch pH=8.0 cho thấy hiệu quả tinh sạch trở nên rõ ràng hơn

so với điều kiện tinh sạch tại pH=6.0 như trước đó. Đồng thời tuy lượng dung dịch

thu lại sau mỗi lần tinh sạch ít hơn so với lượng dịch cho vào một nửa nhưng hiệu

suất tinh sạch lại thể hiện rõ ràng hơn 21,8% so với kết quả công bố trước đây.

3.2. Kết quả nuôi tế bào ung thư in vitro

Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa và ung thư máu KMS-20 là hai dòng tế

bào được sử dụng cho nghiên cứu, dòng HeLa có đặc điểm sinh trưởng và phát triển

bám dính, còn dòng KMS-20 có đặc điểm là sống trôi nổi trong môi trường nuôi cấy.

Điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển là ở điều kiện 37oC, 95% O2 và

5% CO2, môi trường nuôi cấy DMEM low với dòng HeLa và RPMI 1640 với dòng

tế bào KMS-20 có bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh (Ampicillin / streptomycin).

A B

Hình 16: Tế bào HeLa (A) và tế bào KMS-20 (B) sau 48h nuôi cấy in vitro

(VK10, room 5.6)

3.2.1. Kết quả kiểm tra khả năng ảnh hưởng của môi trường pha thuốc

tới tế bào ung thư nuôi cấy

Môi trường để bảo quản protein p53-his sử dụng là Glycerol (25%) + BSA

(~1%) + Sucrose (~0.01%). Chúng tôi sử dụng nguyên nồng độ dung dịch như trên

nhưng thay vì được pha với protein p53-his thì chúng tôi pha với môi trường nuôi

cấy của 2 dòng tế bào HeLa (DMEM low) và KMS-20 (RPMI 1640) trong 10%

FBS và 1% kháng sinh P-S. Sau đó nuôi cả 2 dòng tế bào ở 37oC, 5%CO2 trong

24h. Kết quả nuôi cấy như sau:

A

B

Hình 17: Tế bào HeLa trong điều kiện có môi trường pha mẫu P và không

Chú thích: A: Tế bào HeLa không có môi trường pha mẫu P; B: Tế bào HeLa trong điều

kiện có môi trường pha mẫu P.

có môi trường pha mẫu P soi dưới kính hiển vi (VK10, room 5.6)

Với kết quả tế bào HeLa thu được chúng tôi nhận thấy tế bào HeLa được

nuôi trong môi trường có sử dụng môi trường pha mẫu không thể hiện sự khác biệt

so với dòng tế bào đối chứng được nuôi trong môi trường nuôi cấy bình thường. Từ

đó có thể kết luận rằng môi trường sử dụng để pha mẫu không có ảnh hưởng đến

sức sống, khả năng sinh trưởng của dòng tế bảo HeLa.

Với dòng tế bào KMS-20:

A

B

Hình 18: Tế bào KMS-20 trong điều kiện có môi trường pha mẫu P và

Chú thích: A: Tế bào KMS-20 không có môi trường pha mẫu P; B: Tế bào KMS-20 trong điều kiện có môi trường pha mẫu P.

không có môi trường pha mẫu P soi dưới kính hiển vi (VK10, room 5.6)

Với kết quả tế bào KMS-20 thu được chúng tôi nhận thấy tế bào KMS-20 được nuôi trong môi trường có sử dụng môi trường pha mẫu không thể hiện sự khác biệt so với dòng tế bào đối chứng được nuôi trong môi trường nuôi cấy bình thường. Từ đó có thể kết luận rằng môi trường sử dụng để pha mẫu không có ảnh hưởng đến sức sống, khả năng sinh trưởng của dòng tế bảo KMS-20.

3.2.2. Kết quả thử độc tính tế bào và khả năng ức chế tăng trưởng tế bào

ung thư với thuốc thử là protein p53 tái tổ hợp

Sau khi tra thuốc ở 48h với dải 7 nồng độ: 7 µg/ml – 3.5 µg/ml – 1.75 µg/ml

– 0.875 µg/ml – 0.4375 µg/ml – 0.21875 µg/ml – 0.109375 µg/ml trên đĩa 96 giếng

tại điều kiện 37oC, 5% CO2. Chúng tôi quan sát dưới kính hiển vi và ghi lại hình

ảnh hình thái tế bào tất cả các giếng ở đối chứng cũng như thí nghiệm, từ đó so sánh

sự thay đổi về số lượng, hình thái giữa các lô.

Hình 19: Hình thái tế bào HeLa sau 48h ủ với chế phẩm p53 với các nồng độ thử

Chú thích: A: giếng đối chứng; B: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.109375 µg/ml; C: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.875 µg/ml; D: giếng sử dụng nồng độ thuốc 7 µg/ml.

nghiệm khác nhau (VK10, room 5.6)

Kết quả thu được cho thấy, đối với dòng tế bào HeLa, dòng tế bào có đặc

điểm sống bám dính. dưới tác dụng của chế phẩm P53-his ở tất cả các nồng độ thử

nghiệm đều cho thấy không có sự khác biệt nào so với đối chứng cả về mật độ cũng

như hình thái tế bào.

Hình 20: Hình thái tế bào KMS-20 sau 48h ủ với chế phẩm p53-his với các nồng

độ thử nghiệm khác nhau (VK10, room 5.6)

Kết quả đối với dòng tế bào KMS-20, dòng tế bào có đặc điểm sống trôi nổi

trong dịch nuôi cấy, dưới tác dụng của chế phẩm P53-his cho thấy sự khác biệt rõ

ràng. Trong đó, với nồng độ thuốc thử cao nhất 7 µg/ml cho thấy tế bào vẫn sống

sót, tế bào vẫn tròn đều, sáng chứng tỏ thuốc không ảnh hưởng làm gây chết tế bào.

Tuy nhiên số lượng tế bào rất ít, chỉ chiếm khoảng 20% bề mặt giếng, ít hơn rất

nhiều so với giếng đối chứng sinh trưởng khoảng 90% bề mặt giếng. Trong khi đó

giếng thử nghiệm với nồng độ thuốc thử thấp nhất 0.109375 µg/ml cho thấy số

lượng tế bào gần như không khác biệt quá lớn so với giếng đối chứng. Từ đây

chúng tôi dự đoán rằng chỉ số IC50 của chế phẩm protein tái tổ hợp p53-his nằm

trong khoảng giới hạn của các nồng độ thử nghiệm.

Với kết quả về so sánh hình thái thu được cho thấy chế phẩm P53-his không thể hiện tính độc trên hai dòng tế bào nghiên cứu HeLa và KMS-20, có tác dụng ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của dòng tế bào ung thư máu KMS-20.

Kết quả nhuộm đĩa 96 giếng với thuốc thử MTS cho thể hiện màu rõ ràng từ

màu vàng nhạt đến màu nâu đậm đối với dòng KMS-20 với các nồng độ thuốc thử

khác nhau như sau:

Hình 21: Dải màu sau khi thêm MTS vào dòng tế bào KMS-20 sau khi thử hoạt

Chú thích: ĐC: Đối chứng; 1,2,3,4,5,6,7: Dải thử nồng độ từ 0,109375 µg/ml đến 7 µg/ml

với bước nhảy 0,5 lần mỗi giếng.

tính của protein p53 tái tổ hợp

Kết quả đo OD490 nm bằng máy đo quang học với bước sóng cực đại 490nm:

Với dòng tế bào KMS-20:

Bảng 9: Kết quả đo OD490 nm với dòng tế bào KMS-20 thử nghiệm thuốc

Nhiệt độ

Đối

C7

C6

C5

C4

C3

C2

C1

chứng

(oC)

25.8

0.7875

0.7189

0.7012

0.65

0.6063

0.4754

0.372

0.3964

25.8

0.6909

0.7587

0.6473

0.6461

0.56

0.4576

0.3679

0.3987

25.8

0.721

0.8672

0.8646

0.7512

0.6123

0.4667

0.4411

0.4688

Ghi chú: C1: 7 µg/ml; C2: 3.5 µg/ml; C3: 1.75 µg/ml; C4: 0.875 µg/ml; C5: 0.4375 µg/ml;

C6: 0.21875 µg/ml; C7: 0.109375 µg/ml.

Với kết quả đo được bảng 9 trên, hoàn toàn phù hợp với kết quả so sánh hình

thái. Để xác định cụ thể giá trị IC50 của từng chất, dựa vào mối tương quan giữa

nồng độ chất thử và số lượng tế bào, bằng phương pháp toán học trong Excell

chúng tôi vẽ biểu đồ và thu được giá trị IC50=2.1 µg/ml đối với dòng KMS-20, đối

với dòng HeLa thì chưa xác định được giá trị này vì ngay tại nồng độ thử nghiệm

cao nhất về số lượng và hình thái đạt mức tương đương với đối chứng.

A%

y = 27.723x3 - 158x2 + 250.32x - 15.118 R² = 0.9925

120

100

0.5

1.5

2.5

Hình 22: Biểu đồ mối tương quan giữa logarit nồng độ chất thử và chỉ số tăng sinh A%

Với giá trị IC50=2.1µg/ml, cho thấy rằng chế phẩm đã thể hiện rõ ràng tính

ức chế 50% sinh trưởng tế bào KMS-20, chưa thấy tác dụng gây độc cho tế bào.

KẾT LUẬN

Từ kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:

1. Đã tối ưu được quy trình tinh sạch protein p53-his được biểu hiện trên

chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 ở pH = 8.0, đạt hiệu suất tinh sạch

lên đến 77,8%.

2. Đã thử nghiệm độc tính và khả năng ức chế của chế phẩm protein p53-his

ở mức độ tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư máu KMS-20 và dòng tế bào

ung thư cổ tử cung HeLa cho kết quả chế phẩm chỉ gây ức chế sự sinh

trưởng ở dòng tế bào KMS-20 mà không gây độc cho tế bào.

KIẾN NGHỊ

Từ kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị như sau:

1. Tiếp tục sử dụng chế phẩm p53 tái tổ hợp ở các dòng tế bào ung thư khác

và thử nghiệm ở cấp độ mô, cơ thể nhằm kiểm nghiệm khả năng đưa chế

phẩm để chữa trị cho các bệnh nhân ung thư.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Andreas C., Joerger and Alan R. Fersht, (2010), “The Tumor Suppressor p53: From Structures to Drug Discovery”, Cold Spring Harb Perspect Biol, pp. 5-6.

2. Arnold J. Levine, (2017), “The Evolution of Tumor Formation in Humans and Mice with Inherited Mutations in the p53 Gene”, Curr Top Microbiol Immunol. 2017, pp. 1.

3. Brandon JA., LK. Gemma, J. Ana, JH. Marco, and A. Strasser. (2018), “How does p53 induce apoptosis and how does this relate to p53- mediated tumour suppression?”, Cell Death and Differentiation.

4. Choudhary S. , Mathew M. and Verma RS., (2011), “Therapeutic potential of anticancer immunotoxins”, Drug Discov Today. 2011 Jun, pp. 495- 503.

5. Creagan, T. Edward and Mayo C. (2001), “Mayo Clinic on healthy

aging”.

6. Dillman RO.,

(2011), “Cancer

immunotherapy”, Cancer Biother

Radiopharm, pp. 1-64.

7. el-Deiry W. S. , S.E. Kern, J.A. Pietenpol, K. W. Kinzler and Vogelstein B., (1992). “Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics”, pp. 45-49.

8. el-Deiry W. S. , T. Tokino, V. E. Velculescu, D. B. Levy, R. Parsons, J. M. Trent, D. Lin, W. E. Mercer, K. W. Kinzler and Vogelstein B., (Nov 19), “WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression”, Cell. 1993, pp. 17-25.

9. el-Deiry W. S., T. Tokino, T. Waldman, J. D. Oliner, V. E. Velculescu, M. Burrel, D. E. Hill, E. Healy, J. L. Rees and Hamilton S. R., (1995), “Topological control of p21WAF1/CIP1 expression in normal and neoplastic tissues”, Cancer Res, pp. 9.

10. Freddie B., J. Ferlay; I. Soerjomataram, R. L. Siegel, L. A. Torre and Ahmedin J. (2018), Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries, CA CANCER J CLIN 2018.

11. Friedman PN., X. Chen, J. Bargonetti and Prives C. (1993), “The p53 protein is an unusually shaped tetramer that binds directly to DNA”, pp. 5878.

12. GBD 2015 Risk Factors Collaborators. Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015, Lancet. 2016 Oct; 388 (10053): pp. 1659-1724.

13. Hunter J. J., B. L. Bond and Parslow T. G., (1996), “Functional dissection of the human Bcl2 protein: sequence requirements for inhibition of apoptosis”, Mol Cell Biol, pp. 877-83.

14. Kappeler KV., J. Zhang, TN. Dinh, J. Strom and Chen QM. (2012), “Histone Deacetylase 6 Associates with Ribosomes and Regulates De Novo Protein Translation during Arsenite Stress”, Toxicol, Sci, pp. 246-55.

15. Kastan M. B., Q. Zhan, W. S. el-Deiry, F. Carrier, T. Jacks, W. V. Walsh, B. S. Plunkett, B. Vogelstein and Fornace AJ. Jr., (1992), “A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia”, Cell, 1992 Nov 13; pp. 587-97.

16. Lane, edited by Arnold J. Levine and David P. (2010),The p53 family: a subject collection from Cold Spring Harbor Perspectives in biology. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

17. Liu MA., (2011), “Cancer vaccine”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.

2011 Oct 12; pp. 2823-6.

18. M. Fischer, (2017), “Census and evaluation of p53 target genes”,

Oncogene. 2017 Jul 13, pp. 3943–3956.

19. Maria-Cristina SP. and Thiessa RV., (2013), “Production of recombinant immunotherapeutics for anticancer treatment”, Bioengineered, pp. 306.

20. McBride OW., D. Merry and Givol D. (January 1986), "The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 short arm (17p13)", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, pp. 130–4.

21. Mraz M., K. Malinova, J. Kotaskova, S. Pavlova, B. Tichy, J. Malcikova, Stano K. Kozubik, J. Smardova, Y. Brychtova, M. Doubek, M. Trbusek, J. Mayer and Pospisilova S. (June 2009), "miR-34a, miR-29c and miR-17-5p are downregulated in CLL patients with TP53 abnormalities", Leukemia, pp. 1159–63.

22. Özlem SA., (2017), In Vitro Cytotoxicity and Cell Viability Assays:

Principles, Advantages, and Disadvantages, pp. 5.

23. Plummer M, C. de Martel, J. Vignat, J. Ferlay, F. Bray and Franceschi S. (2012), “a synthetic analysis. Lancet Glob Health”, Global burden of cancers attributable to infections in 2012: pp. 30143-7.

24. Ricardo A., M. B. Sherman, K. Brownless, R. Lurz, A. L. Okorokov and Elena V. O., (2011),” Quaternary structure of the specific p53–DNA complex reveals the mechanism of p53 mutant dominance”, Nucleic Acids Research, Vol. 39, No. 20, pp. 5.

25. Roth JA., Nguyen D., Lawrence DD., Kemp BL., Carrasco CH., Ferson DZ., Hong WK., Komaki R., Lee JJ., Nesbitt JC., Pisters KM., Putnam JB., Schea R., Shin DM., Walsh GL., Dolormente MM., Han CI., Martin FD., Yen N., Xu K., Stephens LC., McDonnell TJ., Mukhopadhyay T. and Cai D., (1996), “Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer”, Nat Med. 1996 Sep, pp. 985-91.

26. Stewart BW., CP. Wild, editors, World cancer report 2014, “Lyon:

International Agency for Research on Cancer”.

27. Surget S., MP. Khoury and Bourdon JC. (December 2013), "Uncovering the role of p53 splice variants in human malignancy: a clinical perspective", OncoTargets and Therapy, pp. 57–68.

28. Wang P., M. Reed, Y. Wang, G. Mayr, JE. Stenger, ME. Anderson, JF. Schwedes and Tegtmeyer P. (1994), “p53 domains: structure, oligomerization, and transformation”, pp. 5182-91.

29. Weidle UH., Schneider B., Georges G. and Brinkmann U., (2012), “Genetically engineered fusion proteins for treatment of cancer”, Cancer Genomics Proteomics. 2012 Nov, pp. 357-72.

30. Wu X., J. H. Bayle, D. Olson and Levine A. J., (1993), “The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop”, Genes Dev. 1993 Jul, pp. 1126-32.

31. Yan H., N. Liu, Z. Zhao, X. Zhang, H. Xu, B. Shao and Yan C. (2012), “Expression and purification of human TAT-p53 fusion protein in Pichia pastoris and its influence on HepG2 cell apoptosis”. Biotechnol Lett. 2012 Jul, pp. 1217-23.

32. Zha H., C. Aimé-Sempé, T. Sato and Reed J. C.,(1996), “Proapoptotic protein Bax heterodimerizes with Bcl-2 and homodimerizes with Bax via a novel domain (BH3) distinct from BH1 and BH2”, J Biol Chem. 1996 Mar 29, pp. 7440-4.

33. Ziemer MA., A. Mason and Carlson DM. (September 1982), "Cell-free translations of proline-rich protein mRNAs", The Journal of Biological Chemistry, pp. 11176–80.

34. https://www.britannica.com/science/TP53

35. http://vanban.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/hethongvanban?cla

ss_id=1&mode=detail&document_id=33577

36. http://www.cancer.org/acs/groups/cid/documents/webcontent/003013-

pdf.pdf

PHỤ LỤC

PL 1. Trình tự của gen TAT-p53-His sau cải biến

> TAT-p53-His 5’- GAATTCTACGGTCGTAAGAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTATGGAA GAACCCCAGTCCGATCCTTCTGTGGAGCCACCTTTGTCCCAAGAA ACCTTCTCTGACCTTTGGAAGTTATTGCCAGAGAATAATGTGTTGT CCCCATTGCCTTCCCAGGCTATGGATGACTTAATGTTATCTCCTGA CGACATCGAACAGTGGTTCACTGAGGACCCAGGACCTGATGAAG CCCCAAGGATGCCTGAGGCCGCTCCACGTGTCGCCCCAGCTCCTG CTGCCCCAACCCCTGCTGCCCCAGCTCCAGCCCCATCTTGGCCATT GTCTTCCTCTGTCCCATCCCAAAAAACTTACCAAGGATCTTACGGT TTTCGTTTAGGATTCCTTCACTCCGGTACCGCCAAATCCGTCACTT GTACCTACTCCCCTGCCTTAAATAAGATGTTTTGCCAATTGGCTAA GACCTGTCCTGTCCAGTTGTGGGTTGACTCCACCCCACCTCCAGG AACTAGAGTCAGAGCTATGGCTATCTACAAACAATCCCAACACAT GACTGAAGTTGTCAGAAGATGCCCACATCATGAGAGATGCTCTGA CTCCGATGGATTGGCCCCACCTCAGCACTTAATTCGTGTTGAAGG TAATTTGCGTGTTGAATACTTGGATGATAGAAATACCTTTCGTCAT TCCGTGGTCGTTCCATATGAACCTCCTGAAGTTGGATCTGATTGTA CTACCATTCACTATAACTATATGTGTAACTCCTCTTGTATGGGAGG TATGAATAGACGTCCTATTTTGACCATCATTACTTTAGAAGATTCC TCTGGTAACTTATTGGGTCGTAATTCCTTTGAAGTCCATGTTTGCG CTTGTCCAGGTCGTGATCGTAGAACTGAGGAAGAAAATTTGAGGA AGAAAGGTGAACCTCACCATGAATTACCACCAGGATCCACCAAA AGAGCTTTATCTAACAACACCTCTTCCTCACCACAGCCAAAGAAG AAACCACTTGACGGTGAGTATTTCACTCTTCAAATTAGAGGTCGT GAAAGATTCGAGATGTTTAGAGAGTTGAACGAGGCTCTTGAATTA AAAGACGCCCAAGCTGGTAAAGAACCAGGAGGCTCCAGGGCTCA CTCATCTCATTTGAAGTCCAAAAAGGGACAGTCCACTTCAAGACA CAAAAAGTTAATGTTCAAGACCGAAGGTCCAGATTCAGATCATCA TCATCATCATCATTGATTTCTAGA-3’

PL 2. Trình tự suy diễn của acid amin trong protein p53-his sử dụng

website https://web.expasy.org/translate/

> 5'3' Frame 1 5’- EFYGRKKRRQRRRMEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSP LPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPT PAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPA LNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVR RCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYE PPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNS FEVHVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALSNNTSSSP QPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSR AHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSDHHHHHH-FL-3’