Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên

Chia sẻ: Up Upload | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:77

Thêm vào BST

Báo xấu

275
lượt xem 85
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------   ------ BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CH I STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH C HỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2008
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------   ------ B ÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã s ố: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VI THỊ ĐOAN CHÍNH THÁI NGUYÊN - 2008
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn s âu s ắc tới cô giáo TS. Vi Th ị Đoan Chính đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn t hành luận văn này. Xin chân thành c ảm ơ n ThS. Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ c ủa bộ môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Xin chân thành c ảm ơn PGS. TS. Ngô Đình Quang Bính và các c án bộ phòng Di truy ền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Xin c ảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Y - Dƣợc Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHTN đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Xin c ảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh đã tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc học tập và hoàn thành luận văn này. Tôi xin c ảm ơ n c ác thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Lời cảm ơn s âu s ắc nhất tô i xin d ành cho gia đình và những ngƣời t hân yêu c ủa tôi.
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008 Tác giả Bùi Thị Hà
MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ , đồ thị MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN..................................................................3 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên............................................3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.................................................. 4 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn............................................. ..5 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn........................................ ............................6 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI... ...........8 1.2.1. Đặc điểm hìn h thái và tính chất nuôi cấy................................ .....8 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)..................................9 1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................10 1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)............................................10 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces..........................................11 1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN................................................ .12 1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh...........................................12 1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn..................................15 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh........16 1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT..................................................18
1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm......................................................18 1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật................................. 21 Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất.........................................................................24 2.1.1. Nguyên liệu...... .................................................................... ......24 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.................. ...................................24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................... .................................... ...27 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè...........................27 2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn..........................................................28 2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski........................................28 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh ................................................28 2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh............29 2.2.3. Bảo quản giống......................................................................................2 9 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn....................30 2.2.4.1. Đặc điểm hình thái................................................................... 30 2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy.................................................................... 31 2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa...................................................... 31 2.2.5. Lên men tạo kháng sinh......................................................................... 32 2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp ................................. 32 2.2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon.................................................. 33 2.2.5.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ...................................................... 33 2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA....33 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB.....................33 2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR...................34 2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose......................................35 2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu.....................................................................36 Chƣơng 3 - K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh tr ên chè......................37
3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn.............................................................38 3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn............................38 3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao..........................41 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân lo ại của 2 chủng XK Đ1 và R2....42 3.3.1. Đặc điểm hình thái......................................................................42 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy................................................................... .....43 3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................45 * Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon...............................................45 * Nhiệt độ sinh trƣởng t hích hợp .........................................................46 * Khả năng chịu muối...........................................................................46 * Khả năng sinh enzym ngoại bào ........................................................47 3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1..............................48 3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1....................50 3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS c ủa 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn...........52 3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp.....................................52 3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon.....................................................54 3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ..........................................................56 3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử........57 3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn...... ....57 3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR............. .....58 Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận......................................................................................... 60 4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo .....................................61 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN....................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................63
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN : Xạ khuẩn XK : Vi sinh v ật VSV : Chất kháng s inh CKS : Hệ s ợi cơ chất HSCC : Hệ s ợi khí sinh HSKS : Khuẩn ty khí sinh KTKS : Hoạt tính kháng sinh HTKS : Hoạt tính kháng nấm HTKN : Mô i trƣờng MT : Kính hiển vi quang học KHVQH KHVĐT : Kính hiển vi điện tử DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid ISP : International Streptomyc es Project TE : Tr is - Ethylendiamin t etracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat TAE : Tr is - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) PCR
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm.....37 Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu................................39 Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè.......40 Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn..................................41 Bảng 3.5. Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1.........................................44 Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2....45 Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1...................46 Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1...................................47 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm kiểm đ ịnh............................................................................... .......................... 48 Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis....50 Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi tr ƣờng lên men khác nhau...........................................................................................5 3 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1.....................................................................................55 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1.................................................................. ............................. 56
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ c ác mẫu chè bị bệnh............................. 38 Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu.................39 Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm.........................40 Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn.....................42 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2................................42 Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1...............................43 Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng...........................44 Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn.......................................47 Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định c ủa 2 chủng Đ1 và R2....49 Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS ............54 Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS .........55 Hình 3.12 : Ảnh h ƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS.............57 Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn.........................58 Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu.....59
-1- MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây bệnh thực vật. Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái. Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh. Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng s ản phẩm. Vì vậy việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững. Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của Thái Nguyên. Chúng tôi t hực hiện đề tài: “ Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên”. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
-2- 2. Mục tiêu nghiên c ứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces c ó hoạt tính kháng nấm gâ y bệnh trên c ây chè. - Nghiên c ứu một s ố đặc điểm s inh học và đặc điểm phân loại của một s ố chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứ ng dụng. 3. Đối tƣợ ng và nội dung nghiên cứu của đề tài * Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên. - Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên. * Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để s ử dụng làm VSV kiểm đ ịnh. 2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ các mẫu đất khác nhau. 3. Nghiên cứu một s ố đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một s ố chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn. 4. Nghiên cứu ảnh hưởng c ủa một s ố điều kiện nuô i c ấy đến khả năng tạo thành CKS c ủa các chủng đã lựa chọn. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
-3- Chƣơ ng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn ( Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [43]. Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trườn g, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian tro ng năm. Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh. Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện b iết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, to bramixin, vancomixin, rosamixi. Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
-4- amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [7]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn * Khuẩn lạc Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ s ợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 1 m đến 2 3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[ 22]. 0,2 Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ kh uẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ quan sát bằng mắt thường. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
-5- * Khuẩn ty Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản. Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya ) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh s ản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng. Độ dài của khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11 m/giờ [43] và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi. Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gene cần thiết từ genom và tiế n hành tổng hợp protein, cứ như vậy s ợi được hình thành và phát triển. Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên trong chứa các bào tử nang [7]. 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn được hình thành t rên c ác nhánh phâ n hóa của khuẩn ty khí s inh - gọi là cuống sinh b ào tử. Đó là c ơ quan sinh s ản đặc trưng cho xạ khuẩn. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai p hát triển dài thành dạng lông [9]. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
-6- Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu 400 A0 chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào protein với độ dày khoảng 300 tử khỏi những tác động bất lợi của đ iều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [ 13]. Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm. Trong nhiều trường hợp khi kích thích s ự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi. 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram d ương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng s inh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: 120A0, khi già có thể đạt tới 150 Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit. Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành t ế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
-7- trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [25],[30], [32], [35] [36]. Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [6], [8]. Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này. Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic (m - ADP) và glyxin. Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic. Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic, arabinose và galactose. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm s udan III và các hạt polysaccharid e bắt màu với dung dịch lugol). Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 45% [11]. Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram d ương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
-8- chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh tro ng đất và môi trường tuyển chọn [3]. Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau. 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học...nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh...Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử. 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi c ấy là một trong những t hông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho c ác chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi c ấy chúng trên môi trường dinh d ưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất đ ịnh. Tiến hành quan s át mô tả c hụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi c ấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang b ào tử, hình dạng và bề mặt bào tử. Theo Pridham v à cộng s ự [38], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh b ào tử thẳng và lượn s óng. RA cho những cuống s inh b ào tử xoắn, thô s ơ và ngắn. S cho những cuống sinh b ào tử phát triển mạnh và xoắn. Việc s ử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã biết S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
-9- xạ khuẩn r ất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyê n xảy ra s ự s ắp xếp lại trong phân tử DNA. Trong c ùng một loài c ó thể biểu hiện khác nhau về hình t hái hay những loài khác nhau c ó thể giống nhau v ề mặt hình thái. Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm c ác chỉ tiêu khác bổ sung như c ác đặc điểm s inh lý, sinh hóa, miễn d ịch học hay sinh học phân tử [45]. 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) Đặc điểm hóa phân loại được s ử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV. Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau: - Typ thành tế bào dựa trên c ơ s ở phân tích axit amin trong th ành phần peptit và đường trong thành tế bào hay c ác polys accarit gắn vào thành tế bào. - Typ peptidoglycan (PG) d ựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc c ủa mạch t etrapeptit c ủa PG c ầu nối peptit và các liê n kết giữa các mắt xích c ủa PG. - Axit mycolic là c ác phần t ử c ó mạch dài phân nhánh thuộc chi Noc ardia, Rhodococ us , Mycobacterium và c ornebacter. Đây là đặc điểm phân loại c ơ bản cho c ác chi đó. - Axit béo thường được s ử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phâ n nhánh kiểu is o và ente is o metyl hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự c ó mặt của axit 10 - metylloctade canoit (axit tuber eulostear inoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [11]. - Photpholipit c ó 5 typ photpholipit (P I, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
-10- Trong phân loại xạ khuẩn t hì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất. Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành t ế bào. 1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa Để phân loại xạ khuẩn đến loài, ngườ i ta s ử dụng hàng loạt các đặc điểm s inh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu c ầu c ác chất kích thích sinh tr ưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ t hống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan h ệ với chất kìm hãm s inh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy c ảm với chất kháng sinh, kh ả năng t ạo thành chất kháng s inh và các s ản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác c ủa xạ khuẩn. Hopwood (1975) khẳng đ ịnh rằng phần lớn c ác đặc điểm sinh lý - s inh hóa c ùng đặc điểm nuô i c ấy dễ bị biến động và c ó giá tr ị thấp về mặt phân loại. Do tính không ổn định và biến dị cao c ủa xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc s ử dụng các đặc điểm s inh lý - s inh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi [29]. 1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) Để phát hiện những loài mới tr ên c ơ s ở s ự khác nhau về đặc điểm s inh lý, sinh hóa người ta c òn s ử dụng các kết quả dựa trên phân lo ại s ố. Phương pháp này dựa trên s ự đánh giá về s ố lượng mức độ giống nhau giữa c ác VSV theo một s ố lớn c ác đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so s ánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta c ăn c ứ vào hệ s ố giống nhau (hệ s ố S - Similar ity) c ó 2 c ông thức tính hệ s ố S hay được s ử dụng. - Công thức của Sokal và Michener (SSM ) S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn