Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *************************

PHAN LÊ SƠN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT SIÊU ÂM HÚT TẾ BÀO TRỨNG BÒ ĐỂ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI- 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *************************

PHAN LÊ SƠN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT SIÊU ÂM HÚT TẾ BÀO TRỨNG BÒ ĐỂ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM

Chuyên ngành: Sinh sản và bệnh sinh sản gia súc Mã số: 62 64 01 06

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TSKH. CÙ XUÂN DẦN 2. PGS.TS. HOÀNG KIM GIAO

HÀ NỘI- 2013

LỜI CAM ĐOAN

- Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là

trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.

- Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã

được ghi nhận và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ

nguồn gốc.

Nghiên cứu sinh

Phan Lê Sơn

Lêi c¶m ¬n Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy giáo, cô giáo Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, không những đã giảng dạy và dìu dắt tôi trong suốt gần 5 năm học đại học mà còn tạo điều kiện để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Viện Chăn nuôi, cơ quan chủ quản, nơi tôi công tác, trưởng thành, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành nhiệm vụ, được học tập và hoàn thành công trình nghiên cứu của mình.

Tôi xin cảm ơn chân thành các đơn vị sau đây đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi

có thể hoàn thành luận án này. - Khoa Thú Y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Bộ môn Hóa sinh, Sinh lý động vật, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Bộ môn Sinh lý, Sinh hóa và Tập tính vật nuôi, Viện Chăn nuôi - Trạm kiểm nghiệm và Bảo tồn vật nuôi, Viện Chăn nuôi

Để hoàn thành bản luận án này tôi cũng xin gửi tới thầy giáo người hướng dẫn khoa học GS.TSKH. Cù Xuân Dần và PGS.TS. Hoàng Kim Giao lòng biết ơn sâu sắc về sự tận tình giúp đỡ, động viên, dìu dắt tôi trong cuộc sống cũng như trong suốt quá trình hoàn thành luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS. Đặng Thái Hải luôn động viên, dạy bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành được luận án này.

Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ths. Lưu Công Khánh, TS. Nguyễn Văn Lý, Ths. Nguyễn Thị Thoa, TS. Phan Văn Kiểm, TS. Đào Đức Thà, TS. Nguyễn Thạc Hòa và các bạn đồng nghiệp.

Xin cảm ơn gia đình và người thân đã động viên, tạo điều kiện cho tôi

trong suốt quá trình công tác cũng như hoàn thành bản luận án này. Hà Nội, năm 2013 Nghiên cứu sinh

Phan Lê Sơn

MỤC LỤC

Trang

I Lời cam đoan…………………………………………………………..

II Lời cảm ơn……………………………………………………………..

Mục lục………………………………………………………………... III

Danh mục các từ viết tắt………………………………………………. VI

Danh mục các bảng……………………………………………………. VII

Danh mục các hình……………………………………………………. IX

1 MỞ ĐẦU………………………………………………………………

1. Đặt vấn đề………………………………………………………….. 1

2. Mục đích nghiên cứu………………………………………………. 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài…………………………… 2

4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận…………. 3

5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC

1.1. Buồng trứng………………………………………………………. 5

1.2. Tế bào trứng………………………………………………………. 7

1.2.1. Sự hình thành tế bào mầm nguyên thủy……………………… 7

1.2.2. Sự phát triển của tế bào mầm nguyên thủy thành túi noãn…… 8

1.2.3. Sự phát triển của túi noãn thành tế bào trứng………………… 9

1.3. Nang trứng………………………………………………………... 10

1.3.1. Sự hình thành nang trứng nguyên thủy………………………. 10

1.3.2. Sự phát triển của nang trứng………………………………….. 11

1.3.3. Chức năng của nang trứng……………………………………. 14

1.3.4. Sự hình thành sóng nang……………………………………… 15

1.4. Hormone………………………………………………………….. 16

1.4.1. Cơ chế điều khiển của hormone đến sự phát triển nang trứng 16

1.4.2. Vai trò của FSH ……………………………………………… 17

1.5. Thu tế bào trứng………………………………………………….. 19

1.5.1. Thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ………………………. 19

1.5.2. Thu tế bào trứng từ bò sống………………………………….. 20

1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng số lượng, chất lượng tế

bào trứng và kết quả tạo phôi in vitro khi siêu âm hút tế bào trứng….. 23

1.6. Nuôi tế bào trứng in vitro………………………………………… 32

1.6.1. Nuôi thành thục tế bào trứng in vitro………………………… 32

1.6.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi thành thục tế bào

trứng…………………………………………………………………… 35

1.7. Tạo phôi in vitro………………………………………………….. 43

1.7.1. Thụ tinh in vitro……………………………………………… 43

1.7.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh của tế bào 46

trứng……………………………………………………………………

1.8. Nuôi phôi in vitro…………………………………………………. 48

1.8.1. Môi trường nuôi phôi……………………………………… 48

1.8.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của phôi……….. 50

1.9. Ảnh hưởng của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng đến kết quả

nuôi thành thục, thụ tinh và tạo phôi in vitro…………………………. 53

56 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…

2.1.Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu…………………… 56

2.1.1.Vật liệu……………………………………………………….. 56

2.1.2. Nội dung nghiên cứu………………………………………… 56

2.1.3.Phương pháp nghiên cứu…………………………………….. 56

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………….. 64

66 CHƯƠNG 3. KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………..

3.1. Ảnh hưởng của áp lực hút …………………………………........... 66

3.2. Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng ……………….. 76

3.3. Ảnh hưởng của kích thước nang trứng ………………………….. 84

3.4. Ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội.. 91

3.5. Ảnh hưởng của liều lượng FSH ………………………………….. 96

3.6. Ảnh hưởng của giống bò…………………………………………. 104

3.7. Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng…………………………. 109

3.8. Ảnh hưởng của mùa vụ…………………………………………… 113

120 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ………………………………………….

122

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN……………………………………………………………………..

123 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………

123 TIẾNG VIỆT…………………………………………………………

124 TIẾNG ANH………………………………………………………….

148 PHỤ LỤC……………………………………………………………..

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

: Bovine Serum Albumin BSA

: Holstein Friesian x Lai Sind F3

: Foetal Calf serum FCS

: Follicle Stimulating Hormone FSH

GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone

HEPES : N-(2 Hydroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethanesulforic acid)

: Holstein Friesian HF

: Luteinizing Hormone LH

: Minimum Essential Medium MEM

: Prostaglandin F2α PGF2α

SOF : Synthetic oviduct fluid

TCM-199 : Tisue culture medium 199

DANH MỤC BẢNG

Tên bảng Bảng Trang

1.1 Đặc điểm phát triển của nang trứng bò ở giai đoạn đầu 14

1.2 Số lượng tế bào trứng và tỉ lệ phôi nang thu được ở các

giống bò khác nhau 29

1.3 Số lượng tế bào trứng và phôi nang thu được của bò ở các

độ tuổi khác nhau 31

37 1.4 Đánh giá chất lượng tế bào trứng ở 6 mức độ khác nhau

1.5 Mối quan hệ giữa đặc điểm tế bào chất và chất lượng tế bào

trứng 40

3.1 Số lượng nang trứng được hút và ảnh hưởng của áp lực hút

đến số lượng tế bào trứng thu được 66

3.2 Ảnh hưởng của áp lực hút đến chất lượng tế bào trứng 69

3.3 Ảnh hưởng của áp lực hút đến sự phân chia của hợp tử,

phôi dâu và phôi nang 72

3.4 Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến số

lượng nang trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu

được 76

3.5 Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến chất

lượng tế bào trứng 79

3.6 Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến sự

phân chia của hợp tử, phôi dâu và phôi nang 80

3.7 Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến số lượng nang

trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được 85

3.8 Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến chất lượng tế

bào trứng 86

3.9 Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến sự phân chia của 88

hợp tử, phôi dâu và phôi nang

3.10 Ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng

trội đến số lượng nang trứng được hút và số lượng tế bào

trứng thu được 91

3.11 Ảnh hưởng pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội

đến chất lượng tế bào trứng 93

3.12 Ảnh hưởng của các liều lượng FSH đến số lượng nang

trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được 96

3.13 Ảnh hưởng của liều lượng FSH đến chất lượng tế bào trứng 98

3.14 Ảnh hưởng của liều lượng FSH đến sự phân chia của hợp

tử, phôi dâu và phôi nang 100

3.15 Ảnh hưởng của giống bò cho tế bào trứng đến số lượng

nang trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được 105

3.16 Ảnh hưởng của giống bò cho tế bào trứng đến chất lượng tế

bào trứng 105

3.17 Ảnh hưởng của giống bò cho tế bào trứng đến sự phân chia

của hợp tử, phôi dâu và phôi nang 106

3.18 Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến số lượng nang

trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được 109

3.19 Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến chất lượng tế

bào trứng 110

3.20 Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến sự phân chia

của hợp tử, phôi dâu và phôi nang 111

3.21 Ảnh hưởng của mùa vụ đến số lượng nang trứng được hút

và số lượng tế bào trứng thu được 114

3.22 Ảnh hưởng của mùa vụ đến chất lượng tế bào trứng 115

3.23 Ảnh hưởng của mùa vụ đến sự phân chia của hợp tử, phôi

dâu và phôi nang 115

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Tên hình Trang Hình

1.1 Cấu tạo của buồng trứng 7

1.2 Sơ đồ tóm tắt quá trình phát triển nang trứng 11

1.3 Phương pháp thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ 20

1.4 Hệ thống siêu âm hút tế bào trứng 21

1.5 Các hình ảnh thu được khi đầu dò siêu âm ở các vị trí khác

nhau trên buồng trứng 22

1.6 Khả năng thao tác và quan sát buồng trứng của 2 loại đầu dò 24

1.7 Phân chia chất lượng hợp tử 51

1.8 Hợp tử 52

3.1 Tế bào trứng có chất lượng A, B, C và D 70

3.2 Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 4 mức

độ áp suất khác nhau 73

3.3 Phương pháp cố định buồng trứng bằng bốn ngón tay 75

3.4 Phương pháp cố định buồng trứng bằng ngón tay trỏ và ngón

tay cái 75

3.5 Nang trứng quan sát được ở tần suất 2 tuần, 1 tuần và ½

tuần/lần 77

3.6 Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở ba tần

suất khác nhau 83

3.7 Đếm và đo kích thước của các nang trứng 85

3.8 Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 3 mức

độ kích thước khác nhau 90

3.9 Buồng trứng ở pha nang trội 92

3.10 Tế bào trứng trước và sau khi nuôi 93

3.11 Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở hai pha

sóng nang 95

3.12 Một số phôi dâu và phôi nang thu được có chất lượng khác

nhau 101

3.13 Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 6 liều

lượng FSH khác nhau 104

3.14 Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở hai

giống bò cho tế bào trứng khác nhau 108

3.15 Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở bò 3 tuổi

và bò 6 tuổi 112

3.16 Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở vụ đông

– xuân và vụ hè - thu 117

3.17 Ảnh hưởng của stress nhiệt lên chất lượng tế bào trứng 119

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Tạo ra đàn bò sữa có năng suất cao, chất lượng sữa tốt, thích nghi với

điều kiện khí hậu nước ta, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ sữa trong nước và giảm

lượng sữa nhập khẩu đang là nhu cầu cấp thiết. Do vậy, công nghệ cấy truyền

phôi đang được các nhà khoa học nước ta quan tâm nghiên cứu để nâng cao

được cường độ chọn lọc, đẩy nhanh được tiến độ di truyền, khai thác được tối

đa tiềm năng sinh sản của bò cái có giá trị di truyền cao (theo Erickson,

1966a) buồng trứng bò trưởng thành có khoảng 70.000 nang trứng nguyên

thủy có thể phát triển, thụ tinh và tạo phôi trong ống nghiệm), rút ngắn được

khoảng cách thế hệ, tăng khả năng thích nghi của đời con sinh ra. Năm 1986,

con bê đầu tiên ở nước ta đã ra đời từ công nghệ cấy truyền phôi. Tiếp theo sự

thành công đó, bê thụ tinh trong ống nghiệm, cắt phôi, xác định giới tính cũng

lần lượt được sinh ra. Song khả năng ứng dụng rộng rãi vào thực tế sản xuất

vẫn còn nhiều hạn chế. Có rất nhiều nguyên nhân, nhưng một trong những

nguyên nhân chính là do giá thành phôi in vivo còn cao, do sử dụng hormone

ngoại nhập để gây rụng trứng nhiều. Phôi in vitro có giá thành thấp, song chất

lượng chưa cao, do sử dụng tế bào trứng được thu từ buồng trứng lò mổ để

tạo phôi trong ống nghiệm. Vì vậy muốn giải quyết được điều đó chúng ta cần

làm chủ được nguồn cung cấp tế bào trứng có chất lượng tốt để tạo phôi trong

ống nghiệm. Năm 2005, kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống để tạo

phôi trong ống nghiệm bắt đầu được nghiên cứu tại Viện Chăn nuôi, mở ra

một bước ngoặt và triển vọng mới trong việc ứng dụng công nghệ cấy truyền

phôi vào thực tế sản xuất. Kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống cho

phép thu được rất nhiều tế bào trứng từ bê, bò có độ tuổi khác nhau, bò cạn

sữa, bò đang vắt sữa, bò chậm sinh và thậm chí bò đang mang thai tháng thứ 3

thứ 4, với tần suất lên đến 2 lần/tuần và thậm chí 2 - 3 ngày một lần (Galli và

cs., 2003). Do vậy số phôi thu được lên đến 200 phôi/bò/năm và 100 bê sinh

được sinh ra khi số phôi này được cấy chuyển cho bò nhận phôi (Merton và

cs., 2003), cao hơn nhiều so với kỹ thuật gây rụng trứng nhiều (50

phôi/bò/năm, số bê sinh ra khi cấy là 30 bê). Ngoài các tiềm năng đó kỹ thuật

siêu âm hút tế bào trứng thành công cũng góp phần nâng cao hiệu quả và khả

năng ứng dụng của các công nghệ như: cloning, chuyển gen, vi tiêm, bảo tồn

nguồn gen dưới dạng tế bào trứng,…

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến số lượng nang trứng được hút, số

lượng, chất lượng tế bào trứng, phôi dâu và phôi nang thu được khi tiến hành

siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm như: Giống, tuổi,

mùa vụ, tần suất hút, các giai đoạn phát triển của đợt sóng nang, áp lực hút,

kích thước nang trứng và rất nhiều yếu tố khác. Chính vì lẽ đó chúng tôi tiến

hành nghiên cứu đề tài "Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả

của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm"

2. Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá được sự ảnh hưởng các yếu tố đến hiệu quả của kỹ thuật

siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm.

- Xác định được các yếu tố phù hợp, tăng số lượng nang trứng được

hút, số lượng tế bào trứng thu được, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang

thu được.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Đây là một kỹ thuật mới, lần đầu tiên được nghiên cứu và ứng dụng ở

nước ta vào năm 2005. Là kỹ thuật có giá trị kinh tế cao, mở ra một triển vọng

mới trong việc sản xuất và thương mại hóa phôi trong ống nghiệm.

- Nâng cao được chất lượng, số lượng tế bào trứng, từ đó tăng số lượng,

chất lượng phôi dâu và phôi nang. Hạ được giá thành của phôi, tăng khả năng

ứng dụng vào thực tế sản xuất ở nước ta.

- Cho phép thu tế bào trứng liên tục 2 lần/tuần ở bê, bò trưởng thành,

bò chậm sinh và thậm chí bò mang thai trong 3 tháng đầu mà không cần sử

dụng hormone để kích thích.

- Siêu âm hút tế bào trứng không làm ảnh hưởng đến quá trình tiết sữa.

Bò cho tế bào trứng sẽ động dục và sinh sản bình thường sau khi ngừng siêu

âm hút tế bào trứng 7 – 10 ngày.

- Cho phép tạo ra nhiều phôi và bê trên một cá thể bò mẹ có giá trị di

truyền cao.

- Cung cấp tế bào trứng có chất lượng cho các nghiên cứu cơ bản như:

Đông lạnh tế bào trứng, xác định giới tính, cloning, chuyển gen, bảo tồn quỹ

gen dưới dạng tế bào trứng.

- Chủ động được thời gian và số lượng tế bào trứng.

4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận

- Cơ sở khoa học, phương pháp và kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng là

tài liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu, giảng dạy và học tập.

- Ứng dụng kỹ thuật siêu âm cho phép mở ra một hướng mới trong việc

nghiên cứu quá trình sinh sản, tình trạng sinh sản của bò thông qua việc đánh

giá cấu trúc và hoạt động của buồng trứng. Chẩn đoán bệnh của cơ quan sinh

dục, giới tính thai, điều khiển chu kỳ động dục, đánh giá tình trạng sinh sản

của đàn, điều trị bênh u nang buồng trứng, kiểm tra năng suất bò đực giống từ

những con bê được sinh ra/cùng một cặp bố mẹ.

- Siêu âm hút tế bào trứng có thể thực hiện 2 tuần/lần mà không làm

ảnh hưởng đến chức năng của buồng trứng, sự phát triển của các nang trứng,

số lượng, chất lượng, khả năng thành thục, khả năng thụ tinh, hợp tử phân

chia, khả năng phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang ở bò HF và bò

lai HF được chăm sóc và nuôi dưỡng ở điều kiện nước ta.

- Các tế bào trứng thu được từ nang trứng kích thước 2 mm trở lên có

chất lượng tốt đều có thể thành thục, thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi

dâu và phôi nang.

- Bò cho tế bào trứng sẽ động dục sau khi ngừng siêu âm hút tế bào

trứng từ 8 - 10 ngày.

- Sau khi siêu âm hút tất cả các nang trứng có kích thước từ 2 mm trở

lên, trong khoảng thời gian 2 ngày một đợt nang trứng có kích thước từ 2 mm

trở lên lại xuất hiện.

- Sử dụng FSH để kích thích trước khi siêu âm hút tế bào trứng làm

tăng số lượng các nang trứng có kích thước từ 2 mm trở lên, làm tăng chất

lượng tế bào trứng do FSH tăng cường sự phát triển các tế bào hạt và tăng

cường sự chuyển hóa của các nang trứng ở các giai đoạn khác nhau.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Buồng trứng

Buồng trứng bò được hình thành khi các gò tuyến sinh dục phát triển

do có sự dày lên của khoang biểu mô ở mặt giữa của trung thận (Dyce và cs.,

1966) và tạo sự liên kết với các mô trung thận bởi rất nhiều tế bào được gọi là

màng sợi giới tính nguyên thủy (Byskov và Hoyer, 1994). Ở gò tuyến sinh

dục, túi noãn hoàng được bao quanh bởi các sợi tế bào mầm (ovigerous) và

được hình thành do có sự bao bọc xung quanh bởi các sợi tế bào mầm, tạo nên

một tổ hợp bao gồm tế bào biểu mô, túi noãn. Các tế bào biểu mô hay các tế

bào soma là các tế bào có nguồn gốc từ khoang biểu mô, có hình lập phương

hay nhân tế bào hình cầu và là tiền thân của các tế bào nang trứng (Hirshfield

và Desanti, 1995). Trung mô hay tế bào cơ chất là tế bào có nguồn gốc từ sự

phân tầng phần mặt ngoài trung thận, nhân kéo dài ra và có sự xuất hiện của

các nguyên bào sợi và làm cho các tế bào mô vỏ (theca cells) tăng lên. Ở phần

cơ sở, các sợi tế bào mầm được liên kết với nhau bởi mô trung thận và ở bề

mặt chúng được liên kết với biểu mô sinh dục. Ở bò gò tuyến sinh dục được

biến đổi thành buồng trứng ở ngày thứ 40 của bào thai. Với sự phân rã của

các sợi tế bào nguyên thủy, buồng trứng phân ra thành phần vỏ và phần tủy

(Erickson, 1966a).

Buồng trứng bò là cơ quan sinh sản của gia súc cái, sản sinh ra tế bào

trứng và các hormone sinh sản của gia súc cái (oestrogen và progestins).

Trong tự nhiên, số lượng tế bào trứng rụng, thụ thai và số con được sinh ra

khác nhau giữa các loài, như: trâu, bò, ngựa,…mỗi chu kỳ động dục chỉ rụng

một tế bào trứng, cá biệt có hai tế bào. Song dê, lợn,…mỗi chu kỳ động dục

lại rụng nhiều tế bào trứng, số lượng tế bào trứng rụng ở lợn lên tới 25 tế bào.

Buồng trứng bò được cấu tạo bao gồm miền tủy bên trong và miền vỏ

bên ngoài, hai miền đó được cấu tạo bằng lớp mô liên kết sợi xốp. Miền tủy

có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các

lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng, xảy ra quá trình trứng chín, rụng

trứng và tạo ra các hormone (Hình 1.1). Trong cơ thể, buồng trứng được treo

ở cạnh trước dây chằng rộng, nằm trong xoang chậu. Ở bò chúng ta có thể xác

định được bằng tay khi khám qua trực tràng. Buồng trứng thường có hình

ovan dẹt, song hình dáng và kích thước của buồng trứng sẽ bị thay đổi và biến

dạng do sự phát triển của nang trứng và sự tồn tại của thể vàng . Kích thước

của buồng trứng to hay nhỏ phụ thuộc rất nhiều vào giống, tuổi của bò. Kích

thước bình quân của buồng trứng ở bò Lai Sind là 23,45 x 16,50 x 11,55 mm

và ở bò sữa 35 x 25 x 15 mm (Bearden và Fuquay, 2000) và 4 x 2 x 1,5 cm

(Dyce và cs., 1987). Buồng trứng được xem như một tuyến nội tiết của con

cái, làm nhiệm vụ nuôi dưỡng cho trứng chín, tiết ra các hormone sinh dục,

tác động đến chức năng của tử cung và làm thay đổi tính biệt giữa con đực và

con cái.

Khi buồng trứng có các nang trứng thành thục, các tế bào hạt trong biểu

mô nang trứng tiết ra nhiều oestrogen, oestrogen có chức năng tới đặc tính

sinh dục thứ cấp của gia súc cái làm âm đạo tiết ra nhiều dịch nhầy, âm hộ

xung huyết đỏ, sừng tử cung và ống dẫn trứng dinh dưỡng được tăng cường,

tuyến vú phát triển, vỏ não hưng phấn con vật xuất hiện động dục. Đồng thời

tiết ra hormone progesterone từ thể vàng đi vào máu sau khi rụng trứng, có

tác dụng kích thích niêm mạc tử cung, tăng cường dinh dưỡng, màng nhầy

phát triển để trứng được thụ tinh về nơi làm tổ, đồng thời còn tác dụng tới tế

bào biểu mô màng nhầy tử cung tiết ra nhiều glycogen và các chất dinh dưỡng

nuôi phôi, giúp phôi bám chặt vào thành tử cung và phát triển. Progesterone

còn ức chế nang trứng chín trên buồng trứng, thông qua sự ức chế của FSH ức

chế cơ trơn tử cung làm giảm co bóp, giảm hormone thùy sau tuyến yên làm

cho tử cung yên tĩnh trong thời gian mang thai. Ngoài ra progesterone còn

kích thích tuyến vú phát triển. Lớp ngoài cùng của miền vỏ buồng trứng là

biểu mô bề mặt. Ngay bên dưới biểu mổ bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các

mô liên kết, phía dưới lớp mô dày đặc là nhu mô có chứa nang trứng và các tế

bào phân tiết hormone buồng trứng. Sự hình thành của chức năng buồng trứng

phụ thuộc vào: Giai đoạn đầu của phân bào giảm nhiễm, quá trình hình thành

nang trứng và sự khác nhau của các tế bào sản sinh steroid.

Nang trứng nguyên thủy

Nang trứng sắp rụng

Nang trứng rụng

Tế bào trứng

Nang trứng Đang phát triển (Tertiary)

Nang trứng thứ cấp

Thể huyết

Nang trứng thoái hóa

Thể vàng

Thể bạch

Hình 1.1. Cấu tạo của buồng trứng (Nguồn: Bearden và Fuquay, 2000)

1.2. Tế bào trứng

1.2.1. Sự hình thành tế bào mầm nguyên thủy

Nguồn gốc của tế bào trứng là tế bào mầm nguyên thủy. Tế bào mầm

nguyên thủy được hình thành từ nội bì của túi noãn hoàng ở thời kỳ phôi thai

(Byskov và Hoyer, 1994; Senger, 1997). Tế bào mầm nguyên thủy di chuyển

theo kiểu amip từ biểu mô của túi noãn hoàng theo đường mặt lưng màng treo

ruột của đoạn cuối ruột phôi và di chuyển đến các gò tuyến sinh dục (Senger,

1997) khi bào thai được 35 - 36 ngày tuổi ở bò (Erickson, 1966b). Các gò

tuyến sinh dục là túi sinh dục chưa được phân hóa và được hình thành ở ngày

thứ 32 của bào thai bò (Erickson, 1966b). Các yếu tố giúp cho tế bào mầm

nguyên thủy di chuyển được đến gò tuyến sinh dục vẫn chưa được hiểu rõ

ràng. Tuy nhiên khi nghiên cứu in vivo (French-Constant và cs., 1991) và

nghiên cứu in vitro (Alvarez và Merchan, 1986) đều thấy có sự tham gia của

fibronectin, fibronectin có mặt trên đường đi từ biểu mô của túi noãn hoàng

đến gò tuyến sinh để tạo nên sự di chuyển của tế bào mầm nguyên thủy

(French-Constant và cs., 1991). Nghiên cứu in vitro trên chuột cho thấy rằng

yếu tố sinh trưởng biến đổi β1 (Transforming growth factor β1) được tạo ra

bởi tuyến sinh dục liên quan đến dãy hóa chất (Godin và Wylie, 1991), ảnh

hưởng đến tế bào mầm nguyên thủy làm cho chúng di chuyển theo một

phương hướng nhất định. Cũng nghiên cứu trên chuột (De Felici và Pesce,

1994) thấy rằng bộ giao tử (Kit Gland) cần thiết cho sự sống sót và sự phát

triển của tế bào mầm nguyên thủy khi di chuyển (Kit Ligand cũng được gọi là

yếu tố tế bào mầm hay yếu tố tế bào lớn). Kit Ligand kích thích lên mô xôma

của phôi chuột dọc theo đường di chuyển của tế bào mầm và ở các gò tuyến

sinh dục. Ảnh hưởng qua lại giữa tế bào mầm nguyên thủy và Kit Ligand thúc

đẩy sự di chuyển của tế bào mầm nguyên thủy và tăng nhanh sự phát triển của

tế bào mầm nguyên thủy thông qua quá trình ngăn chặn tế bào chết theo

chương trình (De Felici và Pesce, 1994).

1.2.2. Sự phát triển của tế bào mầm nguyên thủy thành túi noãn

Các tế bào mầm nguyên thủy trải qua một sự giới hạn về số lượng của

các quá trình phân chia nguyên nhiễm khi đang di chuyển cũng như khi đến

gò tuyến sinh dục (Russe, 1983; Smitz và Cortvrindt, 2002). Quá trình phân

chia nguyên nhiễm xảy ra ở gò tuyến sinh dục thường xuyên hơn so với khi

chúng đang trên đường di chuyển đến gò tuyến sinh dục. Ở bò có sự tăng lên

đột ngột về số lượng phân chia nguyên nhiễm ở mỗi buồng trứng bắt đầu ở

ngày thứ 60 của bào thai (304 lần gián phân/ngày so với 13 lần/ngày ở ngày

thứ 50) (Erickson, 1966b). Ở thời kỳ này cường độ phân chia nguyên nhiễm

rất mạnh. Khi tế bào mầm nguyên thủy ngừng di chuyển và cố định vào gò

tuyến sinh dục để phân chia thì chúng được gọi là túi noãn (Russe, 1983;

Smitz và Cortvrindt, 2002). Có thể được phân biệt túi noãn với tế bào mầm

nguyên thủy dựa vào mức độ tế bào, do túi noãn có nhiều cơ quan tế bào, đặc

biệt là màng lưới nội chất và các ống có chứa các ty lạp thể. Các ty lạp thể có

chứa ATP và các enzim liên quan đến các hoạt động của tế bào (Russe, 1983).

Các tế bào mầm di chuyển đến gò tuyến sinh dục trong một khoảng

thời gian nhất định, do vậy chúng được tìm thấy ở các chu kỳ nguyên nhiễm

khác nhau trong các nhóm tế bào mầm phân chia. Trong quá trình buồng

trứng phát triển các tế bào mầm nguyên thủy di chuyển trước sẽ trưởng thành

sớm hơn, các tế bào mầm nguyên thủy di chuyển đến muộn và nằm ở phần

sâu của tuyến sinh dục phát triển. Phần ngoại vi của tế bào mầm nguyên thủy

hoạt động như các tế bào gốc để tạo ra các túi noãn mới (Russe, 1983).

1.2.3. Sự phát triển của túi noãn thành tế bào trứng

Quá trình phân chia nguyên phân của túi noãn dừng lại vào khoảng

ngày thứ 150 của bào thai, ấn định số lượng tế bào mầm của bò cái. Số lượng

tế bào mầm giữa 2 buồng trứng phải và trái chỉ có sự khác nhau khoảng 10 %.

(Erickson, 1966b).

Ở bò, sự phân bào giảm nhiễm của túi noãn bắt đầu sau khi bào thai

được 75 - 80 ngày tuổi, các tế bào mầm của túi noãn tăng lên sau khi bắt đầu

quá trình phân bào giảm nhiễm và được xem như tế bào trứng sơ cấp (Byskov

và Hoyer, 1994). Sự phân bào giảm nhiễm của tế bào trứng sơ cấp không tiếp

tục vượt quá giai đoạn sợi dày của tiền kỳ phân bào I (Erickson, 1965). Ở giai

đoạn sợi dày của tiền kỳ phân bào I, các nhiễm sắc thể tập hợp lại, được gói

vào trong nhân tế bào trứng và được gọi là túi mầm. Các tế bào trứng tương

đối sáng và dễ nhận biết vì có sự tăng lên về kích thước tế bào do tăng lên của

tế bào chất và sự phồng lên của nhân (Russe, 1983).

1.3. Nang trứng

1.3.1. Sự hình thành nang trứng nguyên thủy

Sự hình thành nang trứng nguyên thủy được bắt đầu khi một lớp màng

bao gồm các tế bào biểu mô dẹt tập hợp lại xung quanh tế bào trứng và bao

bọc các tế bào trứng lại thành nang trứng nguyên thủy. Các tế bào trứng và

các tế bào nang trứng phụ thuộc lẫn nhau. Tế bào trứng cần phải có các tế bào

hạt để phát triển và sống sót (Picton, 2001). Ở giai đoạn này có sự xuất hiện

các tế bào theca, sự có mặt của tế bào theca có thể là sự bắt đầu cho quá trình

phát triển của nang trứng. Các tế bào theca có mặt trong nang trứng nguyên

thủy và nang trứng sơ cấp ở thỏ (Hirshfield, 1991). Do vậy có thể sự tương tác

giữa các tế bào hạt và tế bào theca có thể đóng vai trò điều chỉnh sự phát triển

và biệt hóa các nang trứng ở tất cả các giai đoạn hình thành nang.

Khi bào thai được khoảng 18 - 22 tuần, lớp vỏ của buồng trứng có số

lượng nang trứng nguyên thủy cao nhất, bình quân khoảng 300.000 nang

trứng nguyên thủy, song phụ thuộc vào từng cá thể khác nhau mà số lượng

nang trứng nguyên thủy biến động từ 25.000 đến 2,5 triệu. Nang trứng

nguyên thủy chứa tế bào trứng chưa trưởng thành và được bao quanh bởi tế

bào hạt dẹt. Nhưng số lượng nang trứng này giảm dần trước khi sinh và đến

tuổi thành thục về tính chỉ còn khoảng 180.000, biến động 25.000 đến 1,5

triệu nang trứng nguyên thủy do túi noãn trải qua giai đoạn tiền kỳ giảm

nhiễm làm túi noãn bị tổn thương dẫn đến thoái hóa và nhiều túi noãn bị mất

đi trong quá trình này (Russe, 1983). Các tế bào trứng không bị thoái hóa

được một lớp màng đơn của các tế bào biểu mô dẹt tập hợp lại xung quanh và

bao quanh chúng tạo thành nang trứng nguyên thủy. Ở bò cái sau khi sinh có

khoảng 133.000 nang trứng nguyên thủy và các nang trứng này từ từ phát

triển thành thục (rụng trứng và thoái hóa cho đến hết khi bò khoảng 15 - 20

tuổi (Erickson, 1966b).

1.3.2. Sự phát triển của nang trứng

Từ nang trứng nguyên thủy, sự phát triển của nang rứng trải qua quá

trình hồi phục, phát triển sau một giai đoạn dài yên lặng. Bao gồm thay đổi

của các chuỗi tế bào, sự thay đổi các thành phần khác nhau của nang trứng,

đảm bảo cho sự phát triển của các nang trứng đến khi rụng trứng và giải

phóng một hay nhiều tế bào trứng trưởng thành ở khoảng cách được ấn định

từ đầu đến khi kết thúc vòng đời sinh sản của con cái. Từ nang trứng nguyên

thủy để đạt đến kích thước rụng trứng trải qua 3 giai đoạn: Sơ cấp, thứ cấp và

nang trứng ở giai đoạn phát triển (Hình 1.2).

Nang trứng đã hình thành xoang

Nang trứng thứ cấp

Nang trứng sắp rụng

Rụng trứng

Nang trứng sơ cấp

Nang trứng nguyên thủy

Tế bào trứng Tách nhau ra

Xoang

Màng tế bào Theca

Ổ trứng

Vành phóng xạ

Thể vàng

Các tế bào cumulus

Tế bào trứng

Các tế bào hạt hình trụ

Các tế bào hạt dẹt

Tế bào trứng

Tiền tế bào hạt

Các tế bào thể vàng

Hình 1.2. Sơ đồ tóm tắt quá trình phát triển nang trứng

(Nguồn: Hernandez-Ochoa và cs., 2009)

Sự phát triển của nang trứng bắt đầu ngay sau khi nang trứng nguyên

thủy hoạt hóa và sự biệt hóa của tiền các tế bào hạt thành tế bào hạt. Sự phát

triển đầu tiên của tế bào trứng được thể hiện thông qua sự phát triển của vùng

Golgi, do các nang bao quanh tế bào và sự lan rộng dần của Golgi về phía

ngoại vi. Sự phát triển của nang trứng được tạo thành do số lượng lớp màng tế

bào hạt tăng lên xung quanh tế bào trứng cùng với sự tăng lên về kích thước

tế bào trứng và hình thành vòng trong suốt. Sự tích tụ của vùng Golgi trong tế

bào trứng cho thấy có sự tham gia của tế bào trứng cho sự hình thành vòng

trong suốt. Trong quá trình hình thành vòng trong suốt, sự bao quanh của các

tế bào hạt làm chúng liên kết lại với nhau bởi các tiểu thể nối gian bào. Các tế

bào hạt được gọi là tế bào vành phóng xạ. Cùng với độ dày của màng vòng

trong suốt tăng lên các tế bào vành phóng xạ cần phát triển để liên kết tế bào

trứng và vòng trong suốt lại với nhau (Russe, 1983; Adashi, 1996). Mạng lưới

mao mạch bên ngoài nang trứng là cơ sở để màng tăng lên trong quá trình

nang trứng phát triển. Các mao mạch xuất hiện trong giai đoạn nang trứng

nguyên thủy và một số tĩnh mạch xuất hiện khi nang trứng phát triển đến giai

đoạn thứ cấp (Tanaca và cs., 2001). Trong giai đoạn nang trứng nguyên thủy

các mao mạch được phát hiện xung quanh nang trứng cùng với sự liên kết

đồng tâm và sự biệt hóa của tế bào cơ chất thành tế bào mô vỏ (theca) bên

trong. Sự phát triển của nang trứng cho đến giai đoạn này thì được xem như

nang trứng nang trứng thứ cấp (preantral). Nang trứng tiếp tục phát triển, các

túi dịch của dịch nang trứng xuất hiện trong màng tế bào hạt. Khi 5 - 8 lớp

màng tế bào hạt được hình thành, các túi dịch vỡ ra hình thành một xoang và

sau đó nang trứng phát triển, được gọi là nang trứng phát triển (nang antral

hay nang Graff), bao gồm các nang trứng từ giai đoạn thứ cấp đến nang trứng

trước khi rụng trứng (Lundy và cs., 1999). Toàn bộ quá trình phát triển

của nang trứng từ giai đoạn tế bào trứng nguyên thủy (kích thước 50 -

60 µm) đến giai đoạn rụng trứng (kích thước 10 - 15 mm) mất khoảng 180

ngày (Lussier và cs., 1987). Thời gian từ khi nang trứng nguyên thủy hoạt hóa

để đạt được kích thước rụng trứng mất 80 đến 100 ngày, do vậy nang trứng

thứ cấp cuối cùng sẽ mất hai chu kỳ động dục để đạt được kích thước rụng

trứng (Lussier và cs., 1987). Khoảng thời gian này cho phép hình thành vòng

trong suốt (vòng trong suốt là glycoprotein bao bọc xung quanh màng tế bào

trứng, bắt đầu xuất hiện ở thời kỳ tế bào trứng nguyên thủy, rất quan trọng

cho sự sống của tế bào trứng, sự tích lũy các sản phẩm cần thiết cho quá trình

thụ tinh, quá trình thụ tinh và phôi phát triển giai đoạn đầu).

Nang trứng ở giai đoạn nang trứng phát triển phát triển và hình thành

các xoang trong nang trứng. Các xoang chứa đầy dịch nang trứng. Các xoang

bắt đầu xuất hiện trong nang trứng bò có kích thước 0,12 và 0,28 mm (Lussier

và cs., 1987; Monniaux và cs., 1997). Các xoang bắt đầu xuất hiện trong bào

thai bê khoảng 230 ngày tuổi (Russe, 1983). Nang trứng ở giai đoạn phát triển

có mạng lưới lỗ hổng rộng rãi cho phép vận chuyển dinh dưỡng và điều chỉnh

thông tin giữa tế bào trứng và các tế bào hạt (Espey, 1994). Các tế bào hạt có

được cơ quan thụ cảm LH khi nang trứng có kích thước 8 - 9 mm (Ireland và

Roche, 1983). Một khoảng trống riêng biệt được tạo thành giữa tế bào trứng

và màng trong suốt ngay trước khi rụng trứng. Máu cung cấp của màng theca

thay đổi đột ngột trong giai đoạn cuối của nang trứng trưởng thành và phát

triển thành hệ thống mạch máu bên trong tế bào theca và một hệ thống mạch

máu bên ngoài có nguồn gốc từ mao mạch mô đệm (Yamada và cs., 1995).

Nang trứng tiếp tục được huy động cho đến khi kho dự trữ bị cạn kiệt.

Số lượng nang trứng ở bò được phân chia tương đối đều giữa hai buồng trứng.

Nang trứng bò phát triển gấp 300 - 400 về kích thước, từ giai đoạn tế bào

trứng sơ cấp (kích thước 50 µm) đến trước giai đoạn rụng trứng (kích thước

15- 20 mm) (Rajakoski, 1960).

Các nang trứng ở các giai đoạn khác nhau có cấu tạo, kích thước khác

nhau. Nghiên cứu về các giai đoạn phát triển của nang trứng (Braw-Tal và

Yossefi, 1997) ở bò cho thấy có sự khác nhau (Bảng 1.1).

Nang trứng

Lớp tế bào hạt

Kích thước nang trứng (µm)

Kích thước tế bào trứng (µm)

Số lượng tế bào hạt (dao động)

Sự xuất hiện của vòng trong suốt

1

< 40

29,7 ± 0,3

-

Nguyên thủy

Sơ cấp

1- 1,5

40 – 80

31,1± 0,4

-

< 10 (hình dẹt) 10 - 40 (hình khối)

2 – 3

41 – 100

81 – 130

49,5 ± 2,4

-

4 – 6

101 – 250

131 – 250

68,6 ± 2,8

+

> 6

> 250

250 – 500

92,9 ± 4,5

++

Nang sơ cấp nhỏ Nang sơ cấp lớn Nang Graff nhỏ

Bảng 1.1. Đặc điểm phát triển của nang trứng bò ở giai đoạn đầu

Nguồn: Braw-Tal và Yossefi (1997).

1.3.3. Chức năng của nang trứng

Nang trứng là một khối thống nhất chặt chẽ, có nhiều loại tế bào riêng

biệt. Nang trứng bao gồm một số lớp tế bào xôma bao quanh, bên trong chứa

đầy dịch, trong dịch có chứa tế bào trứng. Dịch trong xoang của nang trứng

được gọi là dịch nang trứng. Nang trứng cung cấp tiểu môi trường để tế bào

trứng phát triển từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn tiền rụng trứng và

chịu trách nhiệm sản suất ra các hormone (Gordon, 1994). Lớp vỏ của nang

trứng tiền rụng trứng bao gồm màng tế bào hạt, tế bào theca interna và tế bào

theca externa. Các tế bào hạt là các tế bào có nguồn gốc từ các tế bào biểu

mô, rất cần thiết cho quá trình phát triển và sự sống sót của tế bào trứng. Các

tế bào hạt không phải là các mô đồng nhất mà là các tập hợp con đặc biệt bao

gồm vành phóng xạ, tế bào cumulus và các tế bào hạt của nang phát triển. Tế

bào cumulus là tập hợp con của tế bào hạt bao bọc xung quanh tế bào trứng.

Các tế bào cumulus có mối liên kết chặt chẽ với tế bào trứng và được biết đến

như vành phóng xạ. Chúng liên kết chặt chẽ với các tế bào trứng qua khe liên

kết của tế bào chất qua vòng trong suốt (zona pellucida). Vành phóng xạ liên

kết tế bào trứng với các tế bào cumulus khác qua chỗ nối các khe hở vì thế tạo

nên dòng điện hợp bào sinh học (De loos và cs., 1991). Các tế bào cumulus

nuôi dưỡng tế bào trứng và tham gia hình thành vòng trong suốt (Buccione và

cs., 1990). Ngoài ra các tế bào cumulus cũng tham gia vào sự điều chế hay tạo

ra chất ức chế sự phát triển của tế bào trứng (Eppig và Downs, 1984).

1.3.4. Sự hình thành sóng nang

Ở bò và một số loài động vật có vú khác, kiểu phát triển của các nang

trứng trong giai đoạn trưởng thành có đặc điểm như làn sóng, sóng này theo

chu kỳ và phát triển đồng thời của một nhóm nang trứng (Adams, 1999). Các

nghiên cứu gần đây cho thấy các nang trứng có kích thước 1 - 3 mm cũng

phát triển theo kiểu sóng. Các kiểu nang trứng phát triển theo sóng ở bê được

nghiên cứu cách đây hàng chục năm (Rajakoski, 1960) sử dụng số liệu mô

học của buồng trứng lấy từ các con bê khác nhau ở các ngày khác nhau của

chu kỳ. Tuy nhiên gần đây các kiểu nang trứng phát triển theo sóng được xác

nhận sử dụng máy siêu âm để siêu âm các nang trứng.

Ở bò có 2 - 3 đợt sóng nang phát triển trong một chu kỳ tính. Trong

mỗi sóng có một nang trứng phát triển nhanh hơn các nang trứng khác và trở

thành nang trội. Mặc dù nang trội của mỗi đợt sóng nang có khả năng phát

triển đến rụng trứng, nhưng do bị progesterone của thể vàng ức chế nên không

phát triển đến giai đoạn rụng trứng mà bị thoái hóa, chỉ có một nang trội của

đợt sóng nang cuối cùng phát triển đến giai đoạn rụng trứng. Nang trứng của

đợt sóng nang cuối cùng phát triển đến giai đoạn rụng trứng do progesterone

giảm do thể vàng thoái hóa. Sự có mặt của progesterone ở pha thể vàng làm

cho các nang trứng trội bị thoái hóa và đợt sóng nang mới lại xuất hiện.

Độ dài pha thể vàng của chu kỳ động dục sử dụng progesterone ngoại

sinh làm kéo dài chu kỳ động dục và tạo ra sự luân chuyển của nang trội.

Nồng độ progesterone cao hơn ức chế sự liên tục của sóng LH (Luteinising

Hormone), hormone hoàng thể hóa do tuyến yên tiết ra, có tác dụng kích thích

rụng trứng và phát triển thể vàng ở con cái làm cho nang trội có thời gian

sống ngắn hơn. Progesterone ức chế sự ảnh hưởng lên sự phát triển của pha

nang trội do vậy các mức độ progesterone của thể vàng bình thường thúc đẩy

sự thoái hóa của các nang trội và tạo ra sóng nang mới (Adams và cs., 1992).

Tăng tính liên tục của nhịp LH kéo dài sự phát triển của nang trội và tạo ra

các cơ chất để tổng hợp estradiol, tăng nồng độ estradiol trong máu từ nang

trội. Nồng độ estradiol trong máu cao ức chế các sóng FSH và làm cho các

nang trứng 5mm hay lớn hơn không xuất hiện và hình thành các nang trội mới

(Sirois và Fortune, 1990).

Ở chu kỳ động dục thường có 2 đợt sóng nang, các nang trứng rụng

phát triển ở trong trạng thái progesterone cao trong 7 ngày so với chu kỳ có 3

đợt sóng nang. Thêm vào đó sự phát triển nang trứng rụng ở chu kỳ động dục

có 2 đợt sóng nang, trong khoảng thời gian lâu hơn chu kỳ động dục có 3 đợt

sóng nang ( 11 ngày so với 7 ngày) và do vậy nang trứng rụng ở chu kỳ động

dục có 2 đợt sóng nang có kích thước to hơn (17mm so với 14mm) (Ginther

và cs., 1989). Do thời gian phát triển của nang trứng ở chu kỳ động dục có 2

đợt sóng nang dài hơn chu kỳ động dục có 3 đợt sóng nang do vậy các nhà

nghiên cứu đã nghiên cứu và so sánh tỉ lệ có chửa và một số các tác giả cho

rằng ở chu kỳ có hai đợt sóng nang tỉ lệ có chửa thấp hơn ( Townson và cs.,

2002), song một số tác giả khác lại cho thấy không có sự khác nhau (Ahmad

và cs., 1997) về tỉ lệ có chửa ở bò có hai đợt sóng nang trong chu kỳ động

dục.

1.4. Hormone

1.4.1. Cơ chế điều khiển của hormone đến sự phát triển nang trứng

Hypothalamus tiết hormone giải phóng GnRH (Gonadotropin

Releasing Hormone) vào hệ thống động mạch vùng dưới đồi - tuyến yên làm

thùy trước tuyến yên tăng tiết FSH và LH, kích thích sự phát triển nang trứng.

Trong hàng loạt các nang phát triển xuất hiện nang trứng phát triển nhanh hơn

trở thành nang trội. Estradiol và Inhibin được tổng hợp từ các tế bào hạt của

nang trội, tạo ra một hàm lượng estradiol và Inhibin tăng cao. Estradiol tác

động ngược dương tính vào hypothalamus, kích thích hàm lượng LH tăng cao

kích thích nang trội giải phóng tế bào trứng. Insulin tác động ngược âm tính

làm giảm hàm hàm lượng FSH dưới ngưỡng cần thiết đối với sự tồn tại của

các nang còn lại làm thoái hóa các nang trứng còn lại. Song ở hàm lượng FSH

thấp nang trội vẫn có khả năng phát triển và rụng trứng do nang trội có sự

mẫn cảm với FSH nhờ sự có mặt của IGF-1 (Insulin liked Growth Factor-1:

Yếu tố sinh trưởng giống Insulin) trong tế bào với hàm lượng cao hơn và

nang trội có cơ quan thụ thể để tiếp nhận LH trên các tế bào hạt sớm hơn các

nang khác và do vậy khả năng sống của nang trội dưới các nồng độ FSH cơ sở

(Campbell và cs., 1995) nên nang trội phát triển đến giai đoạn rụng trứng mà

không bị thoái hóa trong điều kiện FSH thấp.

1.4.2. Vai trò của FSH

FSH là một glycoprotein tìm thấy ở người và các động vật khác nhau,

được tổng hợp và tiết ra bởi các tế bào nội tiết của thùy trước tuyến yên. FSH

có chức năng điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển, thành thục về tính và

các quá trình sinh sản của cơ thể. FSH hoạt động thông qua sự liên kết vào

các receptor đặc trưng, được định vị vào một nơi riêng biệt trên tế bào hạt của

nang trứng và các tế bào hạt trên buồng trứng là vị trí đích để FSH hoạt động.

Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng FSH rất cần thiết cho tất cả các giai

đoạn phát triển của nang trứng như: Chuyển hóa tiền các tế bào hạt dẹt thành

các tế bào hình lập phương, phát triển các nang trứng thứ cấp và chuyển hóa

nang trứng từ nang trứng thứ cấp thành nang trứng phát triển do FSH ảnh

hưởng trực tiếp lên sự hình thành nang.

Vai trò của FSH trong sự điều khiển phát triển các nang trứng nhỏ (< 1

mm) được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và đến nay vẫn có

nhiều quan điểm trái ngược nhau. Một số tác giả cho rằng FSH không có chức

năng đối với các nang trứng ở trước giai đoạn nang trứng thứ cấp ở bò cũng

như các loài động vật có vú khác (Wandij và cs., 1992; Tanaka và cs., 2001).

Song một số tác giả gần đây nghiên cứu cho thấy, FSH đóng vai trò trong sự

phát triển của nang trứng giai đoạn đầu, thiếu lượng FSH tối thiểu có thể làm

giảm tỉ lệ phát triển của nang trứng nhỏ do kéo dài thời gian cần thiết để các

tế bào hạt phát triển (Govan and Black, 1975; Lussier và cs., 1987). FSH là

yếu tố đầu tiên điều khiển quá trình phát triển của nang trứng ở tất cả các giai

đoạn khác nhau. Khi nghiên cứu mối quan hệ giữa sự xuất hiện của nang

trứng trong giai đầu của thời kỳ mang thai và hàm lượng FSH trong huyết

thanh của bào thai cái, thấy rằng trong thai cũng như ở bò trưởng thành, số

lượng của các nang trứng và các giai đoạn phát triển của nang trứng được

đánh giá thông qua sự thay đổi nồng độ FSH (Tanaka và cs., 2001). Ở bò

ngay sau khi các nang trứng nguyên thủy được hoạt hóa, thụ thể FSH (FSH

receptor) được thể hiện lên các màng tế bào hạt. Nghiên cứu ở loài gặm nhấm

cho thấy rằng FSH cần thiết cho quá trình thành thục của tiền các tế bào hạt

dẹt thành các tế bào hạt hình lập phương (Lintern, 1977), các tế bào hình lập

phương này đánh dấu cho sự chuyển đổi của quá trình hoạt hóa nang trứng

nguyên thủy thành nang trứng sơ cấp. Sự ức chế của FSH hạn chế quá trình

hoạt hóa nang trứng nguyên thủy thành nang trứng sơ cấp. Như vậy chúng ta

có thể thấy rằng FSH cần thiết cho tất cả các giai đoạn phát triển của nang

trứng như: Chuyển hóa các tế bào hạt thành các tế bào hạt hình lập phương,

phát triển các nang trứng giai đoạn thứ cấp, chuyển hóa nang trứng từ giai

đoạn thứ cấp thành nang trứng phát triển và phát triển đến khi rụng trứng, qua

đó ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành các xoang của nang trứng.

Sự phát triển của các nang trứng ở giai đoạn phát triển, có kích thước >

1mm phụ thuộc vào nồng độ FSH trong hệ thống tuần hoàn. Trước khi rụng

trứng nồng độ FSH của nang trứng có kích thước 4 - 5 mm lặp đi lặp lại giống

như sóng và hàm lượng FSH bắt đầu giảm sau khi nang trứng lớn hơn 5 mm.

Estradiol và inhibin từ nang trứng 4 - 5 mm dần tăng tiết tạo ra sự phản hồi

âm tính cho FSH ở trục dưới đồi tuyến yên (Adams và cs., 1992). Sự suy

giảm FSH đến hàm lượng cơ sở xảy ra đồng thời với sự lựa chọn một nang

trội. Ở bê duy trì nồng độ FSH khi xử lý gây rụng trứng nhiều, làm ức chế quá

trình lựa chọn nang trội làm cho nhiều nang trứng phát triển.

1.5. Thu tế bào trứng

1.5.1. Thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ

Buồng trứng được thu từ lò mổ đóng một vai trò quan trọng, liên quan

mật thiết đến chất lượng và khả năng phát triển về sau, vì vậy buồng trứng bò

sau khi giết mổ được rửa sạch sẽ và bảo quản trong dung dịch NaCL 0,9%, bổ

sung 100.000 IU penicillin/ml và 100 µg streptomycin/ml (Nguyễn Văn Lý,

2006) hoặc trong môi trường mDPBS (Yang và Lu., 1990), duy trì ở nhiệt độ 20 – 37 0C và đưa về phòng thí nghiệm trong khoảng thời gian 2 – 6 h để thu

tế bào trứng. Ngay sau khi buồng trứng được mang về từ lò mổ, tiến hành

khai thác tế bào trứng bằng phương pháp giải phẫu nang trứng hoặc hút dịch

nang trứng (Hình 1.3)

Phương pháp phẫu thuật là phương pháp sử dụng dao vô trùng để rạch

các nang trứng quan sát được, dùng dịch mDPBS có bổ sung100.000 IU

penicillin/ml và 100 µg streptomycin/ml để rửa. Phương pháp này thường cho

số lượng tế bào trứng cao hơn phương pháp hút nhưng chất lượng tế bào

trứng thấp hơn do một số nang trứng bé không mong muốn cũng bị rạch, khả

năng vô trùng thấp và tốn nhiều thời gian hơn. Do vậy hiện nay phương pháp

thường được sử dụng là sử dụng kim để hút các nang trứng quan sát được sử

dụng áp lực của xi lanh do tay tạo ra hoặc một số tác giả sử dụng máy siêu âm

để hút, phương pháp này nhanh hơn 4.3 lần so với phương pháp rạch nang

trứng (Wahid và cs., 1992). Hamano và kawajama. (1993) thu được 30 tế bào

trứng/buồng trứng/lần khi sử dụng phương pháp rạch nang trứng. Nhìn chung

kết quả nghiên cứu còn nhiều biến động giữa hai phương pháp. Tuy nhiên

thực tế cho thấy rằng, phương pháp sử dụng kim để thu tế bào trứng cho phép

chủ động thu được những nang trứng có chất lượng tốt hơn, do hạn chế sự

Phương pháp rạch Phương pháp hút

tiếp xúc của tế bào trứng với môi trường xung quanh.

Hình 1.3. Phương pháp thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ

1.5.2. Thu tế bào trứng từ bò sống

Thành công của kỹ thuật thu tế bào trứng từ bò sống đã mở ra một triển

vọng mới trong công nghệ cấy truyền phôi cũng như các kỹ thuật khác sử

dụng tế bào trứng. Có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để thu tế

bào trứng từ bò sống như: Phương pháp mổ bụng, phương pháp nội soi

(Holland và cs., 1981; Lambert và cs., 1983; Schellander, 1989), phương pháp

phẫu thuật mở âm đạo (Callesen và cs., 1987). Các phương pháp trên hầu hết

có nhiều nhược điểm, như sự viêm nhiễm, viêm dính màng bụng, số lượng tế

bào trứng ít, chất lượng tế bào trứng thấp và tốn kém. Để khắc phục được các

nhược điểm đó Pieterse và cs. (1988) đã nghiên cứu thành công phương pháp

siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống và hiện nay được ứng dụng rộng rãi. Sử

dụng hệ thống máy siêu âm hút tế bào trứng bao gồm nhiều bộ phận (Hình

1.4) như: Màn hình siêu âm, đầu dò siêu âm được gắn với hệ thống dẫn kim,

máy tạo áp lực chân không, bộ phận ổn nhiệt, hệ thống dây dẫn, ống đựng

dịch,… Ống dẫn dịch hút nang trứng

Đầu dò siêu âm

Màn hình siêu âm

Bình ổn nhiệt

Các phím chức năng

Máy tạo áp lực

Hình 1.4. Hệ thống siêu âm hút tế bào trứng

Để quan sát được số lượng, kích thước và hút được tế bào trứng. Đầu

dò siêu âm giống như lưỡi dao cắt ngang buồng trứng, hình ảnh quan sát được

là hình ảnh có được trên đường đi của lát cắt đó. Khi quan sát chúng ta phải

dịch chuyển buồng trứng theo nhiều vị trí khác nhau để quan sát toàn diện

được các chi tiết của buồng trứng, mỗi lần dịch chuyển buồng trứng sẽ có lát

cắt khác nhau và thu được hình ảnh tương ứng với mỗi vị trí. Khi buồng trứng

được cắt vào bờ nhỏ ta thu được mặt cắt nhỏ và khi đầu dò vào vị trí lớn nhất

của buồng trứng ta thu được mặt cắt lớn nhất của buồng trứng. Tương tự các

nang trứng và thể vàng cũng thu được kích thước tương tự khi vị trí của đầu

dò ở các vị trí khác nhau. Do cấu tạo của buồng trứng gồm miền vỏ và miền

tủy nên khi khi đầu dò siêu âm ở vào vị trí lớn nhất của buồng trứng chúng ta

sẽ không thấy nang trứng hay thể vàng ở phần giữa lát cắt (Hình 1.5).

Sau khi Pieterse và cs. (1988) thành công, Siêu âm hút tế bào trứng trên

bò sống được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Một

bước ngoặt mới trong nghiên cứu và sản xuất phôi bò in vitro đã được mở ra.

Thay thế nguồn tế nguồn tế bào trứng được khai thác từ buồng trứng được thu

từ lò mổ. Sự khác biệt về giá trị và khoa học là rất lớn, bởi việc khai thác tế

bào trứng từ lò mổ mất nhiều công sức, số lượng tế bào trứng không chủ

động, bò giết thịt có chất lượng kém, sức khỏe và lý lịch không rõ ràng. Bên

cạnh đó chất lượng tế bào trứng, tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được thấp. Do

có sự khác nhau của nhiều yếu tố mà kết quả nghiên cứu của các nhà khoa

học trên thế giới có nhiều sự khác nhau về số lượng, chất lượng tế bào trứng,

tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được giữa nhiều nhóm tác giả và các quốc gia

khác nhau.

Hình ảnh thu được khi đầu dò ở các vị trí khác nhau

Thể vàng

Nang trứng

“Vị trí cắt ngang” là hình ảnh thu được trên màn hình siêu âm

Đường trung tâm

Vị trí cắt

Hình ảnh quan sát được

Buồng trứng

Hình 1.5. Các hình ảnh thu được khi đầu dò siêu âm ở các vị trí khác nhau

trên buồng trứng

Ở nước ta kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng ở bò lần đầu tiên được

nhóm tác giả Nguyễn Văn Lý và cs. (2007) thực hiện năm 2005. Với kết quả

ban đầu thu được bình quân 4,03 tế bào trứng/buồng trứng. Tế bào trứng đủ

tiêu chuẩn đem vào nuôi thành thục (loại A,B) 69,06% tế bào, tỉ lệ tế bào

trứng thành thục đạt 71,2% và tỉ lệ phôi dâu, tỉ lệ tế bào trứng thụ tinh đạt

43,75%, tỉ lệ hợp tử phân chia đạt 38,41% và tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu

được là 28,38%. Có 20 phôi được đem cấy cho bò nhận phôi và đã có 5 bê

được sinh ra. So sanh với kết quả thu được của nhiều tác giả trên thế giới, kết

quả này thực sự còn nhiều hạn chế. Do điều kiện con người, hệ thống thiết bị,

vị trí địa lý, khí hậu, sinh lý sinh sản bò được nuôi dưỡng và chăm sóc ở điều

kiện nước ta có nhiều sự khác biệt. Vì vậy để nâng cao được kết quả này

chúng ta cần đi sâu nghiên cứu những yếu tố đó.

1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng số lượng, chất lượng tế bào

trứng và kết quả tạo phôi in vitro khi siêu âm hút tế bào trứng.

1.5.3.1. Đầu dò siêu âm

Hashimoto và cs. (1998) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tần số

đầu dò lên kết quả thu tế bào trứng thấy rằng, quan sát và xác định kích thước

của nang trứng ở bò sống khi siêu âm hút tế bào trứng đóng vai trò hết sức

quan trọng. Kết quả quan sát nang trứng cho thấy, hình ảnh siêu âm được tạo

ra bởi đầu dò 7,5 MHz có khả năng quan sát toàn bộ buồng trứng tốt hơn, các

nang trứng có kích thước 3 - 5 mm rõ nét hơn, số lượng nang trứng có màng

cumulus chặt chẽ được hút nhiều hơn và số lượng tế bào trứng thu được nhiều

hơn so với đầu dò 5,0 MHz.

Bên cạnh tần số, cấu tạo đầu dò cũng đóng một vai trò quan trọng khi

quan sát, xác định kích thươc và thu tế bào trứng. Cấu tạo đầu dò khác nhau

cho kết quả khác nhau. Nghiên cứu so sánh 2 loại đầu dò siêu âm (Bols và cs.,

2003), cho thấy với nang trứng có kích thước trên 5 mm hình ảnh quan sát

được không có sự khác nhau giữa đầu dò Esaote/Pie Medical ‘Linear aray’(di

chuyển buồng trứng theo một hướng nhất định) và Esaote/Pie Medical

‘Annular Array Multi Angle’ (di chuyển buồng trứng theo nhiều góc độ khác

nhau). Song khi quan sát nang trứng có kích thước < 5 mm đầu dò Esaote/Pie

Medical ‘Annular Array Multi Angle’ cho hình ảnh tốt hơn do buồng trứng dễ

dàng di chuyển theo nhiều góc độ khác nhau trong phạm vi của đầu dò. Ngoài

ra đầu dò Esaote/Pie Medical ‘Annular Array Multi Angle’ có mặt quét rộng

hơn, cho phép di chuyển buồng trứng ở vị trí mà tay khó di chuyển, hạn chế

Esaote/Pie Medical Esaote/Pie Medical

tối đa tổn thương của buồng trứng và dây chằng buồng trứng (Hình 1.8).

‘Linear aray’ Annular Array Multi Angle’

Hình 1.6. Khả năng thao tác và quan sát buồng trứng của 2 loại đầu dò

1.5.3.2. Áp lực hút

Để thu được tế bào trứng nằm trong nang trứng, cần phải có một áp lực

hút nhất định để hút được dịch nang trứng ra ngoài. Áp lực hút có được nhờ

máy tạo áp lực của hệ thống siêu ấm hút tế bào trứng tạo nên. Mức độ mạnh

yếu của áp lực phụ thuộc vào sự điều chỉnh nút chức năng lớn nhỏ của người

kỹ thuật. Tuy nhiên áp lực thực tế lại phụ thuộc rất lớn vào cấu tạo, độ dài và

kích thước của ống dẫn dịch, kim hút tế bào trứng và kích cỡ của ống đựng

dịch nang trứng. Chính vì vậy khi siêu âm hút tế bào trứng các nhà khoa học

luôn nghiên cứu tìm ra một áp lực hút thích hợp với hệ thống thiết bị siêu âm

hút tế bào trứng của mình. Nếu sử dụng áp lực hút quá yếu sẽ không hút được

hết được dịch nang trứng, nhưng nếu sử dụng một áp lực hút quá mạnh sẽ làm

tổn thương đến tế bào cumulus, khối tế bào chất và các chức năng khác của tế

bào trứng. Do vậy mà áp lực hút có sự biến động rất lớn giữa các nhà khoa

học trên thế giới, dao động từ 40 - 400 mmHg. Moreno (1993) sử dụng áp lực

hút 120 mmHg, Gibbons (1994) sử dụng áp lực hút 75 mmHg và Ward và cs.

(2000) sử dụng áp suất 90 mmHg tá. Các tác giả đều có kết luận rằng, ở các

mức độ áp lực khác nhau, thấy rằng có mối quan hệ tuyến tính giữa các áp lực

hút được sử dụng và số lượng dịch hút ra trong mỗi phút, số lượng trứng và

phôi thu được rất khác nhau.

1.5.3.3. Tần suất hút

Khi siêu âm hút tế bào trứng, các nang trứng ở các mức độ kích thước

khác nhau được hút ra. Qua trình này đã làm thay đổi về mặt số lượng và kích

thước của các nang trứng có mặt trên buồng trứng. Bên cạnh đó, buồng trứng

cũng bị tổ thương do các vết thương do kim hút tế bào trứng gây nên làm thay

đổi sự phát triển bình thường của sinh lý sinh sản, đặc biệt là sự hoạt động của

buồng trứng và sự phát triển của các nang trứng. Với tần suất hút khác nhau

có sự khác nhau hay không và kết quả ở các tần suất hút có khác nhau hay

không,… được nhiều nhà khoa học trên thể giới quan tâm nghiên cứu. Nhìn

chúng kết quả vẫn còn nhiều biến động giữa các nhà khoa học và giữa các

nhóm bò thí nghiệm, song các tác giả (Gibbons và cs., 1994; Kruip và cs.,

1994; Garcia và Salaheddine, 1998) đều có chung kết luận có sự ảnh hưởng

tần suất đến số lượng, chất lượng trứng, hợp tử, phôi dâu và phôi nang thu

được thu. Merton và cs. (2003) đã nghiên cứu và thấy rằng khoảng cách giữa

các lần lấy ảnh hưởng rất lớn đến tỉ lệ phôi thu được. Số lượng tế bào trứng

thu được ở khoảng cách 7 ngày cao hơn 3 - 4 ngày, nhưng mật độ tế bào

cumulus lại cao nhất khi khoảng cách lấy là 3 ngày, tương tự số lượng phôi

nang thu được cũng khác nhau ở các khoảng cách khác nhau, cao nhất khi

khoảng cách là 3 ngày và thấp nhất là 5 ngày. Viana và cs. (2004) lại có kết

luận rằng, không có sự khác nhau về kích thước và số lượng nang trứng ở tần

suất ½ tuần/lần và 1 tuần/lần (P < 0,05), tỉ lệ tế bào trứng loại A ở tần suất ½

tuần/lần cao hơn tần suất 1 tuần/lần (P < 0,01), tỉ lệ phân chia không có sự

khác nhau giữa hai tần suất, nhưng tỉ lệ phôi nang thu được ở tần suất ½

tuần/lần cao hơn tần suất 1 tuần/lần (p < 0,01; tương ứng: 31,8% so với

21,6%).

1.5.3.4. Kích thước nang trứng

Kích thước nang trứng có sự liên quan mật thiết với các giai đoạn phát

triển của nang trứng và tế bào trứng. Do vậy ảnh hưởng kích thước nang trứng

lên khả năng phát triển của tế bào trứng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu,

song các kết quả giữa các nghiên cứu khác nhau rất nhiều. Một số nhà khoa

học công bố rằng tế bào trứng thu từ nang trứng có kích thước lớn (4 - 6 hay 8

mm) cho tỉ lệ phôi nang cao hơn các nang trứng có kích thước nhỏ hơn.

Blondin và Sirard (1995), lại thấy rằng không có sự khác nhau nhiều về khả

năng phát triển giữa các tế bào trứng thu từ nang trứng có kích thước 3 - 5

mm và nang trứng có kích thước từ 5 mm trở lên. Tương tự, Hagemann và cs.

(1999), cũng không tìm thấy sự khác nhau về khả năng phát triển giữa tế bào

trứng thu được từ nang trứng có kích thước 3 - 5mm và nang trứng có kích

thước 6 - 8mm. Khả năng phát triển của tế bào trứng ở các nang trứng có kích

thước 2 mm trở lên không có sự khác nhau về sự phân chia và phôi nang

(Yang và cs., 1998). Song Lonergan và cs. (1994) đã báo cáo rằng tỉ lệ phôi

nang thu được là 66% ở các nang trứng có kích thước từ 6mm trở lên, trong

khi đó nang trứng có kích thước từ 2 - 6 mm cho tỉ lệ phôi nang thu được chỉ

có 34% và các nang trứng có kích thước 6 mm trở lên.

Như vậy có thể nói kích thước nang trứng có sự ảnh hưởng đến kết quả

siêu âm hút tế bào trứng và tạo phôi in vitro.

1.5.3.5. Pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội

Ở các pha phát triển của nang trứng trong một đợt sóng nang ảnh

hưởng rất lớn đến số lượng và chất lượng tế bào trứng thu được. Hendriksen

và cs. (2004), đã nghiên cứu thấy rằng có sự ảnh hưởng của pha nang trứng

phát triển và pha nang trứng trội lên khả năng phát triển của tế bào trứng sau

khi thụ tinh in vitro, phát triển đến giai đoạn phôi nang tương đối cao ở ngày

thứ 2 và ngày thứ 5 của sóng nang tương ứng 27 và 29% và thấp hơn ở ngày

thứ 8 (15%). Machatkova và cs. (2000), gây động dục bằng cách tiêm PGF2α

và siêu âm hút tế bào trứng tất cả các ngày thứ 1, 2 và 3 của chu kỳ (ngày

động dục ngày 0), thấy rằng tỉ lệ phôi nang ở ngày thứ 1 thấp hơn ngày thứ 2

và 3 ( tương ứng 12,8% so với 27,8% và 27,5%). Điều này được Machatkova

và cs. (2000) giải thích là do số lượng nang trứng ở ngày thứ 1 vẫn còn bị ức

chế bởi nang trội.

1.5.3.6. Ảnh hưởng của FSH

Nghiên cứu sử dụng FSH để kích thích sự phát triển nang trứng trước

khi tiến hành siêu âm hút tế bào trứng bò, được nhiều nhà khoa học trên thế

giới nghiên cứu thành công và thu được nhiều kết quả khả quan. Goodhand và

cs. (2000) đã nghiên cứu, sử dụng FSH để kích thích sự phát triển của nang

trứng trước khi tiến hành siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống và tạo phôi

trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy tổng số nang trứng ở thời điểm siêu âm

hút tế bào trứng tăng từ 17,7 nang ở bò không sử dụng FSH lên 23,6 nang ở

bò được sử dụng FSH. Số lượng nang trứng được hút ra theo mức độ sử dụng

FSH (không sử dụng FSH 9,7 nang, tiêm 1 liều trước khi siêu âm hút tế bào

trứng 13,6 nang và tiêm nhiều liều FSH là 17,3 nang). Số lượng tế bào trứng

bình quân thu được hàng tuần cũng tăng lên (không sử dụng FSH 4,1 tế bào

trứng, tiêm một liều trước khi siêu âm hút tế bào trứng 5,3 tế bào trứng và

tiêm nhiều liều FSH trước khi siêu âm hút tế bào trứng là 5,9 tế bào trứng).

Nghiên cứu của tác giả cũng cho thấy rằng, không có sự khác nhau về tỉ lệ tạo

phôi hay số phôi đủ tiêu chuẩn cấy, nhưng số phôi thu được khi sử dụng FSH

là lớn nhất.

Khác với nghiên cứu trên Goodhand và cs. (1999) đã tiến hành nghiên

cứu siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống và tạo phôi trong ống nghiệm ở các

tần suất khác nhau sử dụng FSH để kích thích. Ông và cộng sự tiến hành thí

nghiệm ở 24 bê Simmental với các tần suất: 1) 1 lần/tuần; 2) 2 lần/tuần và 3)

siêu âm hút tế bào trứng 1 lần/tuần có sử dụng FSH để kích thích 3 ngày nang

trứng phát triển trước khi siêu âm hút tế bào trứng. Số lượng nang

trứng/bê/tuần có mặt ở buồng trứng khi siêu âm hút tế bào trứng ở bê siêu âm

hút tế bào trứng 1 lần/tuần (14,7 nang) thấp hơn nhiều so với bê siêu âm hút tế

bào trứng 2 lần/tuần (27, 4) và 1 lần/tuần có sử dụng FSH để kích thích

(23,1). Ở bê có sử dụng FSH cho chất lượng tế bào trứng tốt hơn, số lượng tế

bào trứng có 4 lớp màng cumulus trở lên cao hơn. Số lượng phôi dâu và phôi

nang/bê/tuần thu được ở tần suất siêu âm 2 lần/tuần và 1 lần/tuần sử dụng

FSH để kích thích lớn hơn bê siêu âm hút tế bào trứng 1 lần/tuần, tương ứng

2,4 phôi, 2,1 phôi và 1,0 phôi.

1.5.3.7. Giống bò

Ảnh hưởng của giống lên khả năng phát triển của tế bào trứng và phôi

thể hiện rất rõ ở một số loài động vật. Ở một số giống chuột, phôi in vitro phát

triển đến giai đoạn phôi nang, trong khi phôi từ một số giống khác lại chỉ phát

triển đến giai đoạn 1 và 2 tế bào (Goddard và Pratt, 1993). Sự khác nhau này

có thể là do nguyên nhân một số yếu tố gen trưởng thành hoặc tế bào chất

(Bavister, 1996).

Ở bò, nguồn tế bào trứng cả ở bò sữa và bò thịt ảnh hưởng đến tỉ lệ

phôi nang thu được (Fischer và cs., 2000). Ảnh hưởng của giống bò lên chất

lượng tế bào trứng trở nên rõ ràng khi đánh giá ở các điều kiện môi trường

khác nhau. Liên quan đến stress nhiệt thì tỉ lệ phôi nang giảm cả ở giống bò

sữa thuần và giống bò Brahman. Ở giống bò có u có khả năng cao về điều

chỉnh nhiệt độ cơ thể tốt hơn ở bò sữa thuần (Block và cs., 2002; Paula và cs.,

2003). Đặc trưng này có thể do sự thích nghi về mặt di truyền ở mức độ tế

bào, cho phép giống bò có u sống sót tốt hơn ở khí hậu nóng (Paula Lopes và

cs., 2003), vì vậy khả năng phát triển của tế bào trứng cao hơn giống bò sữa

thuần (không có u) khi nuôi trong điều kiện môi nắng nóng.

Bảng 1.2. Số lượng tế bào trứng và tỉ lệ phôi nang thu được ở các giống

Tác giả

Giống

Tế bào trứng thu được (trứng/lần)

Tỉ lệ phôi nang thu được (%)

Bò sữa thuần

17,2

39,5

Bò xanh Bỉ

4,1

17,0

Bò lai Angus

3,9

21,0

6,0 4,3

28,0 25,0

7,3

45,9

Bò sữa thuần Giống bò đỏ và trắng Murrah lai với Brahmann (12 tháng tuổi)

German Simental

8,7

18,9

bò khác nhau

Roth và cs., (2008) De Roover và cs., (2008) Chaubal và cs., (2006) Lopez và cs., (2006) (Su và cs., 2009) Machado và cs., (2006)

Ảnh hưởng của ưu thế lai lên sản xuất phôi in vitro được đánh giá bằng

cách sử dụng giao tử từ giống bò có U và bò không có U (Fischer và cs.,

2000). Cho thấy tỉ lệ phôi nang thu được ở bò không có U thuần chủng hơn

bò có U và bò lai. Điều này cho thấy một số đối kháng bộ di truyền giữa

giống bò có U và giống bò không có U làm giảm sự phát triển của những phôi

được sản xuất in vitro. Như vậy cũng có nghĩa là sử dụng phôi được sản xuất

in vitro có thể kém hiệu quả hơn ở giống bò có U và bò F1. Tuy nhiên sản

xuất phôi ở Brazil lại cho thấy phôi nang thu được ở giống bò có U cao hơn

bò sữa (Camargo và cs., 2006) và sử dụng tinh bò sữa để sản xuất phôi từ tế

bào trứng của bò có U thu được tỉ lệ phôi nang 27,3%. Như vậy có thể nói

rằng, có sự biến động giữa các giống bò về số lượng tế bào trứng và tỉ lệ phôi

nang thu được (Bảng 1.4).

1.5.3.8. Tuổi bò

Tất cả các loài động vật có vú đều có sự liên quan mật thiết giữa tuổi và

khả năng sinh sản trong tự nhiên và quá trình sản xuất phôi in vivo và in vitro.

Sự hạn chế kết quả sản xuất phôi dâu và phôi nang trong quá trình sản

xuất phôi in vitro là do sự biến động về chất lượng tế bào trứng. Các nghiên

cứu gần đây cho thấy, chất lượng tế bào trứng là yếu tố chính, ảnh hưởng đến

số lượng phôi nang thu được. Trong đó, yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tế

bào trứng là tình trạng sinh lý sinh sản của bò cho tế bào trứng. Các nghiên

cứu cho thấy, bò cho số lượng tế bào trứng ít hơn bê tơ. Nghiên cứu về ảnh

hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng lên số lượng phôi nang thu được sau khi

thụ tinh in vitro của Mermillod và cs. (1992) thấy rằng, bê cho tế bào trứng

cho có độ tuổi 1 - 3 cho kết quả phôi nang thu được cao hơn bò trưởng thành.

Khả năng phát triển của tế bào trứng từ bê chưa trưởng thành được nâng lên

theo độ tuổi và đặc biệt tăng khả năng phân chia ở giữa tháng thứ 7 và tháng

thứ 9 (Yang và cs., 1998). Khi gây rụng trứng nhiều ở bò già kết quả cho thấy

kích thước các nang trứng < 6 mm, 9 – 11 mm và > 12 mm ít hơn so với bò ít

tuổi hơn (Mahl và cs., 2008). Kết quả nghiên cứu của Rizos và cs. (2005) cho

thấy, số lượng nang trứng được hút ở bê cao hơn ở bò ở giai đoạn đầu của chu

kỳ vắt sữa (tương ứng: 10,4 và 7,8) và số lượng phôi nang thu được ở bê cũng

cao hơn (tương ứng: 4,7 và 2,8 phôi). So sánh khả năng phát triển in vitro của

tế bào trứng thu được ở bò non có độ tuổi 12 tháng tuổi, bò 7 - 8 tuổi và bò

già có độ tuổi từ 5 tuổi trở lên (Su và cs., 2009) cho thấy, tỉ lệ phân chia và tỉ

lệ phôi nang thu được cao nhất ở bò non, tiếp đến là bò 7 - 8 tuổi và thấp nhất

là bò già. Mức độ progesterone trong huyết thanh ở bò non thấp hơn ở bò già

trong suốt chu kỳ động dục khi không tiến hành siêu âm hút tế bào trứng cũng

như trong suốt quá trình siêu âm hút tế bào trứng. Tác giả Roth và cs. (2008)

đã nghiên cứu khả năng phát triển của các tế bào trứng bò thu ở các độ tuổi

khác nhau thấy rằng, không có sự khác nhau về số lượng tế bào trứng thu

được, tỉ lệ phân chia và phôi nang thu được ở bê sữa và bò đẻ nhiều lứa ở thời

gian đầu hay cuối chu kỳ vắt sữa khi siêu âm hút tế bào trứng (Bảng 1.5).

Bảng 1.3. Số lượng tế bào trứng và phôi nang thu được của bò ở các độ

tuổi khác nhau

Tế bào trứng thu

Tỉ lệ phôi nang

Tác giả

Tuổi

được (trứng)

thu được (%)

Bê sữa (HF)

13,2

32,5

Bò sữa (HF)

17,2

39,5

Roth và cs., (2008)

Bò sữa (HF)

16,0

22,8

Bê sữa (HF)

4,1

17,0

Rizos và cs., (2005)

Bò sữa (HF)

2,8

8,1

Murrah lai với

7,3

45,9

Brahmann 12 tháng tuổi

Su và cs., (2009)

7 – 8 tuổi

6,1

30,2

> 15 tuổi

4,7

13,5

1.5.3.9. Mùa vụ

Sự thay đổi khí hậu giữa các mùa trong năm dẫn đến sự thay đổi về

nhiệt độ, độ ẩm và lượng mưa. Chúng tác động trực tiếp cũng như gián tiếp

lên sự sinh trưởng, phát triển và năng suất vật nuôi, đặc biệt là tập tính cũng

như khả năng sinh sản. Chính vì vậy ảnh hưởng của mùa vụ lên khả năng sinh

sản của bò được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu. Tác động của nhiệt độ và

độ ẩm môi trường lên số lượng và chất lượng tế bào trứng với các mức độ

khác nhau. Phụ thuộc vào giống bò mà stress nhiệt ảnh hưởng đến tế bào

trứng bò và phôi (AI - Katanani và cs., 1999). Khả năng sinh sản của bò HF ở

mùa thu thấp hơn mùa đông, nguyên nhân có thể là do ảnh hưởng muộn của

nhiệt độ nắng nóng ở mùa hè (Wolfenson và cs., 2000). Tương tự, những tế

bào trứng thu vào thời điểm đầu mùa thu có chất lượng thấp, chất lượng này

được nâng lên khi bước sang mùa đông (Roth và cs., 2001). Thậm chí giữ cho

bò ở nhiệt độ thấp trong thời gian 42 ngày sau khi bị stress nhiệt cũng không

làm nâng cao được kết quả sản xuất phôi in vitro (AI - Katanani và cs., 2002).

Rocha và cs. (1998) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

và độ ẩm lên chất lượng và khả năng phát triển của tế bào trứng thấy rằng,

nhiệt độ môi trường ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng. Thí nghiệm được

tiến hành siêu âm hút tế bào trứng trên bò sữa Holstein và bò lai Angus (giống bò không có U) vào 2 mùa nóng (22 - 36 0C) và mùa lạnh (-1 - 16 0C) kết quả

thu được cho thấy mùa lạnh tỉ lệ tế bào trứng bình thường cao hơn mùa hè

(tương ứng: 75,9 và 41,0 %), tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu cũng

cao hơn (tương ứng: 46,6 và 6,0 %). Trong một thí nghiệm khác ông thấy

rằng vào mùa nóng bò sữa Holstein cho tỉ lệ tế bào trứng bình thường thấp

hơn rất nhiều so với bò Brahman (giống bò có U) tương ứng là 24,5 và 80,0

%, và tương tự tỉ lệ phôi nang thu được ở bò sữa Holstein vào mùa nóng là

bằng 0, bên cạnh đó ở bò Brahman là 41,3 %. Như vậy ta thấy rằng mùa vụ có

sự ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tế bào trứng nhưng Takuma và cs.

(2010) khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của mùa nóng và mùa lạnh lại có kết

luận rằng không có sự khác nhau giữa mùa nóng và mùa lạnh lên số lượng,

chất lượng tế bào trứng và số lượng phôi thu được.

1.6. Nuôi tế bào trứng In vitro

1.6.1. Nuôi thành thục tế bào trứng in vitro

Để đảm bảo cho quá trình thụ tinh, tế bào trứng sau khi được hút ra

bằng kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng được soi tìm, đánh giá và phân loại.

Các tế bào trứng loại A, B được đưa vào nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm

và tạo phôi in vitro.

Edward. (1965) lần đầu đầu tiên thấy các tế bào trứng nguyên thủy của

bò thu được từ các nang trứng không rụng trứng có thể tiếp tục phân bào giảm

nhiễm và phát triển hoàn toàn đến giai đoạn pha giữa I của thời kỳ phân bào

in vitro. Nghiên cứu của Sirard và cs. (1988) về nuôi thành thục tế bào trứng

in vitro cũng cho thấy rằng các tế bào trứng nguyên thủy chưa thành thục

được hút từ các nang trứng bò ở giai đoạn phát triển mà không biết giai đoạn

nào của chu kỳ có thể thành thục và thụ tinh in vitro để tạo ra thế hệ đời con.

Với khả năng phát triển của các kỹ thuật nuôi thành thục in vitro cho

thấy, tế bào trứng thành thục trong thực tế là một quá trình phức tạp bao gồm

sự thành thục của nhân và tế bào chất. Khả năng một tế bào trứng phục hồi lại

quá trình phân bào giảm nhiễm và phát triển đến giai đoạn pha giữa II của

thời kỳ phân bào không nói lên khả năng thụ tinh hay khả năng phát triển của

tế bào trứng đó. Có nghĩa sự thành thục của nhân và tế bào chất thực tế là hai

quá trình riêng biệt. Sự thành thục của tế bào chất trong thực tế cho thấy bao

gồm nhiều sự kiện sinh lý và sinh học có thể liên quan hoặc không liên quan

đến sự thành thục của nhân, nhưng có sự ảnh hưởng đáng kể sự thụ tinh và

phát triển của phôi (Hunter, 1985). Sự thành thục không hoàn toàn của tế bào

chất thực sự là nguyên nhân làm giảm khả năng phát triển khi sản xuất phôi

động vật có vú.

Tế bào trứng của động vật có vú ở giai đoạn túi mầm sẽ được phân bào

giảm nhiễm, túi mầm bị hỏng khi cho vào môi trường biến động. Huyết thanh,

các gonadotropin như LH, FSH có sự ảnh hưởng tích cực đến sự thành thục

của tế bào trứng, sự dãn nở của màng cumulus và sự thụ tinh của tế bào trứng.

FSH và LH không ảnh hưởng đến tỉ lệ tế bào trứng phát triển đến giai đoạn

phân bào II sau 24h nhưng làm tăng tỉ lệ thành thục của nhân khi thiếu hụt

huyết thanh. Các tế bào trứng phát triển đến giai đoạn pha giữa II của thời kỳ

phân bào sau khi thành thục 16 h có khả năng phát triển cao hơn các tế bào

trứng phát triển đến giai đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào ở thời gian

thành thục 20 hay 24h.

Sự thành công khi nuôi thành thục tế bào trứng phụ thuộc vào sự

nguyên vẹn của các tế bào cumulus. Các tế bào cumulus cung cấp năng lượng

cho tế bào trứng như các amino acid, pyruvat và lactate (Sirard và cs., 1988).

Ngoài ra, tế bào cumulus bảo vệ sự xơ cứng của màng vòng trong suốt. Chỉ có

các tế bào trứng có vài lớp màng cumulus nguyên vẹn trở lên mới được lựa

chọn để nuôi thành thục, sự phát triển của phôi sau này liên quan đến số

lượng màng cumulus bao quanh tế bào trứng. Sau khi nuôi thành thục các tế

bào cumulus phát triển thành một khối hình cầu và khối tế bào cumulus

dường như nổi lên trong đĩa nuôi phôi (Hensleigh và Hunter, 1983).

Sự có mặt của các tế bào hạt làm tăng sự thành thục, sự khả năng thụ

tinh và khả năng phát triển của tế bào trứng bò (Fukui và Ono, 1989). Vì vậy

một số tác giả đã bổ sung vào môi trường nuôi thành thục tế bào trứng tế bào

hạt nhằm tạo môi trường nuôi in vitro giống với môi trường in vivo. Có nhiều

nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, mức độ phôi dâu và phôi nang thu được

nhiều khi nuôi thành thục tế bào trứng trong môi trường có các tế bào hạt

(Edward và cs., 1997).

Nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở nước ta cho

thấy, sự thành thục tế bào trứng bò in vitro được nâng lên khi nuôi với các

yếu tố phát triển nhất định. Bổ sung yếu tố phát triển biểu bì vào môi trường

nuôi thành thục tế bào trứng bò, huyết thanh hay các gonadotropin làm tăng

khả năng kích thích sự phân bào và tăng đáng kể tỉ lệ tế bào trứng phát triển

đến giai đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào, màng cumulus giãn nở, tỉ lệ

thụ tinh và sự phát triển của phôi. Sự thành thục của tế bào trứng bò với yếu

tố phát triển biểu bì I cũng làm tăng tỉ lệ tế bào trứng phát triển đến giai đoạn

pha giữa II của thời kỳ phân bào, nhưng không làm ảnh hưởng đến sự giãn nở

của các tế bào cumulus. Sự thành thục của tế bào trứng với yếu tố phát triển

biểu bì α cũng kích thích sự giãn nở của tế bào cumulus và khả năng thụ tinh

của tế bào trứng thành thục. Hormone sinh trưởng làm tăng sự thụ tinh của tế

bào trứng bò. Yếu tố phát triển giống insulin B, yếu tố sinh trưởng biến đổi β1

không làm ảnh hưởng đến sự giãn nở của màng cumulus.

Quá trình thành thục của nhân ở tế bào trứng bắt đầu từ sự phân rã của

túi mầm. Sau khi túi mầm phân rã, sự phân bào giảm nhiễm của tế bào trứng

được hồi phục và phát triển qua giai đoạn pha giữa của giai phân bào I, kỳ sau

của phân bào I và kỳ cuối của phân bào I, dẫn đến sự xuất hiện của thể cực

thứ nhất. Tế bào trứng sau đó lại ngừng lại ở giai đoạn pha giữa của phân bào

giảm nhiễm II. Ở giai đoạn pha giữa của phân bào giảm nhiễm II, các tế bào

trứng sẵn sàng cho quá trình thụ tinh.

Hầu hết các tác giả nuôi tế bào trứng thành thục trong môi trường

TCM-199 với 5 hoặc 10 % huyết thanh bê mới sinh, sodium pyruvate (0,2

mM) FSH, LH và estradiol 17β (0,1µg/ml), kháng sinh 100.000 iu

penicillin/ml và streptomycin 100 µg (Bavister, 1996; Saitoh và cs., 1995).

Sau khi được rửa sạch trong môi trường TCM-199, 20 tế bào trứng được

nuôi/giọt được nuôi thành thục trong thời gian 20 h trong các môi trường trên, với, nhiệt độ 38,50 C, CO2 5%, pH khoảng 7,3 - 7,4 và độ ẩm tối đa. Các giọt

nuôi phôi được phủ dầu khoáng.

1.6.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi thành thục tế bào trứng

Báo cáo về nuôi thành thục tế bào trứng in vitro của các nhà khoa học

cho thấy thấy, khả năng phát triển của các tế bào trứng giảm sau khi nuôi in

vitro. Tuy nhiên, chất lượng tế bào trứng tốt kết hợp với cải tiến được điều

kiện và chất lượng môi trường nuôi có thể nâng cao được khả năng phát triển

của tế bào trứng khi bổ sung các thành phần quan trọng như: Bổ sung huyết

thanh, hormone và các chất bổ sung khác (Gordon và Lu, 1990).

1.6.2.1. Chất lượng tế bào trứng

Chất lượng tế bào trứng đóng vai trò quan trọng đến sự thành thục, thụ

tinh và sự phát triển của phôi, vì vậy được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới

quan tâm nghiên cứu, hầu hết các nhà khoa học đều đánh giá chất lượng tế

bào trứng trên kinh hiển vi soi nổi, dựa vào đặc điểm, hình thái như kích

thước tế bào trứng, hình dạng, màu sắc, vòng trong suốt và màng cumulus.

De Loos và cs. (1989) đánh giá chất lượng tế bào trứng dưới kính hiển vi soi

nổi, dựa vào sự chặt chẽ và sự trong suốt của màng cumulus bao quanh tế bào

trứng. Sự đồng nhất và trong suốt của của khối tế bào chất với 4 cấp độ từ tốt

đến xấu: 1) Có nhiều lớp màng cumulus chặt chẽ, tế bào chất đồng nhất, khối

tế bào cumulus sáng và trong suốt; 2) Có nhiều lớp tế bào cumulus chặt chẽ,

tế bào chất đồng nhất nhưng có những vùng tối phía ngoài tế bào trứng, khối

tế bào cumulus ít sáng và ít trong suốt hơn loại 1; 3) Có ít lớp cumulus bao

quanh tế bào trứng hơn loại 1, khối tế bào chất không đều, có các đám đen và

khối tế bào cumulus tối hơn loại 1 và loại 2; 4) Không có hoặc các lớp

cumulus giãn nở, các tế bào cumulus tụ tập lại thành từng đám tối, khối tế bào

cumulus tối và không đều.

Goodhand và cs. (1999) đánh giá chất lượng tế bào trứng theo 4 mức

độ A, B, C và D khác nhau dựa vào hình dạng, sự đồng nhất của tế bào chất

và đặc biệt là màng cumulus. A) có 4 lớp màng cumulus trở lên, phân bố rõ

ràng, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất; B) có 1 lớp màng tế bào

cumulus trở lên, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất; C) một số phần

cumulus bị lột trần, tế bào chất co lại không đều; D) tế bào trứng hoàn toàn bị

lột trần và tế bào chất co lại không đều.

Nghiên cứu về ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng lên khả năng

phát triển (Sylvie Bilodeau-Goeseels và Paul Panich, 2001) đã phân chia chất

lượng tế bào trứng thành 6 loại, dựa vào đặc điểm của các lớp màng cumulus

và đặc điểm của khối tế bào chất. Kết quả cho thấy, không có sự khác nhau

đáng kể về tỉ lệ phân chia và phôi nang thu được ở tế bào trứng có chất lượng

loại I và loại II, tương ứng 13,9 và 13,7 %. Song có sự khác nhau giữa tế bào

trứng chất lượng loại I và II so với các nhóm còn lại và thấp nhất là nhóm V

và nhóm VI chỉ đạt 0,3 và 1,9 % (Bảng 1.2).

Younis và cs. (1989) đánh giá chất lượng tế bào trứng thành hai loại,

dựa vào tế bào chất và màng cumulus. Tế bào trứng được sử dụng nuôi cấy

(loại 1) là tế bào trứng đồng nhất, các tế bào cumulus chặt chẽ và gắn chặt với

màng trong suốt. Tế bào trứng không được sử dụng (loại 2) là tế bào có tế bào

cumulus không chặt chẽ, trứng không đồng nhất.

Loại Số lượng màng

Đặc điểm của các lớp màng

Đặc điểm của khối tế bào

cumulus

cumulus

chất

I

≥ 5

Liên kết với nhau chặt chẽ

Đồng nhất

II

≥ 5

Hơi giãn nở

Hơi kết thành từng đám

III

< 5

Chặt chẽ hoặc hơi giãn nở

Đồng nhất

IV

< 5

Chặt chẽ hoặc hơi giãn nở

Kết thành từng đám

V

0

Không có màng cumulus

Biến đổi

VI

≥

Giãn nở, từng đám đen tụ lại Kết thành rất nhiều đám

Bảng 1.4. Đánh giá chất lượng tế bào trứng ở 6 mức độ khác nhau

(Nguồn Sylvie Bilodeau-Goeseels và Paul Panich, 2001)

Ảnh hưởng chất lượng hình thái học của tế bào trứng chưa thành thục

cũng được Khurana và Niemann. (2000) nghiên cứu và đưa ra kết luận rằng,

chất lượng hình thái học của tế bào trứng ảnh hưởng đến khả năng thành thục

khi nuôi in vitro, thụ tinh, phân chia và phôi dâu và phôi nang thu được. Với

tế bào trứng loại 1 (loại tốt nhất) tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được cao nhất

33,9%, trong khi đó loại 2 là 13,1%, còn loại 3 và loại 4 không thu được.

1.6.2.2. Màng cumulus

Cumulus có rất nhiều chức năng quan trọng trong quá trình phát triển

và thụ tinh của tế bào trứng. Bảo vệ tế bào trứng dưới sự tác động của quá

trình tự thoái hóa của nang trứng (meiotic arrest), tham gia vào quá trình khôi

phục quá trình phân bào giảm nhiễm, hỗ trợ sự thành thục của tế bào chất, thu

hút và bẫy hay lựa chọn tinh trùng, tạo thuận lợi cho tinh trùng thâm nhập vào

trong tế bào trứng, ngăn cản sự chai cứng sớm của vòng trong suốt.

Phương pháp đầu tiên quan sát để xác định có hay không có khả năng

phát triển của tế bào trứng đó là hình thái học của cumulus. Các tế bào

cumulus có nguồn gốc của các tế bào hạt buồng trứng có chức năng riêng

biệt. Tầm quan trọng của tế bào cumulus là cung cấp dinh dưỡng cho tế bào

trứng trong quá trình phát triển, tham gia hình thành vòng trong suốt và sóng

LH, tổng hợp các thành phần protein tử cung và axít hyaluronic cần thiết cho

sự vận chuyển và bẫy tinh trùng (Bedford và Kim, 1993). Các tế bào cumulus

hình thành lên vành phóng xạ, là màng gần nhất với tế bào trứng và thông

thường có sự tiếp xúc chặt chẽ, sử dụng sự giãn nở của tế bào chất qua vòng

trong suốt và phía ngoài của cumulus liên kết với vành phóng xạ qua khe liên

kết (Gap junction hay khe kết là một loại gian bào đặc biệt liên kết giữa các

loại tế bào với nhau. Liên kết trực tiếp tế bào chất với 2 tế bào với nhau và

cho phép các phân tử tự do qua lại giữa các tế bào (De Loose, 1991). Độ dày

của màng cumulus thay đổi phụ thuộc vào kích thước nang trứng. Sự nguyên

vẹn của tế bào cumulus cũng thay đổi qua tình trạng sức khỏe của nang trứng

(Leibfried và First, 1979). Trong thời gian nang trứng thoái hóa phía ngoài

cumulus ít chặt chẽ vì phần giữa các tế bào cả ở bên trong và bên ngoài

cumulus giảm (Leibfried và First, 1979; De Loos và cs., 1989). Một số nghiên

cứu đã đánh giá mức độ chặt chẽ hình thái cumulus sau khi phát triển (Younis

và cs., 1989; Gordon và Lu, 1990; De Loos và cs., 1991; Lonergan, 1992).

Khi tế bào trứng chưa trưởng thành được phân loại dựa vào số lượng màng

cumulus bao quanh tế bào trứng sau khi hút ra, cumulus có độ dày nhiều hơn

cho sự phát triển tốt hơn (Lonergan, 1992). Số lượng màng cumulus giảm có

thể do quá trình hút tế bào trứng và cũng có thể giảm số lượng màng cumulus

do quá trình thoái hóa sớm của nang trứng. Có một mối quan hệ quan sát

được giữa sự thoái hóa của cumulus và sự thoái hóa của nang trứng (Blondin

và Sirard, 1995). Có nhiều cumulus chặt chẽ là nguồn gốc nang trứng khỏe

hơn so với nang trứng thoái hóa. Sự có mặt của tế bào cumulus trong thời

gian thành thục là cần thiết cho hầu hết các tế bào trứng để tăng nhanh khả

năng phát triển (Sirard và cs., 1988).

Ở bò tác động làm giảm màng cumulus trước khi nuôi chín in vitro làm

ảnh hưởng đến khả năng thành thục của tế nào trứng (Fukui và Sakuma,

1980). Các tế bào trứng không có màng cumulus không có khả năng thụ tinh

(Van Soom và cs., 2002). Các tế bào cumulus đóng vai trò quan trọng trong

sự thành thục của tế bào trứng: Kìm hãm quá trình giảm phân của tế bào

trứng, hồi phục của quá trình giảm phân và hỗ trợ sự trưởng thành của tế bào

chất.

1.6.2.3. Tế bào chất

Bên cạnh màng cumulus, chất lượng của tế bào chất cũng ảnh hưởng

đến tỉ lệ phát triển của tế bào trứng, sự phát triển của hợp tử đến giai đoạn

phôi dâu và phôi nang (Goovaerts và cs., 2010). Sự đồng nhất được đánh giá

dưới kính hiển vi soi nổi, là phương pháp phổ biến nhất để phân loại chất

lượng tế bào trứng (Bảng 1.3).

Ngoài ra, một số tác giả đã sử dụng phương pháp nhuộm Brilliant

Cresyl Blue (Rodriguez-Gonzalez và cs., 2002; Manjunatha và cs., 2008) để

đánh giá sự phát triển của của tế bào chất. Nhuộm Brilliant Cresyl Blue không

làm tổn thương đến tế bào. Cơ sở để đánh giá là dựa vào mức độ hoạt động

của G6PDH (Glucose-6-phosphate-Dehydrogenase). G6PDH là protein được

tổng hợp trong tế bào trứng chưa thành thục, làm đổi màu của Brilliant Cresyl

Blue thành chất không màu. G6PDH là một enzym chứa đường đơn đóng vai

trò cung cấp năng lượng cho tế bào, đặc biệt là hoạt động trong sự phát triển

của tế bào trứng và giảm hoàn toàn hoạt động này khi tế bào trứng kết thúc

giai đoạn phát triển. Khi G6PDH hoạt động thuốc nhuộm Brilliant Cresyl

Blue bị giảm màu, do đó có thể xác định được hoạt động bên trong tế bào của

G6PDH. Các tế bào trứng đã thành thục hoàn toàn hoạt động của G6PDH

giảm, tế bào chất được nhuộm Brilliant Cresyl Blue sẽ có màu xanh và khi

các tế bào trứng đang ở giai đoạn phát triển tế bào chất được nhuộm Brilliant

Cresyl Blue sẽ không có màu. Kết quả nghiên cứu của các tác giả cho thấy,

các tế bào trứng xuất hiện màu xanh có kích thước tế bào trứng lớn hơn, khả

năng phát triển tốt hơn, sau khi nuôi thành thục tỉ lệ tế bào trứng phát triển

đến giai đoạn metapha II cao hơn và tỉ lệ tế bào trứng phát triển đến giai đoạn

phôi nang sau khi thụ tinh cao hơn.

Ảnh hưởng của khối tế bào chất lên chất lượng tế bào trứng và khả

năng phát triển cũng được quan tâm nghiên cứu (Nagano và cs., 2007). Kết

quả nghiên cứu cho thấy chất lượng bên trong của tế bào trứng là yếu tố chìa

khóa để xác định khả năng phát triển đến giai đoạn phôi nang. Một thay đổi

nhỏ về siêu cấu trúc xảy ra khi tế bào trứng phát triển đều có sự liên quan chặt

chẽ với khả năng phát triển. Sự liên quan giữa khả năng phát triển của tế bào

trứng và vi cấu trúc của khối tế bào chất đặc điểm dưới kính hiển vi thành 7

nhóm khác nhau (Bảng 1.3)

Nhóm tế

Các đặc điểm của tế bào chất

Khả năng

bào trứng

phát triển

Màu nâu và đồng nhất

1

Tốt

Màu nâu và đồng nhất, có màu đen ở khu vực ngoài

2

Tốt

Màu nâu và đồng nhất, có các đám đen

3

Tốt

Nhợt nhạt và đồng nhất

4

Kém

Nhợt nhạt và đồng nhất, có các đám đen

5

Kém

Đen và đồng nhất

6

Kém

Tế bào chất biến đổi và kích thước của tế bào trứng < 115µm

7

Kém

Bảng 1.5. Mối quan hệ giữa đặc điểm tế bào chất và chất lượng tế bào trứng

Tế bào chất đóng vai trò quan trọng trong khả năng sinh sản của tế bào

mầm, điều tiết quá trình giảm phân và cũng là yếu tố làm rối loạn quá trình

sinh sản. Tế bào trứng có số lượng lớn các tế bào chất chứa rất nhiều protein

và cơ quan tế bào, ti lạp thể, các cơ quan tế bào chất mang thông tin di truyền.

Tế bào chất của tế bào trứng liên quan đến sự thành công của quá trình thụ

tinh in vitro.

1.6.2.4. Môi trường nuôi

Môi trường sử dụng để nuôi thành thục tế bào trứng không những ảnh

hưởng đến sự thành thục của tế bào trứng mà còn có thể ảnh hưởng rất lớn

khả năng thụ tinh và sự phát triển của phôi về sau (Rose và Bavister, 1992).

Có nhiều loại môi trường được sử dụng để nuôi thành thục tế bào trứng, từ

các môi trường có chức năng sinh lý đơn giản đến môi trường phức tạp có

chứa các amino axít, các vitamin, purine và các hợp chất quan trọng để nuôi

tế bào trứng. Tỉ lệ thành thục của nhân có thể thu được ở hầu hết các môi

trường, nhưng môi trường TCM-199 được sử dụng rộng rãi nhất để nuôi

thành thục tế bào trứng bò (Smetanina và cs., 2000; Mao và cs., 2002). Môi

trường TCM-199 với các bicacbonat hoặc HEPES, bổ sung các loại huyết

thanh khác nhau và các gonadotropin (như FSH và LH) hoặc các steroid

hormone (như estradiol-17β) được sử dụng phổ biến nhất để nuôi thành thục

tế bào trứng bò và thu được sự thành công khi nuôi thành thục tế bào trứng,

thụ tinh và nuôi phôi in vitro.

Một số loại môi trường trên thị trường như Ham’s F-12 hay

Weymouth’s medium MB 752/1 cho thấy kết quả thụ tinh và sự phát triển của

phôi giảm đáng kể so với môi trường TCM-199 hay MEM (Rose và Bavister,

1992). Lý do cơ bản để lựa chọn một môi trường thích hợp xuất phát từ các

phương pháp nuôi các loại tế bào khác nhau hoặc từ các thử nghiệm. Xác định

các nhu cầu trao đổi chất và các điều kiện nuôi tối ưu được quan tâm nhiều

hơn. Các nghiên cứu cho thấy rằng, không có sự khác nhau đáng kể giữa các

môi trường TCM-199, Menezo’s B2, CRlaa, môi trường Colorado và môi

trường dịch ống dẫn trứng tổng hợp lên nuôi thành thục (Arlotto và cs., 1999).

Sirard và Coenon (1993) cũng cho thấy không có sự khác nhau giữa môi

trường nuôi thành thục tế bào trứng TCM - 199 và môi trường dịch ống dẫn

trứng tổng hợp. Tuy nhiên môi trường nuôi thành thục tế bào trứng TCM-199

lại tốt hơn Ham’s F-10 (Bavister và cs., 1992; Pawshe và cs., 1996;

Smetanina và cs., 2000).

1.6.2.5. Hormone và huyết thanh

Các nang trứng sắp rụng ở bò cho thấy, có sự thay đổi về môi trường

của các gonadotropin, steroid, các yếu tố phát triển và các loại tế bào khác.

Các yếu tố này hoạt động riêng biệt hay có sự phôi hợp với nhau có thể ảnh

hưởng đến sự thành thục tế bào chất của tế bào trứng. Để đạt được sự thành

thục đầy đủ in vitro của tế bào trứng, một số yếu tố quan trọng như: Bổ sung

các loại hormone, các yếu tố phát triển và huyết thanh vào môi trường nuôi

được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Hầu hết các

nghiên cứu nuôi thành thục tế bào trứng đều sử dụng môi trường cơ bản bổ

sung huyết thanh hoặc albumin kết tinh. Huyết thanh thai bê, huyết thanh bò

động dục và albumin huyết thanh bò đều cho thấy kết quả tốt. Bổ sung protein

vào môi trường nuôi thành thục tế bào trứng có thể ảnh hưởng rất lớn đến tỉ lệ

kết quả của toàn bộ kỹ thuật (Ali và cs., 2004). Huyết thanh thai bê hỗ trợ tỉ lệ

thành thục của nhân tế bào trứng bò tốt hơn albumin huyết thanh bò

(Leibfried và Rutledge và cs., 1989). Huyết thanh bò động dục có khả năng

nâng cao tỉ lệ phát triển và thụ tinh in vitro của tế bào trứng bò (Sanbuissho

và Threfall, 1985).

Huyết thanh bò động dục cho kết quả nuôi thành thục và thụ tinh in

vitro tốt hơn huyết thanh thai bê (Schellander và cs., 1990) và huyết thanh bò

ở thời điểm bắt đầu động dục tốt hơn huyết thanh bò sau khi động dục

(Sanbuissho và Threfall, 1985). Bên cạnh ảnh hưởng của các huyết thanh lên

sự thành thục của tế bào trứng thì sự có mặt của LH, FSH và estradiol 17β

trong môi trường nuôi làm tăng sự thành thục của tế bào trứng và sự phát triển

của phôi sau khi thụ tinh in vitro (Brackett và Oliphan, 1975). Song Fukui

(1989) lại cho thấy, không có sự ảnh hưởng của hormone lên sự thành thục

của tế bào trứng và khả năng phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang.

1.7. Tạo phôi In vitro

1.7.1. Thụ tinh in vitro

Để tạo phôi in vitro, các tế bào trứng sau khi nuôi thành thục được tiến

hành thụ tinh in vitro với tinh trùng đã được hoạt hóa. Những nghiên cứu đầu

tiên để sản xuất phôi bò in vitro cho thấy, phôi thụ tinh in vitro có thể phát

triển đến giai đoạn phôi nang và có thể sống được trong tử cung (Sirard và cs.,

1988). Tuy nhiên vẫn có nhiều báo cáo cho thấy, có một số vấn đề không bình

thường về siêu cấu trúc ở phôi được nuôi thành thục và thụ tinh in vitro so với

phôi thành thục và thụ tinh in vivo. Những bất thường thường thấy như chậm

phát triển và sự phát triển không bình thường của tiền nhân, đa tinh trùng.

Chính vì vậy các nhà khoa học trên thế giới không ngừng nghiên cứu về

phương pháp thụ tinh in vitro và đặc biệt là nghiên cứu về môi trường nuôi

thành thục tế bào trứng, môi trường thụ tinh và môi trường nuôi phôi.

Môi trường Tyrodes Albumin Lactate Pyruvate Medium (Fert-TALP)

thường được dùng để thụ tinh bò in vitro (Bavister, 1996). Tuy nhiên sự thay

đổi môi trường như SOF, CR1aa và Defined Medium (Brackett và Oliphant,

1975) đã được sử dụng thành công trong thụ tinh bò in vitro.

Tế bào trứng bò có khả năng duy trì sự thụ tinh trong khoảng thời gian

20 - 24 h sau khi rụng khỏi nang trứng. Sự thâm nhập của tinh trùng vào tế

bào trứng in vitro ở khoảng thời gian 3 h sau khi thụ tinh và tiếp tục thâm

nhập vào tế bào trứng cho đến 24 h sau khi thụ tinh. Tế bào trứng bò thường

được ủ với tinh trùng đã được hoạt hóa và tính tỉ lệ tinh trùng thích hợp ở nhiệt độ 390C, CO2 5% và độ ẩm không khí tối đa. Tế bào trứng bò được thụ

tinh ở giai đoạn pha giữa II của thời kỳ phân bào quyết định khả năng phát

triển của phôi. Tế bào trứng được thụ tinh vào khoảng thời gian 8h sau khi đạt

đến pha giữa II của thời kỳ phân bào có khả năng phát triển cao hơn các tế

bào trứng được thụ tinh ngay khi phát triển đến gia đoạn pha giữa II của thời

kỳ phân bào. Điều này cho thấy khả năng hỗ trợ quá trình thụ tinh và phát

triển của phôi về sau của tế bào trứng liên quan đến sự thành thục của nhân.

Để quá trình thụ tinh xảy ra, tinh trùng bò cần phải được hoạt hóa. Tinh

trùng của động vật có vú có khả năng xâm nhập vào tế bào trứng thành thục

chỉ sau khi chúng có một thời gian di chuyển ở trong đường sinh dục cái

(Austin, 1951; Chang, 1951), đây cũng là khái niệm đầu tiên về hoạt hóa tinh

trùng (Capacitation). Và hiện nay quá trình hoạt hóa tinh trùng đã được hiểu

một cách đầy đủ, là quá trình mà ở đó tinh trùng diễn ra một loạt các phản

ứng sinh hóa và sinh lý phức tạp trước khi có khả năng thụ tinh với tế bào

trứng thành thục. Người ta cho rằng các giai đoạn đầu tiên của hoạt hóa có

liên quan đến việc loại bỏ và thay thế các thành phần có nguồn gốc từ ống

sinh tinh, dịch hoàn phụ, ống dẫn tinh và tinh thanh. Trong đó khái niệm của

Furuya và cs. (1992) nói đến tầm quan trọng của acrosome, với ống hoạt hóa

là một chuỗi thay đổi sinh hóa mà những thay đổi đó làm cho tinh trùng có

thể diễn ra phản ứng acrosome khi tiếp xúc với màng trong suốt, mà màng

trong suốt dường như là tác nhân sinh lý gây nên phản ứng đó. Ở bò, dựa vào

sự xâm nhập của tinh trùng đầu tiên vào tế bào trứng sau khi thụ tinh nhân

tạo, Hunter (1985) cho biết thời gian cần cho hoạt hóa của tinh trùng trong

đường sinh dục cái khoảng 6 h. Nhưng cũng đã có nhiều dẫn chứng cho thấy

ống dẫn trứng bò có thể đóng vai trò quyết định trong quá trình hoạt hóa tinh

trùng bằng việc cung cấp một môi trường có chức năng thúc đẩy cả quá trình

hoạt hóa và thụ tinh. Có chứng cứ cho rằng các tế bào ống dẫn trứng bò phân

tiết các yếu tố mà các yếu tố đó có khả năng hỗ trợ và duy trì hoạt lực và khả

năng sống của tinh trùng đến 30 h trong ống nghiệm (theo Ijaz và cs., 1994).

Hiện nay có nhiều phương pháp hoạt hóa tinh trùng nhân tạo được

nhiều tác giả nghiên cứu, nhằm kích thích các quá trình xảy ra trong ống

nghiệm cũng tương tự như trong đường sinh dục bò cái.

- Phương pháp thay đổi áp suất thẩm thấu và pH của môi trường: Sử

dụng môi trường ưu trương (hypertonic) có áp suất thẩm thấu 380 mosm.

(Brackett và Oliphant, 1975). Song Bondioli và Wright. (1983) lại sử dụng áp

suất thẩm thấu 290 mosm cũng có hiệu quả tương tự, dựa vào sự xâm nhập

của tinh trùng vào tế bào trứng. Tinh trùng được ủ trong tủ ấm 14 - 18 h ở nhiệt độ 20o C, được rửa một lần để loại bỏ giảm các yếu tố bên ngoài, thay

đổi màng tinh thanh và cho vào môi trường đẳng trương để trong tủ ấm 8 h.

- Phương pháp sử dụng Albumin huyết thanh bò và dịch nang trứng:

Tinh trùng bò được tiếp xúc với huyết thanh bò trong một dung dịch muối

sinh lý phù hợp có thể hoạt hóa trong ống nghiệm và huyết thanh bò cũng

được sử dụng thường xuyên trong môi trường nuôi dùng trong TTON. Theo

Downs và Bavister (1989), cho thấy albumin huyết thanh bò có thể đóng một

vai trò quan trọng trong việc loại bỏ cholesterol và kẽm (2 chất ổn định màng

tế bào) khỏi màng tế bào tinh trùng khi hoạt hóa.

- Phương pháp dùng canxi ionophore (A23187): Đây là phương pháp

giúp tinh trùng vượt qua giai đoạn đầu của quá trình hoạt hóa bằng cách tăng

trực tiếp lượng Ca của tế bào và gây phản ứng (Hanada, 1985). Xử lý bằng

ionophore cũng làm tăng hoạt động hô hấp của tinh trùng bò.

- Sử dụng Heparin và các loại glycosaminoglycan khác, trong đó sử

dụng Heparin là phương pháp được chú ý nhất.

1.7.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh của tế bào trứng

Môi trường nuôi thành thục, bổ sung thêm các thành phần, xử lý tinh

trùng, mật độ tinh trùng, thời gian tiếp cận giữa tinh trùng và trứng, môi

trường được sử dụng và các điều kiện nuôi đóng vai trò quan trọng trong sự

thành công của quá trình thụ tinh và khả năng phát triển của hợp tử. Sự thành

công của quá trình thụ tinh, đòi hỏi sự chuẩn bị tinh trùng và tế bào trứng

thích hợp cũng như các điều kiện nuôi thuận lợi cho quá trình hoạt động trao

đổi chất của giao tử đực và giao tử cái. Tinh trùng đủ về số lượng được cho

vào môi trường thụ tinh có chứa heparin và được ủ với tế bào trứng trong

khoảng thời gian tối ưu để thụ tinh.

Phương pháp chuẩn bị tinh trùng, số lượng tinh trùng, bổ sung hàm

lượng heparin thích hợp và thời gian ủ tinh trùng với tế bào trứng có thể ảnh

hưởng đến kết quả thụ tinh in vitro.

1.7.2.1. Số lượng tinh trùng

Hầu hết kỹ thuật thụ tinh in vitro sử dụng mật độ tinh trùng khoảng 1 x 106 ml và quá trình thụ tinh hầu hết được tiến hành trong giọt môi trường thụ

tinh 50 - 500 µl có chứa 5 - 40 tế bào trứng trong mỗi giọt và được phủ một

lớp dầu khoáng. Tăng mật độ tinh trùng có thể làm tăng tỉ lệ phân chia, song

lại có ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của phôi sau này. Nếu mật độ tinh trùng vượt quá 1,6 x 106/ml (Ling và Lu, 1990). Một số tác giả khác công bố

rằng mật độ tinh trùng tối ưu với tỉ lệ tế bào trứng là 2000 khi sử dụng giọt thụ tinh 200 µl và mật độ tinh trùng là 2,5 x 106/ml (Heres và cs., 1996). Saeki và cs. (1995) cho rằng tăng mật độ tinh trùng 1 x 104/ml lên 1 x 106/ml

làm tăng khả năng thụ tinh khi bổ sung hoặc không bổ sung huyết thanh bò.

Song để đạt được tỉ lệ phân chia và sự hình thành phôi dâu và phôi nang tốt

nhất, mật độ tinh trùng sử dụng để thụ tinh in vitro có sự khác nhau giữa các

con đực (Lu và Seidal, 2004).

1.7.2.2. Thời gian thụ tinh giữa trứng và tinh trùng

Quá trình thụ tinh thành công đóng vai trò quan trọng trong sản xuất

phôi in vitro. Trong tự nhiên sự có mặt của tinh trùng vào thời điểm thụ tinh

là rất ít. Thụ tinh in vitro tỉ lệ tinh trùng với trứng và thời gian nuôi 10.000 -

200.000/tế bào trứng và thời gian thụ tinh 16 - 24 h (Lambert và cs., 1983).

Tế bào trứng được ủ với một số lượng lớn tinh trùng trong một lượng nhỏ môi

trường cho thấy các enzyme thủy phân có thể có hại ảnh hưởng đến khả năng

phát triển của tế bào trứng. Do vậy, một thời gian tối thiểu để đạt được sự thụ

tinh tối ưu là sự mong muốn. Kochhar và cs. (2003) thấy rằng thời gian ủ tinh

trùng và trứng trong khoảng thời gian 6 h cho tỉ lệ phát triển của hợp tử đến

giai đoạn phôi nang cao nhất khi dùng tinh của các con đực khác nhau. Tỉ lệ

thụ tinh cao đạt được khi ủ tinh trùng với tế bào trứng 20, 24 hay 28h cao hơn

thời gian ủ 4, 8 và 16 h (Rehman và cs., 1994). Ngược lại Fukui và cs. (1990)

thấy rằng liều heparin tối ưu làm cho tinh trùng bò có khả năng thụ tinh dao

động từ 25 - 100 µg/ml, với thời gian tốt nhất là 5 - 6 phút. Dựa vào thời gian

thụ tinh cần thiết để tinh trùng có khả năng thụ tinh trong đường sinh dục cái

cho thấy, thời gian ủ tinh trùng và tế bào trứng 6h là tốt nhất (Danila, 2000)

và hiện nay hầu hết các nhà nghiên cứu trên thể giới cũng như ở nước ta sử

dụng thời gian là 5h khi thụ tinh in vitro.

1.7.2.3. Hàm lượng heparin trong môi trường thụ tinh

Heparin tương tự như glycosaminoglycan trong cơ quan sinh dục của

bò, thúc đẩy sự không ổn định của các màng tế bào do vậy ảnh hưởng đến khả

năng thụ tinh của tinh trùng (Miller và Ax, 1990). Glycosaminoglycans có cấu

trúc phức tạp, bao gồm: Heparin, heparan sulphat, chondroitin sulphat,

dermatan sulphat, hyaluronic axít và keratan sulphat.Trong thụ tinh ống

nghiệm, glycosaminoglycan là một tác nhân hiệu quả, giúp hoạt hóa tinh

trùng, trong tự nhiên nó tồn tại rất nhiều trong nang trứng bò và được giải

phóng khi trứng vỡ và rụng vào loa kèn hay phễu của ống dẫn trứng. Ngoài ra

glycosaminoglycan còn được tìm thấy trên toàn bộ đường sinh dục cái và

được coi là thúc đẩy hoạt động của các hormone steroid buồng trứng.

Các thí nghiệm ủ tế bào trứng thành thục với tinh trùng trong môi

trường BO chứa 20mg huyết thanh bò, 5 mM caffeine và 10 µg heparin/ml

cho thấy sự kết hợp giữa heparin và caffeine làm tăng tỉ lệ xâm nhập lên 68%.

Heparin có khả năng giống như glycosaminoglycan, có khả năng thực hiện

quá trình phản ứng acrosome (Handrow và cs., 1982). Tanghe và cs. (2004);

Mendes và cs. (2003) kết luận rằng, không có heparin trong môi trường thì

quá trình thụ tinh in vitro không xảy ra, sự có mặt của heparin làm tăng tỉ lệ

phân chia. Parrish và First (1984), đã sử dụng phương pháp xử lý tinh trùng ở

nồng độ heparin (10µg/ml) để ủ tinh trùng tươi của bò trong tủ ấm 4 h và với

tinh đông lạnh-giải đông là 0,5 h làm tăng đáng kể tỉ lệ thụ tinh. Nồng độ

heparin dùng cho hoạt hóa tinh trùng là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến quá

trình thụ tinh trong ống nghiệm của bò và sau đó là sự phát triển của phôi.

Hàm lượng heparin có sự khác nhau giữa các tác giả. Hàm lượng

heparin 20 µg/ml môi trường thụ tinh (Camargo và cs., 2006). Fukui và cs.

(1990) thấy rằng liều lượng heparine là 25 - 100 µg/ml với thời gian ủ thích

hợp là 5 - 60 phút. Liều lượng heparine đến kết quả thụ tinh in vitro còn có sự

khác nhau giữa tinh được khai thác từ các con đực khác nhau. Như vậy có sự

biến động về sự báo cáo của các tác giả, song rõ ràng là heparine có ảnh

hưởng đến tỉ lệ thụ tinh ở bò.

1.8. Nuôi phôi In vitro

1.8.1. Môi trường nuôi phôi

Tế bào trứng sau khi được thụ tinh trong 5h, các tế bào trứng được rửa

trong môi trường rửa, để loại màng cumulus và tinh trùng. Sau khi rửa, các tế

bào trứng hay hợp tử giả định tiếp tục được nuôi trong môi trường nuôi phôi.

Để đảm bảo cho quá trình phát triển của phôi, từ năm 1960, các nhà nghiên

cứu đã sử dụng nhiều loại môi trường nuôi khác nhau để nuôi phôi và hầu hết

các loại môi trường đều dựa vào các chất có trong ống dẫn trứng, nhiều loại tế

bào soma và dựa vào những hiểu biết về quá trình trao đổi chất của phôi. Thời

gian nuôi phôi in vitro thường dừng lại khi phôi phát triển đến giai đoạn phôi

dâu hoặc phôi nang. Môi trường sau khi thụ tinh đóng vai trò then chốt quyết

định chất lượng của phôi nếu chất lượng tế bào trứng tốt (Lonergan và cs.,

2003). Có một số giai đoạn quan trọng trong giai đoạn phát triển của nuôi

phôi in vitro như: Các giai đoạn phân chia đầu tiên, sự hình thành phôi dâu và

phôi nang (Sagirkaya, 2006). Giai đoạn nuôi làm cho một lượng lớn phôi bị

thoái hóa, do vậy tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang chỉ

đạt khoảng 40 % (Kane, 2003).

Có hai loại chính của hệ thống nuôi in vitro: Các hệ thống nuôi kết hợp

(co-culture systems) và môi trường tế bào tự do (Cell-free media). Các hệ

thống nuôi kết hợp được phát triển đầu tiên, trong môi trường nuôi thường

chứa các tế bào biểu mô ống dẫn trứng và một lượng lớn huyết thanh. Ở nước

ta, Nguyễn Hữu Đức và cs. (2003) đã nuôi hợp tử trong môi trường B2 có bổ

sung tế bào vero, tỉ lệ hợp tử phân chia đạt 72,96% và tỉ lệ phôi nang quan sát

được là 25,88%. Ngoài ra các nhà khoa học còn sử dụng các tế bào biểu mô

ống dẫn trứng và các tế bào hạt (Kane, 2003) để bổ sung vào môi trường nuôi.

Các vấn đề vấn hạn chế là các hệ thống này phức tạp và tốn nhiều thời gian để

chuẩn bị, nhưng các nghiên cứu cho thấy, hầu hết các thành phần trong hệ

thống môi trường này không làm ảnh hưởng đến kết quả sản xuất phôi

(Hoshi, 2003). Để bù đắp những khiếm khuyết này có rất nhiều nghiên cứu

theo hướng sử dụng môi trường Semi-define cell free culture media. Có một

số thành phần chính được sử dụng cho môi trường nuôi nhưng có lẽ thành

phần phổ biến nhất là dịch ống dẫn trứng nhân tạo (SOF). Môi trường semi-

define media thường bổ sung một số lượng huyết thanh, như huyết thanh bê

và nuôi trong điều kiện oxy thấp (Galli, 2003).

1.8.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của phôi

1.8.2.1. Chất lượng hợp tử

Những tế bào trứng có chất lượng A, B hay loại 1 và loại 2, được nuôi

thành thục và cho thụ tinh với tinh trùng. Đánh giá chất lượng hợp tử thường

được thực hiện 16 - 18 h sau khi tế bào trứng được thụ tinh in vitro nhằm xác

định được khả năng phát triển của hợp tử về sau. Chất lượng hợp tử thường

được đánh giá dựa và tiền nhân và hạch nhân. Van Blerkom. (1990) là người

phát hiện ra sự đối xứng và kích thước của tiền nhân, số lượng và vị trí của

hạch nhân có sự liên quan mật thiết đến tỉ lệ có chửa. Scott và cs. (2000) dựa

vào số lượng và sự phân bố của hạch nhân trong tiền nhân để phân loại tốt

xấu theo thứ tự từ 1 đến 4, căn cứ vào kích thước nhân, sự liên kết của nhân,

sự liên kết của hạch nhân, sự phân bố và vị trí của nhân trong hợp tử như sau:

1) Có tiền nhân bằng nhau. Số lượng và kích thước của hạch nhân bằng nhau,

có sự liên kết của hai tiền nhân ở chỗ nối của tiền nhân. Số lượng tối đa của

hạch nhân dao động từ 3 – 7; 2) Có số lượng tiền nhân bằng nhau. Số lượng

và kích thước của hạch nhân bằng nhau, nằm rải rác ở cả 2 tiền nhân. Số

lượng tối đa của hạch nhân dao động từ 3 – 7; 3) Có tiền nhân bằng nhau. Số

lượng hạch nhân bằng nhau, kích thước của hạch nhân không đồng đều. Các

tiền nhân khác có các hạch nhân nằm rải rác ngẫu nhiên. Số lượng tối đa của

hạch nhân khoảng từ 3 – 7; 4) Có tiền nhân không bằng nhau hoặc tách rời.

Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi và có rất nhiều báo cáo xác định

rằng là phương pháp có hiệu quả để lựa chọn được hợp tử có chất lượng tốt, tỉ

lệ có chửa cao (Hình 1.6). Theo Munne và Cohen. (1998; Manor và cs.,

1999), sự phân chia hợp tử ở loại 1 và loại 2 thường có sản lượng phôi về sau

thu được tốt. Ngoài ra, khi cấy chuyển những phôi này cho bò nhận phôi cho

tỉ lệ có chửa cao hơn. Mặt khác, loại 3 hợp tử phát triển thành phôi có chất

lượng kém hơn và khả năng cấy thấp hơn. Hợp tử ở mức độ loại 4 rất thường

xuyên bị ảnh hưởng bởi sự bất thường của nhiễm sắc thể và thể dị bội, vì vậy

Loại 1 Loại 2 Loại 3

phôi đó không nên cấy và sử dụng cho mục đích sinh sản.

Loại 4

Hình 1.7. Phân chia chất lượng hợp tử (Nguồn: Scott và cs., 2000)

Tesarik và cs. (1999) cũng đánh giá chất lượng hợp tử vào khoảng thời

gian 16 - 18 giờ sau khi thụ tinh, dựa vào đặc điểm của tiền nhân và hạch

nhân. Tiền nhân có kích thước và số lượng cân đối. Hạch nhân có kích thước

và số lượng bằng nhau. Có sự xuất hiện của tế bào chất. Các hợp tử được

phân thành sáu mức độ. Theo ông, ở mức độ 0 tương ứng với các hợp tử bình

thường và mức độ 1-5 đại diện cho thay đổi bất thường của hình thái hợp tử.

Sự xuất hiện thể cực thứ hai và tế bào chất cũng đóng vai trò quan

trọng khi đánh giá chất lượng phôi. Sự phân cực của tế bào trứng là tiền đề để

xác định chính xác vị trí trên trục kéo dài của tiền nhân, xác định các chức

năng khác nhau của hai cực hợp tử. Sự sắp xếp lại của các cơ quan tế bào ảnh

hưởng đến tương lai của phôi bào khi hợp tử phân chia. Quầng sáng và các

quầng quanh tiền nhân là dấu hiệu của sự phân cực hợp tử. Các bất thường

trong mối quan hệ không gian giữa tiền nhân và thể cực là những dấu hiệu

liên quan đến rối loạn phân chia sắp xảy ra. Thường các hợp tử có hai cực

không bằng nhau thì có sự phân chia chậm hơn (Hình 1.7). Phôi kém chất

lượng và giảm tốc độ tăng trưởng (Garello và cs., 1999).

Thể cực

Tiền nhân

Các hạch nhân

Hợp tử có hai thể cực bằng nhau Hợp tử có hai thể cực bằng nhau

Hình 1.8. Hợp tử (Nguồn: Scott và cs., 2000)

1.8.2.2. Chất lượng phôi ở giai đoạn phân chia

Đánh giá chất lượng phôi ở giai đoạn phân chia được thực hiện trong

khoảng thời gian 24 - 48 giờ sau khi thụ tinh, khi xuất hiện sự phân chia đầu

tiên của tế bào phôi để đánh giá và tìm ra những phôi có khả năng phát triển

và phôi có chất lượng tốt. Ziebe và cs. (1997) đánh giá chất lượng phôi ở giai

đoạn đầu dựa vào sự cân đối và mức độ tách rời của tế bào phôi. Phôi có chất

lượng tốt là những phôi có hai tế bào phôi cân đối và có sự liên kết chặt chẽ.

Những phôi có phân chia đầu tiên của tế bào phôi 24 - 28 giờ sau khi thụ

tinh, thường có tỉ lệ đậu thai thấp, ngay cả các phôi với hình thái tốt vào thời

điểm cấy.

Tỉ lệ phát triển của phôi (phân chia) được đánh giá trong nhiều nghiên

cứu. Gần như chắc chắn rằng số lượng tế bào phôi cao cho thấy tỉ lệ đậu thai

cao hơn. Tần số phân chia liên quan đến khả năng phát triển của phôi. Những

phôi có từ bốn tế bào phôi trở xuống vào ngày thứ 3 sau khi thụ tinh, cho

thấy khả năng phát triển rất thấp và tỉ lệ có chửa của phôi này sau khi cấy là

rất thấp. Phôi chất lượng tốt phải có ít nhất 4 tế bào vào ngày thứ hai và ít

nhất 8 tế bào vào ngày thứ ba sau khi thụ tinh .

Các lần đánh giá chất lượng phôi ở giai đoạn đầu vào khoảng thời gian

40-44 giờ và 64 - 68 giờ sau khi thụ tinh là tốt nhất. Phôi được chia thành các

nhóm, tùy thuộc vào một số đặc điểm về hình thái học. Bên cạnh số lượng tế

bào, sự xuất hiện của tế bào chất không bình thường hoặc các mảnh tế bào rời

rạc là những đặc điểm thường được sử dụng để đánh giá. Như vậy, để đạt

được hiệu quả cao trong quá trong quá trình sản xuất phôi, cấy phôi cho bò

nhận việc đánh giá chất lượng hợp tử, phôi đóng vai trò hết sức quan trọng.

1.9. Ảnh hưởng của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng đến kết quả nuôi

thành thục, thụ tinh và tạo phôi in vitro

Kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng đã mở ra một bước ngoặt mới trong

quá trình sản xuất phôi in vitro. Việc thu tế bào trứng từ bò sống cho phép

chúng ta có thể lựa chọn năng suất và chất lượng bò cho tế bào trứng. Quá

trình thu tế bào trứng được lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo ra một số lượng lớn

phôi có giá trị di truyền cao trong cùng một đơn vị thời gian và trên cùng một

cá thể. Bên cạnh các ưu điểm trên, chất lượng tế bào trứng và phôi tạo ra cho

kết quả cao hơn so với tế bào trứng được thu từ lò mổ, số lượng phôi thu được

lên đến 4.7 phôi/lần siêu âm hút tế bào trứng và tỉ lệ phôi nang 48 % (Hasler,

2003). Song kết quả nuôi thành thục, thụ tinh và tạo phôi in vitro chịu ảnh

hưởng rất lớn của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng.

Ảnh hưởng của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng đến khả năng thành

thục, quá trình thụ tinh và tạo phôi in vitro liên quan mật thiết đến chất lượng

tế bào trứng. Chất lượng tế bào trứng được thể hiện thông qua chất lượng của

các thành phần cấu tạo nên tế bào trứng như: màng cumulus, tế bào chất, nhân

tế bào và rất nhiều thành phần khác của tế bào trứng. Hình thái học của tế bào

trứng là một trong các cơ sở để chúng ta lựa chọn tế bào trứng trước khi nuôi

thành thục và thụ tinh trong ống nghiệm (Khurana và Niemann, 2000). Song

để hút được các tế bào trứng ra khỏi các nang trứng cần phải hiểu rõ cấu tạo

và chức năng của hệ thống siêu âm hút tế bào trứng và sử dụng tốt từng thiết

bị và công đoạn kỹ thuật. Mỗi một thiết bị trong hệ thống siêu âm đều ảnh

hưởng đến chất lượng tế bào trứng.

Màn hình và đầu dò siêu âm có sự liên quan mật thiết với nhau. Màn

hình máy siêu âm hút tế bào trứng cần phải được điều chỉnh về độ sáng tối và

độ nét phù hợp với từng cá thể và ánh sáng nơi tiến hành siêu âm hút tế bào

trứng. Độ sắc nét cao, khả nang quan sát tế bào trứng càng rõ bấy nhiêu, tăng

khả năng quan sát và chọc hút. Cách cố định, di chuyển buồng trứng ở phía

đầu dò siêu âm cần phải phù hợp với cấu tạo và sự phân bố của các nang

trứng có mặt trên buồng trứng. Kỹ thuật cố định và di chuyển buồng trứng là

yếu tố kỹ thuật rất quan trọng để thu được tối đa số lượng nang trứng có chất

lượng tốt.

Tần suất hút tế bào trứng đóng vai trò quan trọng, liên quan đến số

lượng, kích thước của nang trứng có mặt trên buồng trứng và liên quan đến

pha của sóng nang vào thời điểm siêu âm hút tế bào trứng. Nếu khoảng cách

quá dài sau khi siêu âm hút tế bào trứng, một đợt nang trứng mới lại xuất hiện

(Viana và cs., 2010) và hình thành nên các nang trội, ức chế các nang trứng

còn lại dẫn đến số lượng và chất lượng tế bào trứng bị giảm do hàm lượng

inhibin tăng cao làm ức chế FSH. Song nếu tần suất quá gần nhau làm cho các

nang trứng chưa kịp phát triển đến kích thước ≥ 2mm, ở kích thước này các

nang trứng có khả năng thành thục và phát triển đến giai đoạn phôi dâu và

phôi nang.

Trong kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng, áp lực hút liên quan đến chất

lượng tế bào trứng. Nếu áp lực hút quá yếu, khả năng hút tế bào trứng và dịch

nang trứng ra kém. Mặt khác khi áp lực hút yếu quá trình hút bị chậm lại làm

cho dịch nang trứng sẽ tràn qua lỗ kim đâm, kéo theo một lượng nhất định tế

bào trứng chảy ra ngoài. Nhưng khi sử dụng áp lực hút lớn tế bào trứng sẽ bị

tác động do tốc độ dòng xoáy và tốc độ di chuyển của tế bào trứng làm cho

màng cumulus bị lột trần và các tổ chức bên trong tế bào bị tổn thương làm

giảm khả năng thành thục, thụ tinh và kết quả tạo phôi in vitro.

Có thể nói rằng, để nâng cao được khả năng thành thục, thụ tinh và kết

quả tạo phôi in vitro khi siêu âm hút tế bào trứng cần phải nâng cao được chất

lượng tế bào trứng.

CHƯƠNG 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu

- Bò cho tế bào trứng ở các thí nghiệm là bò sữa HF và bò lai hướng

sữa F3 (Holstein Friesian x Lai Sind), có độ tuổi 3 – 8, đang sinh sản bình

thường điểm thể trạng 2,5 - 3 và không mang thai.

- Tinh cọng rạ sử dụng để thụ tinh in vitro trong các thí nghiệm là bò HF của

cùng một con đực, có năng suất từ 10.000 lít sữa trở lên trong một chu kỳ vắt

sữa, được nhập từ Mỹ, hoạt lực tinh trùng trên 40% và đã được kiểm tra năng

suất qua đời sau.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút.

- Nghiên cứu ảnh hưởng tần suất siêu âm hút tế bào trứng.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nang trứng.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng FSH.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giống bò.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi bò.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ.

2.1.3. Phương pháp nghiên cứu

2.1.3.1. Siêu âm hút tế bào trứng

Trước khi siêu âm hút tế bào trứng, bò cho tế bào trứng được cố định trong giá, lấy hết phân trong trực tràng, rửa sạch và sát khuẩn bằng cồn 700,

gây tê cục bộ bằng cách tiêm 4 - 6 ml lidocain 2% vào khấu đuôi. Siêu âm hút

tế bào trứng được thực hiện bằng màn hình siêu âm (HS-2000, HONDA

Electronics Co., Ltd, Japan) và đầu dò siêu âm có đường dẫn kim hút tế bào

trứng 7,5 MHz (HBV-4710 MV, Fujira In dustry Co., Ltd, Japan). Tất cả các

nang trứng có kích thước 2 mm trở lên được hút bằng máy tạo áp suất (FHK,

Model 4, Tokyo, Japan) được nối với kim hút tế bào trứng một đường dẫn

(dài 55 cm, 18 G, COVA, Missawa Medical Industry Co., Ltd, Japan). Trước

khi hút tế bào trứng, kim được nối với hệ thống ống dẫn, được đổ đầy dịch

hút tế bào trứng mDPBS của Sigma, bổ sung 2% heparin (Aventis Pharma

Ltd, Tokyo, Japan) và 5% huyết thanh bê mới sinh (Wako Pure Chemical

Industries Ltd., Osaka, Japan) và kháng sinh (100.000iu penicilin/ml + 100l

streptomycin/ml). Đồng thời ống dẫn dịch hút tế bào trứng được nối với ống

đựng dịch hút tế bào trứng và dịch nang trứng 50 ml, được giữ trong bình ổn nhiệt (Fujihira industry Co., Ltd, Japan) ở 370 C. Cho đầu dò siêu âm vào vị

trí trong cùng của ngách âm đạo, cố định và đưa buồng trứng sát với đầu dò

siêu âm, dùng kim chọc thủng qua thành âm đạo và chọc thủng nang trứng đã

được xác định, dịch chuyển buồng trứng để hút các nang bên cạch. Hút 3 – 5

hoặc có thể đến 10 nang trứng thì kim được rút ra, cho đầu kim vào ống đựng

dịch hút tế bào trứng để hạn chế sự đông máu làm tắc kim và hệ thống dẫn

dịch. Tiếp tục thao tác lặp đi lặp lại như trên để tiếp tục hút hết các nang trứng

ở cả hai buồng trứng. Sau khi siêu âm hút tế bào trứng xong, dịch nang trứng

được lọc, sử dụng lọc phôi (EMCON, Spring Walley, WI, USA) và tìm phôi

dưới kính hiển vi soi nổi.

2.1.3.2. Đánh giá chất lượng tế bào trứng

Tất cả các tế bào trứng sau khi tìm được, được tiến hành đánh giá phân

loại trên kính hiển vi soi nổi theo phương pháp của tác giả Goodhand và cs.

(2000). Tế bào trứng được chia ra thành 4 loại theo thứ tự từ tốt đến xấu:

- Loại A: Có 4 lớp màng cumulus trở lên, phân bố rõ ràng, liên kết chặt chẽ và

tế bào chất đồng nhất.

- Loại B: Có 1 lớp màng tế bào cumulus trở lên, liên kết chặt chẽ và tế bào

chất đồng nhất.

- Loại C: Một số phần vỏ ngoài tế bào trứng bị lột trần, tế bào chất co lại

không đều.

- Loại D: Tế bào trứng hoàn toàn bị lột trần và tế bào chất co lại không đều.

2.1.3.3. Nuôi thành thục tế bào trứng

Tế bào trứng loại A, B được nuôi thành thục theo quy trình của một số

tác giả đã công bố như Saitoh và cs. (1995), Kajihara và cs. (1999), Numabe

và cs. (2000), Imai và cs. (2006). Các tế bào trứng được rửa một lần trong

môi trường hút tế bào trứng và rửa 2 lần trong môi trường nuôi thành thục tế

bào trứng TCM-199 (GIBCO-BRL, Gland Island, NY, USA) bổ sung 5%

huyết thanh bê mới sinh và kháng sinh. Sau đó 20 tế bào trứng loại A,B được

nuôi 20 đến 22 h trong 100 µl giọt môi trường nuôi TCM-199 (Sigma

Chemical St. Louis, MO, USA) bổ sung 5% huyết thanh bê mới sinh ((Wako

Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) và kháng sinh (100.000iu

penicilin/ml + 100l streptomycin/ml) trong đĩa petri đường kính 35 mm

(Falcol 1008, Becton Dickinson Co. Ltd., Oxnard CA, USA), các giọt nuôi

được phủ dầu khoáng (paraffin oil (Praffin liquid, Nacalai Tesque ICN,

Kyoto, Japan), pH được điều chỉnh ở mức 7,3 - 7,4. Khi số lượng tế bào trứng

nuôi ít hơn 20 tế bào trứng thì theo tỉ lệ cứ một tế bào trứng sử dụng 5µl môi trương nuôi. Quá trình nuôi được duy trì ở nhiệt độ 38,50 C, trong điều kiện

5% CO2 và độ ẩm tối đa.

2.1.3.4. Hoạt hóa tinh trùng

Việc hoạt hóa tinh trùng được thực hiện trong môi trường BO theo một

số tác giả đã công bố như Saitoh và cs. (1995), Kajihara và cs. (1999),

Numabe và cs. (2000), Imai và cs. (2006). Sau khi nuôi thành thục tế bào

trứng được lấy ra khỏi môi trường nuôi thành thục tế bào trứng và rửa trong

môi trường thụ tinh in vitro BO (Brackett and Oliphant), được bổ sung 10

mg/ml Albumin huyết thanh bò (Sigma Chemical St. Louis, MO, USA). Sau

khi rửa, tế bào trứng thành thục được thụ tinh với tinh trùng đã được hoạt hóa.

Hai cọng rạ tinh bò Holstein Friesian 0,25 ml lấy ra khỏi bình ni tơ lỏng, được giải đông trong bình nước ấm 370 C trong trong khoảng thời gian 20 – 30

giây. Cho 6 ml môi trường rửa tinh trùng BO được bổ sung 0,3885 mg/ml

caffeine sodium benzoate (Sigma) và 4 µl/ml novo heparin (Novo Industry,

Japan) vào ống ly tâm có chứa tinh trùng đã được giải đông, trộn đều bằng pipet, ly tâm hai lần 1800 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 370 C. Sau khi

rửa xong, phần lắng dưới ống ly tâm được điều chỉnh mật độ tinh trùng ở mức 12,5 x 106 tinh trùng/ml bằng môi trường BO. Nồng độ cuối cùng sử dụng để thụ tinh được điều chỉnh xuống mật độ 6,25 x 106 tinh trùng/ml bằng môi

trường BO bổ sung 0,3885 mg/ml caffeine sodium benzoate (Sigma), 4 µl/ml

novo heparin (Novo Industry, Japan) và 20 mg/ml albumin huyết thanh bò

(Sigma, USA) theo tỉ lệ thích hợp.

Để thụ tinh in vitro, cho 20 tế bào trứng đã được nuôi thành thục vào 100 µl môi trường có chứa 6, 25 x 106 tinh trùng/ml đã được hoạt hóa trong

đĩa petri đường kính 35 mm (Falcol 1008, Becton Dickinson Co. Ltd., Oxnard

CA, USA) và được giữ trong tủ CO2 (CO2 Incubator, Sanyo, Japan) ở nhiệt độ 38,50 C, trong điều kiện 5% CO2 và độ ẩm tối đa.

2.1.3.5. Nuôi hợp tử và phôi in vitro

Sau khi ủ tinh trùng với tế bào trứng 5 h trong tủ nuôi CO2, các tế bào

trứng (hay có thể gọi là các hợp tử, có sự xuất hiện của thể cực thứ 2) được

tách khối tế bào cumulus, bằng cách hút nhiều lần qua đầu pipet thủy tinh vô

trùng trong môi trường nuôi in vitro và nuôi 20, 25 hay 30 hợp tử giả định

trên trong 7 ngày trong giọt môi trường nuôi CR1aa 100 µl, bổ sung thêm 20

µl axit amin không thay thế (MEM essential amino acid 100x, Sigma), 10 µl

axit amin thay thế (MEM essential amino acid 100x, Sigma), 1mg/ml (L-

glutamic (Sigma), 3mg/ml BSA (Sigma, No-730), 5% huyết thanh bê mới

sinh (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) và kháng sinh

(100.000 iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml). Nếu số lượng tế bào trứng

nuôi ít hơn 20 tế bào trứng thì thể tích mỗi giọt được tính theo tỉ lệ cứ một

hợp tử giả định sử dụng 5µl môi trường CR1aa trên. Các giọt nuôi được phủ

dầu khoáng (Paraffin oil, Wako Pure Chemical, Japan) và quá trình nuôi được

duy trì ở được giữ trong tủ CO2 (CO2 Incubator, Sanyo, Japan) ở nhiệt độ 38,50 C, trong điều kiện 5% CO2 và độ ẩm tối đa. Sau khi nuôi nuôi in vitro

24 - 48 h tiến hành đánh giá sự phân chia của hợp tử.

2.1.3.6. Đánh giá chất lượng phôi dâu và phôi nang

Ở bò, thu hoạch phôi in vitro hoặc phôi in vivo thường ở giai đoạn phôi

dâu và phôi nang, tương ứng với ngày thứ 7 hoặc thứ 8 sau khi thụ tinh.

Phương pháp đánh giá chất lượng đóng vai trò quan trọng trong việc

lựa chọn những phôi có chất lượng tốt để cấy truyền hoặc đông lạnh để đạt

được tối đa tỉ lệ có chửa. Đánh giá và phân loại phôi dâu, phôi nang được

được đánh giá theo 4 mức độ khác nhau, dựa vào giai đoạn phát triển, vòng

trong suốt và khối tế bào chất.

- Loại A (rất tốt): Phôi có hình thái chuẩn đúng với giai đoạn phát triển. Vòng

trong suốt tròn đẹp, khối tế bào đậm phân chia đều, rõ, không có tế bào rời

hoặc mảnh vụn bên ngoài.

- Loại B (tốt): Phôi có hình dáng kích thước tốt, phản ánh đúng giai đoạn phát

triển, nhưng khối tế bào không đẹp, không đều, không rõ nét như loại A. Sự

liên kết của các tế bào tương đối chặt chẽ, đôi khi có mảnh vụn tế bào hoặc tế

bào rời.

- Loại C (trung bình): Phôi có màu sắc phân bố không đều, các tế bào liên kết

lỏng lẻo, nhiều tế bào rời nhiều mảnh vụn xen kẽ hoặc tụ thành đám nhỏ.

Kích thước tế bào nhỏ hơn bình thường. Màng trong suốt có thể còn nguyên

vẹn nhưng nhỏ hoặc không tròn.

- Loại D (loại kém): Phôi phát triển chậm so với tuổi, các tế bào phôi bị vỡ,

màng trong suốt bị khuyết tật, có hình dạng và kích thước không bình thường,

hoặc phôi bị thoái hóa. Đây là loại phôi không đủ tiêu chuẩn cấy cũng như

đông lạnh.

2.1.3.7. Bố trí thí nghiệm

Gồm có 8 thí nghiệm được thực hiện độc lập với nhau, trong suốt thời

gian từ năm 2006 – 2011, để xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến số

lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân

chia, phôi dâu và phôi nang thu được và từ đó xác định được yếu tố thích hợp

cho kết quả tốt nhất khi siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống

nghiệm.

Để hạn chế tối đa sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh làm ảnh hưởng

đến các thí nghiệm. Bò cho tế bào trứng sử dụng trong từng thí nghiệm có

điểm thể trạng, cân nặng tương đối đồng đều. Sử dụng máy siêu âm để xác

định sự đồng đều về hoạt động và kích thước của hai buồng trứng. Được

chăm sóc nuôi dưỡng trong cùng một điều kiện, cho ăn 4 kg thức ăn tinh và

50 kg cỏ tươi/ngày. Bò cho tế bào trứng ở các thí nghiệm không giống nhau.

Trước khi tiến hành thí nghiệm 3 tuần, cứ hai ngày một lần các nang trứng có

kích thước từ 5 mm trở lên được loại bỏ, để loại bỏ sự tồn tại của thể vàng

trên buồng trứng, hạn chế sự tác động của nang trội và đưa hoạt động buồng

trứng của nhóm bò thí nghiệm về pha nang trứng phát triển. Siêu âm hút tế

bào trứng trong tất cả các thí nghiệm được thực hiện bởi một người kỹ thuật.

Nhóm người thực hiện soi tìm tế bào trứng, đánh giá chất lượng tế bào trứng,

nuôi thành thục, thụ tinh và tạo phôi trong từng thí nghiệm hầu như không có

sự thay đổi. Hệ thống máy móc, thiết bị, môi trường,…giống nhau. Các thí

nghiệm được sắp xếp theo tính quan trọng và mức độ sử dụng liên tục trong

quá trình nghiên cứu.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút. Mục đích của

nghiên cứu là đánh giá sự ảnh hưởng của bốn mức độ áp lực hút 60 mmHg,

90 mmHg, 120 mm Hg và 150 mmHg, dựa vào một số tác giả đã công bố

(Pawel và cs., 2007; Bols và cs., 1996) lên số lượng tế bào trứng, chất lượng

tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Thí nghiệm

được tiến hành trên ba bò sữa HF có cùng độ tuổi với nhau (8 tuổi). Siêu âm

hút tế bào trứng được thực hiện với ở tần suất 2 lần/tuần (theo Viana 2004).

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào

trứng. Mục đích của nghiên cứu là đánh giá sự ảnh hưởng của ba tần suất hút:

2 tuần/lần, 1 tuần/lần và ½ tuần/lần lên số lượng nang trứng, số lượng tế bào

trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu

được. Thí nghiệm được tiến hành trên ba bò sữa HF có cùng độ tuổi (5 tuổi),

sử dụng áp lực hút được nghiên cứu ở thí nghiệm 1 (120 mmHg).

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nang trứng được

thực hiện trên hai bò sữa HF (6 tuổi), để đánh giá sự ảnh hưởng của kích

thước nang trứng lên số lượng nang trứng được hút, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Siêu âm hút tế bào trứng

được thực hiện ở áp lực hút 120 mmHg của thí nghiệm 1 và ở tần suất ½

tuần/lần được nghiên cứu ở thí nghiệm 2.

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và

pha nang trứng trội. Mục đích của nghiên cứu là đánh giá sự ảnh hưởng của

pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội lên số lượng nang trứng, số

lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và

phôi nang thu được khi siêu âm hút tế bào trứng không liên tục.

Trước khi siêu âm hút tế bào trứng, tiến hành xác định pha nang trứng

phát triển và pha nang trứng trội của đợt sóng nang. Mười bốn bò thí nghiệm

HF ( 3 – 6 tuổi) được siêu âm và hút loại bỏ tất cả các nang trứng có kích

thước từ 2 mm trở lên (ngày 0). Ngày 1 trở đi xuất hiện một đợt nang trứng

mới, có kích thước từ 2 mm trở lên được huy động, phát triển cho đến khi một

nang trứng phát triển nhanh hơn các nang trứng còn lại gọi là nang trội, nang

trội tiếp tục tăng nhanh về mặt kích thước. Lúc này các nang trứng còn lại

giảm phát triển và ngừng hẳn. Khi các nang trứng còn lại ngừng phát triển thì

từ ngày 0 đến thời điểm này được gọi là pha nang trứng phát triển và từ thời

điểm các nang trứng ngừng phát triển cho đến khi xuất hiện một đợt nang

trứng mới gọi là pha nang trội. Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện ở áp

lực hút 120 mmHg.

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng FSH được tiến

hành trên hai bò HF (3 tuổi), sáu liều lượng FSH (ANTLIN: Denka

Phamaceutical Co., Kawasaki, Japan) được nghiên cứu, bao gồm một liều

lượng đối chứng (không sử dụng FSH) và 5 liều lượng thí nghiệm: 2mg, 3mg,

4mg, 5mg và 6mg. Dựa vào kết quả nghiên cứu của Goodhand và cs. (1999);

Reis và cs. (2002); Chaubal và cs. (2007); De Roover và cs. (2005). Mục đích

của nghiên cứu là đánh giá sự ảnh hưởng của liều lượng FSH lên số lượng

nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia,

phôi dâu và phôi nang thu được. Mỗi một liều lượng FSH được chia làm hai

phần bằng nhau, một phần được tiêm vào buổi sáng và một phần được tiêm

vào buổi chiều (sau ngày hút tế bào trứng). Sau khi tiêm FSH 2 ngày (Khoảng

cách giữa các lần siêu âm hút tế bào trứng là 4 ngày) tiến hành siêu âm hút tế

bào trứng. Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện ở áp lực hút 120 mmHg

và tần suất ½ tuần/lần.

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của giống bò. Nghiên cứu được

tiến hành trên hai bò HF và hai bò lai hướng sữa F3 (HF x lai Sind) ở áp lực

hút 120 mmHg, tần suất 1/2 tuần/lần để đánh giá sự ảnh hưởng của hai giống

bò này lên số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào

trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được.

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi bò. Mục đích của nghiên

cứu là đánh giá ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng lên số lượng nang

trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi

dâu và phôi nang thu được. Thí nghiệm được tiền hành trên bò sữa HF 3 tuổi

và 6 tuổi, ở áp lực hút 120 mmHg, tần suất ½ tuần/lần.

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ. Mục đích của

nghiên cứu là xác định sự ảnh hưởng của vụ đông - xuân và hè - thu lên số

lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân

chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Thí nghiệm được tiến hành tên hai bò

sữa HF (6 tuổi). Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện ở áp lực hút 120

mmHg và tần suất ½ tuần/lần.

2.1.3.8. Xử lý số liệu

Kết quả nghiên cứu của các thí nghiệm về số lượng nang trứng, số

lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và

phôi nang được phân tích, đánh giá sự khác nhau về thống kê giữa các yếu tố

ở các thí nghiệm sử dụng chương trình Paired t-test trong phần mềm minitab,

phiên bản 14. Các giá trị được trình bày dưới dạng X ± SE (X: Bình quân;

SE: Sai số chuẩn).

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ năm 2006 đến năm 2011, tại:

- Bộ môn Sinh lý, Sinh sản và Tập tính vật nuôi - Viện Chăn nuôi.

- Bộ môn Hóa sinh, Sinh lý động vật - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

- Khoa Thú y - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

- Trạm kiểm nghiệm và bảo tồn vật nuôi - Viện Chăn nuôi.

- Các hộ nuôi bò huyện Ba Vì, Hà Nội và huyện Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hưởng của áp lực hút

* Ảnh hưởng của áp lực hút đến số lượng nang trứng được hút và tế bào

trứng thu được

Để đánh giá sự ảnh hưởng của áp lực hút, 72 lượt buồng trứng của bò

sống được siêu âm hút tế bào trứng. Tổng số nang trứng được hút (Bảng 3.1)

ở áp lực 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng: 167,

172, 170 và 178 nang. Tổng số tế bào trứng thu được từ các nang trứng ở áp

lực 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng 54, 75, 138

và 155 tế bào trứng.

Bảng 3.1. Số lượng nang trứng được hút và ảnh hưởng của áp lực hút

Nang trứng được hút

Tế bào trứng thu được

Áp lực hút

%

n

X ± SE

X ± SE

n

60 mmHg

167

9,28a ± 0,52

3,00a ± 0,27

32,34

54

90 mmHg

172

9,56a ± 0,57

4,17b ± 0,35

43,60

75

120 mmHg

170

9,44a ± 0,39

7,67c ± 0,31

81,18

138

155

150 mmHg

178

9,89a ± 0,52

8,61c ± 0,44

87,08

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05%; %: Tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút;

X: Bình quân/buồng trứng/lần

đến số lượng tế bào trứng thu được

Từ kết quả nang trứng được hút cho thấy, số lượng nang trứng được

hút/buồng trứng/lần không có sự khác nhau (P < 0,05) vào thời điểm siêu âm

hút tế bào trứng ở các mức độ áp lực 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mmHg và

150 mmHg, tương ứng: 9,28; 9,56; 9,44 và 9,89 nang. Song lại có sự ảnh

hưởng rõ rệt của áp lực hút đến kết quả tế bào trứng thu được (P < 0,05), có

sự sai khác biệt giữa áp lực 120 và 150 mmHg so với áp lực 60 và 90 mmHg,

tương ứng: 7,67 và 8,61 tế bào trứng/buồng trứng/lần so với 3,00 và 4,17 tế

bào trứng/buồng trứng/lần (P < 0,05). Nhưng căn cứ vào số lượng tế bào

trứng/buồng trứng/lần siêu âm hút tế bào trứng cho thấy ở áp lực hút 150

mmHg cao nhất.

Qua số lượng tế bào trứng thu được/nang trứng được hút, có thể thấy

rằng số lượng nang trứng được hút không có sự khác nhau (p < 0,05), tuy

nhiên tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút lại có sự chênh lệch

giữa các mức độ áp lực hút, tương ứng: 32,34% ở 60 mmHg, 43,60% ở 90

mmHg, 81,18% ở 120 mmHg và 87,08% ở 150 mmHg. Như vậy có thể thấy

rằng khi tăng áp lực hút thì số lượng tế bào trứng thu được cũng như tỉ lệ tế

bào trứng thu được tăng lên. Tỉ lệ tế bào trứng thu được ở áp lực hút 60 và 90

mmHg của chúng tôi thấp hơn nhiều so với kết quả của Nguyễn Văn Lý và cs.

(2006), song ở áp hút 120 và 150 mmHg lại tương đối phù hợp với tác giả,

khi tác giả thu tế bào trứng bằng phương pháp hút dịch nang trứng và phương

pháp phẫu thuật thu được tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng có kích thước

≤ 8 mm là 82,38%. Như vậy, có thể nói, quá trình siêu âm hút tế bào trứng là

một quá trình phức tạp, bao gồm rất nhiều yếu tố và bị hạn chế bởi khả năng

quan sát so với thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ, tỉ lệ tế bào trứng thu

được ở áp suất thích hợp cho kết quả tốt.

Kết quả thu được cho thấy, ở áp lực hút thấp số lượng tế bào trứng thu

được thấp. Nguyên nhân có thể do ở lực hút yếu nên dịch nang trứng cùng với

các tế bào trong dịch nang trứng không được hút ra hết. Mặt khác ở những

nang trứng lớn do lực hút chậm nên có thể đã có một số lượng dịch nang

trứng bị thoát ra xung quanh vết kim đâm. Số lượng tế bào trứng tăng lên khi

áp lực hút tăng cao là do lực hút mạnh đã hút được tối đa dịch nang trứng và

lực tác động cơ học lên sự liên kết giữa tế bào trứng và các tế bào xung

quanh. Nhưng số lượng tế bào trứng thu được tăng lên có làm ảnh hưởng đến

chất lượng tế bào trứng, đặc biệt là màng cumulus cần được nghiên cứu để

tìm ra áp lực hút đảm bảo cho quá trình tạo phôi in vitro vì khả năng phát

triển cao nhất của tế bào trứng khi có hình thái tròn trịa, tế bào chất đồng nhất

và phải có từ 3 lớp màng cumulus trở lên (Rita và cs., 2003).

* Ảnh hưởng của áp lực hút đến chất lượng tế bào trứng

Đánh giá chất lượng tế bào trứng là khâu quan trọng để đạt được kết

quả cao trong quá trình nuôi thành thục, thụ tinh in vitro, liên quan mật thiết

đến kết quả hợp tử phân chia, số lượng phôi dâu và phôi nang thu được. Đánh

giá chất lượng tế bào trứng được thực hiện trên màn hình của kích hiển vi soi

nổi, dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, đặc biệt là đặc điểm và số lượng

màng cumulus (Hình 3.1) để phân loại chất lượng tế bào trứng theo bốn mức

độ từ tốt đến xấu A, B, C và D. Kết quả nghiên cứu và thực tiễn cho thấy, chỉ

có tế bào trứng có chất lượng loại A và B mới có khả năng phát triển tốt.

Kết quả thu được cho thấy, có sự ảnh hưởng của áp lực hút lên chất

lượng tế bào trứng loại A (P < 0,05). Bình quân tế bào trứng loại A ở các mức

độ áp lực 60, 90, 120 và 150 mmHg, tương ứng 1,44; 1,89; 3,78 và 2,44 tế

bào trứng/buồng trứng/lần (Bảng 3.2). Như vậy, tế bào trứng loại A/buồng

trứng/lần thấp nhất ở áp lực 60 mmHg và cao nhất ở áp lực hút 120 mmHg.

Có sự khác biệt (P < 0,05) về số lượng tế bào trứng loại B/buồng

trứng/lần ở áp lực 60 mmHg và 90 mmHg so với 120 mmHg và 150 mmHg,

tương ứng: 1,06 và 1,33 tế bào trứng so với 3,00 và 3,17 tế bào trứng. Ở áp

lực 150 mmHg cho kết quả tế bào trứng loại B/buồng trứng/lần cao nhất và

thấp nhất ở áp lực hút 60 mmHg (P < 0,05).

Có sự sai khác (P < 0,05) về số lượng tế bào trứng loại C/buồng

trứng/lần ở áp lực 150 mmHg so với áp lực 60 mmHg, 90 mmHg và 120

mmHg, tương ứng: 1,44 tế bào trứng so với 0,33; 0,56 và 0,56 tế bào trứng.

Tương tự, tế bào trứng loại D ở áp lực hút 150 mmHg có sự khác biệt với áp

lực hút 60 mmHg, 90 mmHg và 120 mmHg (P < 0,05). Bình quân số lượng tế

bào trứng/buồng trứng/lần loại D ở áp lực 150 mmHg (1,56 tế bào), cao hơn

so với áp lực 60 mmHg, 90 mmHg và 120 mmHg (tương ứng: 0,17; 0,39 và

0,33 tế bào trứng).

Chất lượng tế bào trứng

Áp lực

A

B

C

D

Hút

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

60 mmHg

1,44a ± 0,17 (26)

1,06a ± 0,17 (19)

0,33a ± 0,14 (6)

0,17a ± 0,09 (3)

90 mmHg

1,89b ± 0,16 (34)

1,33a ± 0,20 (24)

0,56a ± 0,17 (10)

0,39a ± 0,12 (7)

120 mmHg 3,78c ± 0,27 (68)

3,00b ± 0,26 (54)

0,56a ± 0,15 (10)

0,33a ± 0,11 (6)

3,17b ± 0,27 (57)

1,44b ± 0,20 (26)

150 mmHg 2,44b ± 0,23 (44) 1,56b ± 0,18 (28) Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; A, B, C và D: Chất lượng tế bào trứng theo thứ tự từ cao

đến thấp; X: Bình quân/buồng trứng/lần

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của áp lực hút đến chất lượng tế bào trứng

Như vậy có thể nói rằng áp lực đã ảnh hưởng đến chất lượng tế bào

trứng. Sự ảnh hưởng này liên quan mật thiết đến kết quả nuôi thành thục và

tạo phôi in vitro. Nguyễn Văn Lý và cs. (2006); Nguyễn Hữu Đức và cs.

(2003) đã tiến hành nghiên cứu và có kết luận rằng, chất lượng tế bào trứng

trước khi nuôi ảnh hưởng đến tỉ lệ trứng thành thục. Số lượng tế bào

trứng/buồng trứng/lần có chất lượng C và D cao là một kết quả không mong

muốn khi siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm. Tế bào

trứng loại A, B thường được sử dụng, do có tỉ lệ thành thục, thụ tinh và tạo

phôi trong ống nghiệm cao, còn chất lượng tế bào trứng loại C và D thường

không được sử dụng để nuôi thành thục, thụ tinh và tạo phôi trong ống

nghiệm do kết quả thu được rất kém (Shiora và cs., 1988). Nguyễn Văn lý và

cs. (2006) cũng có kết luận tương tự khi ông nghiên cứu ảnh hưởng của chất

lượng tế bào trứng đến khả năng thành thục từ tế bào trứng được thu từ buồng

trứng của lò mổ thấy rằng, không có sự sai khác ý nghĩa về tỉ lệ thành thục

giữa tế bào trứng loại A và tế bào trứng loại B (71,19% và 69,46%; P < 0,05),

nhưng tỉ lệ thành thục của tế bào trứng loại C lại thấp hơn nhiều so với loại A

và B, chỉ đạt (38,35%; P < 0,05).

Tế bào trứng loại A Tế bào trứng loại B

Tế bào trứng loại C Tế bào trứng loại D Hình 3.1.Tế bào trứng có chất lượng A, B, C và D

Kết quả của chúng tôi thu được ở áp suất 60 mmHg tương đối phù hợp

với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Lý và cs. (2006) về tế bào trứng loại

A và B/buồng trứng/lần, khi ông tiến hành nghiên cứu siêu âm hút tế bào

trứng trên bò sống, số lượng tế bào trứng loại A và B thu được/buồng

trứng/lần siêu âm, tương ứng 1,44 và 0,97 tế bào trứng. Tuy nhiên, ở áp lực

hút 90, 120 và 150 mmHg của chúng tôi lại cao hơn.

* Ảnh hưởng của áp lực hút đến hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được

Tế bào trứng loại A và B được nuôi thành thục, thụ tinh, nuôi hợp tử và

phôi in vitro đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Kết quả thu được cho thấy,

có sự sai khác về số lượng hợp tử phân chia (Bảng 3.3) ở áp lực hút 120

mmHg, 150 mmHg so với 60 và 90 mmHg (P < 0,05), tương ứng 3,61; 2,50

so với 1,50 và 1,72 hợp tử/buồng trứng/lần. Số lượng hợp tử/tế bào trứng nuôi

thành thục cao nhất ở áp lực 60 mmHg (60%) so với áp lực 90 (53,45%), 120

mmHg (53,28%) và 150 mmHg (44,55%). Như vậy, tỉ lệ hợp tử thu được ở áp

lực 60 mmHg tốt nhất. Kết quả này cho thấy rằng, ở áp lực này sự ảnh hưởng

đến chất lượng tế bào trứng ít hơn so với các mức độ áp lực khác. Tuy nhiên ở

áp lực này số lượng tế bào trứng thu được là rất thấp, do vậy số lượng hợp tử

thu được/buồng trứng/lần rất thấp, chỉ đạt 1,50 hợp tử. Trong khi đó tỉ lệ hợp

tử phân chia ở áp lực hút 120 mmHg có phần thấp hơn áp lực 60 mmHg,

nhưng số lượng hợp tử thu được/buồng trứng/lần lại cao nhất (3,61 hợp tử; P

< 0,05).

Hợp tử sau khi phân chia được tiếp tục nuôi đến giai đoạn phôi nang và

phôi dâu. Qua số lượng phôi dâu và phôi nang thu được cho thấy, (Bảng 3.3)

không có sự ảnh hưởng của áp lực hút đến số lượng phôi dâu và phôi nang thu

được (P < 0,05). Song căn cứ vào số lượng phôi thu được/buồng trứng/lần thì

ở áp lực hút 120 mmHg (1,11 phôi) cao hơn so với áp lực 60 mmHg, 90

mmHg và 150 mmHg (tương ứng: 0,56; 0,61 và 0,67 phôi/buồng trứng/lần).

Tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được ở các mức độ áp lực 60. 90, 120

và 150 mmHg tương ứng: 22,22; 18,97; 16,39 và 11,88 %. Từ kết quả thu

được cho thấy, ở áp lực hút càng cao khả năng thu được tế bào trứng càng

lớn, song tỉ lệ hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được đã bị giảm

xuống. Dựa vào mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra áp lực hút thích hợp

cho số lượng phôi dâu và phôi nang thu được cao nhất ta thấy ở áp lực hút

120 mmHg đáp ứng được điều đó, với 1,11 phôi/buồng trứng/lần siêu âm, cao

hơn các mức độ áp suất còn lại (P < 0,05).

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của áp lực hút đến sự phân chia của hợp tử, phôi

Hợp tử phân chia

Phôi dâu và phôi nang

Áp lực hút

Tế bào trứng

nuôi in vitro (n)

X ± SE (n)

%

X ± SE (n)

%

60 mmHg

45

1,50a ± 0,23 (27)

60,00 0,56a ± 0,17 (10)

22,22

90 mmHg

58

1,72a ± 0,21 (31)

53,45 0,61a ± 0,14 (11)

18,97

120 mmHg

122

3,61b ± 0,31 (65)

53,28 1,11a ± 0,20 (20)

16,39

44,55 0,67a ± 0,14 (12)

2,50c ± 0,23 (45)

11,88

101

150 mmHg Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; %: Tỉ lệ hợp tử, phôi dâu và phôi nang thu được/tế bào

trứng nuôi in vitro; X: Bình quân/buồng trứng/lần

dâu và phôi nang

* Kết luận

Qua kết quả nghiên cứu ta thấy có sự biến động rất lớn về số lượng tế

bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang

thu được (P < 0,05). Số lượng tế bào trứng ở áp lực hút 150 mmHg cao nhất

(8,61 tế bào trứng/buồng trứng/lần). Chất lượng tế bào trứng loại A, B ở áp

lực hút 120 mmHg cao nhất (3,78 và 3,00 tế bào trứng/buồng trứng/lần). Số

lượng hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được cao nhất ở tần suất

120 mmHG (1,11 phôi/buồng trứng/lần). Từ kết quả nghiên cứu này có thể

đưa ra kết luận rằng, áp lực hút 120 mmHg là tốt nhất.

Hình 3.2. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 4 mức độ áp suất

khác nhau

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với tác giả Hashimito và cs.

(1998); Jaskowski. (2001); Kruip và cs. (1994); Pawel và cs. (2007) khi các

tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút khi siêu âm hút tế bào trứng trên

bò sống kết luận rằng, áp lực hút ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tế

bào trứng. Tương tự Pawel và cs. (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực

hút lên số lượng và chất lượng tế bào trứng ở lợn và bò đi đến kết luận rằng,

áp lực hút tế bào trứng ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng (P < 0,05).

Nghiên cứu của Bols và cs. (1996) về sự ảnh hưởng của áp lực hút lên số

lượng tế bào trứng thu được cũng cho thấy, số lượng tế bào trứng thu được

tăng lên khi sử dụng áp lực hút > 130 mmHg so với 50 mmHg, 70 mmHg, 90

mmHg và 110 mmHg.

Nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút được nhiều nhà khoa học trên thế

giới quan tâm nghiên cứu thấy rằng, mức độ áp lực hút sử dụng trong quá

trình siêu âm hút tế bào trứng có sự liên quan mật thiết với số lượng tế bào

trứng được hút ra cũng như chất lượng tế bào trứng (Bols và cs., 1996;

Jaskowski, 2001; Kruip và cs., 1994; Pawel và cs., 2007). Theo các lập luận

của các nhà khoa học trong quá trình siêu âm hút tế bào trứng, các tế bào

trứng có thể bị ảnh hưởng của áp lực hút, tốc độ, dòng xoáy, khi tăng áp suất

lên cao làm giảm khả chất lượng tế bào trứng và làm tăng tỉ lệ tế bào trứng bị

lột trần (không có màng cumulus). Lập luận của các tác giả cũng phù hợp với

giả thuyết và kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Bols và cs. (1996) cũng cho

rằng, độ chính xác của áp lực hút phụ thuộc vào cấu tạo của thiết bị siêu âm

hút tế bào trứng, đường kính của kim hút tế bào trứng, độ dài và kích thước

của ống dẫn dịch. Rõ ràng áp lực hút đóng một vai trò quan trọng khi siêu âm

hút tế bào trứng và thụ tinh ống nghiệm, kết quả sau cũng cho thấy các tác giả

có kết quả khác nhau khi sử dụng áp lực hút khác nhau: Moreno (1993) sử

dụng áp suất 120 mmHg (kim 18 G), Gibbons. (1994) sử dụng 75 mmHg

(kim 17 G), Manjunatha (2008) sử dụng 110 mmHg (kim 18 G).

Khi siêu âm hút tế bào trứng, số lượng tế bào trứng thu được cao hay

thấp còn phụ thuộc vào kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng. Để xác định chính

xác số lượng, kích thước nang trứng, thu được hết số lượng tế bào trứng, việc

cố định và di chuyển buồng trứng là một trong những yếu tố rất quan trọng để

có hình ảnh sắc nét của các nang trứng trên màn hình máy siêu âm. Kỹ thuật

thường cố định và di chuyển buồng trứng thường được thực hiện bằng bốn

ngón tay (trừ ngón tay cái). Ở Phương pháp sử dụng bốn ngón tay, cho phép

xoay chuyển buồng trứng theo nhiều góc độ khác nhau để đạt được khả năng

quan sát mong muốn. Vị trí của buồng trứng nằm ngang so với đầu dò siêu

âm và hình ảnh thu được có hình tròn. Khi đếm và đo kích thước của nang

trứng, buồng trứng được đưa về phía bên phải và phía bên trái. Để hút được

tối đa số lượng tế bào trứng chúng ta đưa buồng trứng từ dưới lên trên và từ

trên xuống dưới (Hình 3.3).

Hình 3.3. Phương pháp cố định buồng trứng bằng bốn ngón tay

Bên cạnh phương pháp sử dụng bốn ngón tay, phương pháp sử dụng

hai ngón tay (ngón tay trỏ và ngón tay cái) cái để cố định và di chuyển buồng

trứng cũng thường được sử dụng. Hình ảnh thu được có hình oval do buồng

trứng nằm dọc đầu dò siêu âm. Ở phương pháp này cho phép thu hình ảnh ở

vị trí mặt cắt dọc theo chiều dài của buồng trứng, vì vậy thu được cùng lúc

nhiều hình ảnh về số lượng nang trứng, thậm chí ở mặt cắt nhỏ cũng thu được

nhiều nang trứng (Hình 3.4). Trong thực tế, để đạt được hiệu quả tối ưu cần

sử dụng luân chuyển phương pháp cố định buồng trứng bằng bốn ngón và hai

ngón để đạt được kết quả tối ưu.

Hình 3.4. Phương pháp cố định buồng trứng bằng ngón tay trỏ và ngón

tay cái

Merton và cs. (2003) đã tiến hành so sánh 8 nhóm thực hiện siêu âm

hút tế bào trứng bò trong 2,5 năm, sử dụng cùng thiết bị và kỹ thuật siêu âm

hút tế bào trứng. Kết quả cho thấy thành phần của các nhóm thay đổi sẽ ảnh

hưởng kỹ thuật thao tác buồng trứng và gây hưởng đáng kể lên số lượng và

chất lượng tế bào trứng thu được. Mức độ biến động ở các nhóm kỹ thuật lớn

hơn ở các nhóm hỗ trợ có thể là do nhóm kỹ thuật có tầm quan trọng hơn.

3.2. Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng

* Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến số lượng nang trứng

được hút và tế bào trứng thu được

Để nghiên cứu ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng, 54 lượt

buồng trứng đã được siêu âm hút tế bào trứng ở ba mức độ tần suất 2 tuần/lần,

1 tuần/lần và ½ tuần/lần. Kết quả thu được cho thấy, có sự ảnh hưởng của tần

suất siêu âm hút tế bào trứng đến số lượng nang trứng được hút và số lượng tế

bào trứng thu được (P < 0,05). Số nang trứng được hút/buồng trứng/lần thu

được ở tần suất ½ tuần/lần lớn nhất, tổng số nang trứng được hút 195 nang,

đạt 10,83 nang trứng/buồng trứng/lần siêu âm. Tiếp đến ở tần suất 1 tuần/lần

thu được 164 nang, trung bình có 9,11 nang trứng. Ở tần suất 2 tuần/lần thấp

nhất, chỉ thu được 129 nang với trung bình 7,17 nang trứng (Bảng 3.4).

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến số lượng

Nang trứng được hút

Tế bào trứng thu được

Tần suất

%

n

X ± SE

n

X ± SE

2 tuần

129

7,17a ± 0,69

103

5,72a ± 0,57

79,84

1 tuần

164

9,1b ± 0,49

132

7,33b ± 0,39

80,49

½ tuần

195

10,83c ± 0,44

154

8,56c ± 0,42

78,97

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; %: Tỉ lệ tế bào trứng thu

được/nang trứng được hút

nang trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được

Số lượng tế bào trứng thu được cũng cho thấy, có sự khác biệt về số

lượng tế bào trứng thu được giữa các tần suất (P < 0,05). Trong đó ở mức độ

tần suất ½ tuần/lần cho số lượng tế bào trứng thu được cao nhất (195 tế bào

trứng), bình quân 8,56 tế bào trứng/buồng trứng/lần. Trong khi tổng số tế bào

trứng thu được ở tần suất 1 tuần/lần là 164 tế bào trứng, bình quân 7,33 tế bào

trứng/buồng trứng/lần. Và thấp nhất ở tần suất 2 tuần/lần chỉ thu được 129 tế

bào trứng, với 5,72 tế bào trứng/buồng trứng/lần.

Thể vàng Nang trứng

Tần suất 1 tuần/lần Tần suất ½ tuần/lần

Tần suất 2 tuần/lần

Hình 3.5. Nang trứng quan sát được ở tần suất 2 tuần, 1 tuần và ½

tuần/lần

Tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút tương đối ổn định giữa

ba loại tần suất, tương ứng: 79,84; 80,49 và 78,97 %. Từ kết quả này cho

thấy, tần suất siêu âm hút tế bào trứng không ảnh hưởng nhiều đến kỹ thuật,

song ảnh hưởng đến số lượng nang trứng có mặt trên buồng trứng là rõ rệt (p

< 0,05). Trong thí nghiệm này kích thước nang trứng ở các mức độ khác nhau

không được xác định, nhưng một thực tế cho thấy ở tần suất 2 tuần/lần và 1

tuần/lần các nang trứng có kích thước lớn xuất hiện nhiều hơn.

* Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến chất lượng tế bào

trứng

Từ số lượng tế bào trứng thu được ở các tần suất khác nhau, tiến hành

đánh giá, phân loại để xác định ảnh hưởng của các tần suất khác nhau lên chất

lượng tế bào trứng. Kết quả thu được cho thấy (Bảng 3.5), có sự ảnh hưởng

giữa các tần suất khác nhau lên tế bào trứng loại A (P < 0,05). Trong đó tế

bào trứng loại A ở tần suất ½ tuần cao hơn (P < 0,05) tần suất 1 tuần/lần và 2

tuần/lần, tương ứng: 4,00 tế bào trứng so với 2,67 và 2,00 tế bào trứng/buồng

trứng/lần.

Không có sự khác biệt về chất lượng tế bào trứng loại B ở tần suất 1

tuần/lần và 2 tuần/lần (P < 0,05). Song có sự khác biệt giữa tần suất ½

tuân/lần và hai tần suất còn lại ( P < 0,05). Số lượng tế bào trứng loại B/buồng

trứng/lần ở tần suất ½ tuần/lần cao nhất, đạt 3,11 tế bào. Còn ở hai tần suất ở

tần suất 1 tuần/lần là 2,39 tế bào trứng/buồng trứng/lần và ở tần suất 2

tuần/lần chỉ đạt 1,89 tế bào trứng/buồng trứng/lần.

Không có sự ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến chất

lượng tế bào trứng loại C (P > 0,05). Số lượng tế bào trứng loại C/buồng

trứng /lần ở tần suất ½ tuần/lần, 1 tuần/lần và 2 tuần/lần thu được tương ứng:

0,94; 1,22 và 0,83 tế bào. Tương tự tế bào trứng loại C, tế bào trứng loại D

cũng không có sự khác biệt giữa các tần suất (P < 0,05) và kết quả thu được ở

tần suất 2 tuần/lần, 1 tuần/lần và ½ tuần/lần, tương ứng: 0,89; 1,06 và 0,61 tế

bào trứng/buồng trứng/lần.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến chất

Chất lượng tế bào trứng

Tần

A

B

C

D

suất

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

2 tuần

2,00a ± 0,18 (36)

1,89a ± 0,31 (34) 0,94a ± 0,19 (17)

0,89a ± 0,24 (16)

1tuần

2,67b ± 0,26 (48)

2,39a ± 0,31 (43)

1,22a ± 0,17 (22)

1,06a ± 0,21 (19)

½tuần

4,00c ± 0,30 (72)

3,11b ± 0,28 (56)

0,83a ± 0,15 (15)

0,61a ± 0,16 (11)

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồngtrứng/lần; A, B, C và D: Chất lượng

tế bào trứng theo thứ tự từ cao đến thấp

lượng tế bào trứng

* Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến hợp tử phân chia,

phôi dâu và phôi nang thu được

Tổng số 289 tế bào trứng có chất lượng A và B thu được ở ba mức độ

tần suất khác nhau, được nuôi thành thục, thụ tinh và nuôi in vitro đến giai

đoạn phôi dâu và phôi nang. Qua kết quả thu được thấy rằng, có sự ảnh hưởng

rõ rệt của ba loại tần suất khác nhau (Bảng 3.6) lên sự phân chia của hợp tử (P

< 0,05). Ở tần suất ½ tuần có số lượng hợp tử phân chia/buồng trứng/lần cao

nhất, đạt 5,11 hợp tử. Tiếp đến là ở tần suất 1 tuần/lần 2,50 hợp tử và thấp

nhất là ở tần suất 2 tuần/lần 1,89 hợp tử. Tỉ lệ hợp tử phân chia (hợp tử/tế bào

trứng đem nuôi) ở tần suất ½ tuần cao nhất hơn so với tần suất 2 tuần/lần và 1

tuần/lần, tương ứng 71,88% so với 48,57 và 49,45%.

Từ số lượng phôi dâu và phôi nang thu được/buồng trứng/lần cho thấy,

ở tần suất 2 tuần/lần và 1 tuần/lần không có sự khác nhau (P < 0,05). Số

lượng phôi dâu và phôi nang/buồng trứng/lần tương ứng: 0,56 và 0,72 phôi.

Song lại có sự khác biệt giữa tần suất ½ tuần/lần so với tần suất 2 tuần/lần và

1 tuần/lần. Số lượng phôi dâu và phôi nang/buồng trứng/lần đạt 1,83 phôi.

Như vậy, số lượng phôi dâu và phôi nang thu được/số lượng tế bào trứng đem

nuôi cao nhất ở tần suất ½ tuần/lần, chiếm 25,78%. Trong khi ở tần suất 2

tuần/lần và 1 tuần/lần có tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được giống nhau

12,29%.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến sự phân

Hợp tử phân chia

Phôi dâu và phôi nang

Tần

Tế bào trứng

suất

nuôi in vitro (n)

X ± SE (n)

%

X ± SE (n)

%

2 tuần

70

1,89a ± 0,20 (34) 48,57 0,56a ± 0,12 (10)

14,29

1 tuần

91

2,50b ± 0,20 (45) 49,45 0,72a ± 0,16 (13)

14,29

½ tuần

128

5,11c ± 0,46 (92) 71,88 1,83b ± 0,20 (33)

25,78

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; %: Tỉ lệ hợp tử, phôi dâu và phôi nang thu được/tế bào

trứng nuôi in vitro; X: Bình quân/buồng trứng/lần

chia của hợp tử, phôi dâu và phôi nang

* Kết luận

Từ kết quả nghiên cứu thu được có thể kết luận rằng có sự ảnh hưởng của tần

suất siêu âm hút tế bào trứng ở các tần suất 2 tuần/lần, 1 tuần/lần và ½

tuần/lần (P < 0,05) và ở tần suất ½ tuần cho kết quả về số lượng nang trứng

được hút, số lượng tế bào trứng loại A, B, hợp tử, phôi dâu và phôi nang thu

được cao nhất, tương ứng đạt 10,83 nang; 8,56 tế bào trứng; 4,00 tế bào trứng

loại A; 3,11 tế bào trứng loại B; 5,11 hợp tử và 1,83 phôi dâu và phôi

nang/buồng trứng/lần. Kết luận này phù hợp với một số tác giả trên thế giới

đã nghiên cứu. Garcia và Salahedine. (1998) tiến hành siêu âm hút tế bào

trứng lặp lại ở bê với tần suất 1 tuần/lần và ½ tuân/lần (không sử dụng

hormone) cho thấy, số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, tế bào trứng

loại A và loại B/bê/lần ở tần suất ½ tuần/lần cao hơn so với tần suất 1 tuần/lần

(tương ứng: 17,2 so với 12,4 nang; 7,7 so với 4,5 tế bào trứng; 3,0 so với 1,8

tế bào trứng loại A và 3,3 so với 1,7 tế bào trứng loại B; P < 0,05), bình quân

số lượng tế bào trứng/bê/tuần ở tần suất ½ tuần (15,5 tế bào trứng) cao hơn

tần suất (P < 0,05) 1 tuần (5,4 tế bào trứng). Cũng nghiên cứu về sự ảnh

hưởng của tần suất, tác giả Viana và cs. (2004) thấy rằng về số lượng nang

trứng/bò/lần có sự sai khác với kết quả nghiên cứu của chúng tôi, khi tác giả

thấy rằng ở tần suất 1 tuần và tần suất ½ tuần không có sự sai khác (14,15 so

với 14,2 nang; P > 0,05), số lượng /bò/lần ở tần suất 1 tuần lại cao hơn ½ tuần

(8,9 so với 7,0; P < 0,05), song về chất lượng tế bào trứng loại A, tỉ lệ phôi

dâu và phôi nang thu được lại phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi

khi tác giả thu được số phôi nang/bò/lần ở tần suất ½ tuần/lần cao hơn tần

suất 1 tuần/lần ( tương ứng: 2,2 phôi so với 1,9; P < 0,01%). Nghiên cứu của

Merton và cs. (2003) cũng có kết quả nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của

chúng tôi, với tỉ lệ phôi nang ở khoảng cách 3 ngày cao hơn khoảng cách 7

ngày (19,7% so với 13,5%; P < 0,05).

Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Li và

cs. (2007), khi tác giả nghiên cứu siêu âm hút tế bào trứng ở tần suất 1

tuần/lần và ½ tuần/lần ở bê vàng Trung Quốc (Chinese Yellow heifer) cho

thấy, tần suất siêu âm hút tế bào trứng ảnh hưởng đến số lượng nang trứng

được hút, số lượng tế bào trứng ( P < 0,05) khi siêu âm hút tế bào trứng ở tần

suất 1 tuần/lần và ½ tuần/lần. Ở tần suất 1 tuần/lần có số lượng nang trứng

được hút/bê/lần chỉ đạt 9,1 nang, trong khi đó ở tần suất ½ tuần/lần đạt 12,1

nang trứng được hút/bê/lần. Số lượng tế bào trứng thu được/bê/lần ở tần suất

½ tuần/lần cao hơn tần suất 1 tuần/lần (P < 0,05), tương ứng: 4,5 so với 5,6 tế

bào trứng/lần. Số lượng tế bào trứng/bê/lần có khả năng phát triển ở tần suất

½ tuần/lần cũng cao hơn tần suất 1 tuần/lần, tương ứng: 4,4 so với 2,8 tế bào.

Chúng tôi cho rằng số lượng nang trứng được hút, số lượng tế bào

trứng, hợp tử, phôi dâu và phôi nang thu được cao nhất ở tần suất và ½

tuần/lần là do chưa có sự ức chế của nang trội vì vậy các nang trứng phát triển

nhiều hơn và do chưa có sự ức chế của nang trội nên các nang trứng chưa bị

thoái hóa. Viana và cs. (2010) thấy rằng sau khi siêu âm hút tế bào trứng sẽ

xuất hiện một đợt nang trứng và hình thành một đợt sóng nang mới trong

khoảng thời gian 48 h. Kết quả này cũng phù hợp với quy luật phát triển của

nang trứng trong một đợt sóng nang. Trong tự nhiên, đợt sóng nang đầu tiên

xuất hiện vào ngày thứ 1 sau khi bò động dục, các nang trứng có kích thước

2mm trở lên tham gia vào hình thành đợt sóng nang (pha phát triển), đến ngày

thứ 3 trở đi nang trội bắt đầu phát triển nhanh hơn các nang trứng khác. Sau

khi nang trội phát triển, các ngày tiếp theo các nang trứng còn lại giảm, ngừng

phát triển và dần trở nên thoái hóa (Machatkova và cs., 2004). Giả thuyết về

sự phát triển của nang trứng sau khi siêu âm hút tế bào trứng được nhiều tác

giả đã đưa ra. Viana và cs. (2004) trước khi nghiên cứu về ảnh hưởng của tần

suất siêu âm cho rằng không có sự khác nhau về kích thước nang trứng lớn

nhất phát hiện được khi siêu âm hút tế bào trứng với các tần suất khác nhau và

thậm chí với khoảng cách 3 ngày cũng cho phép nang trội xuất hiện và đạt

đến kích thước > 10 mm. Viana và cs. (2000) nghiên cứu và thấy rằng, sự

phát triển của nang trội sau khi siêu âm hút tế bào trứng nhanh hơn sự phát

triển của nang trội ở chu kỳ bình thường, tốc độ phát triển của nang trội

khoảng 1,0 mm/ngày ở bò Zebu. Garcia và Salaheddine (1998) đưa ra kết

luận rằng kết quả siêu âm hút tế bào trứng ở tần suất ½ tuần/lần tốt là do tỉ lệ

nang trứng bị thoái hóa thấp. Merton và cs. (2003) cho rằng, sau khi tất cả các

nang trứng có kích thước từ 2 mm trở lên được hút ra, các ngày tiếp theo các

nang trứng có kích thước từ 2 mm trở xuống tiếp tục phát triển và sau khi siêu

âm hút tế bào trứng 3 ngày thì nang trội bắt đầu xuất hiện.

Hình 3.6. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở ba tần suất khác

nhau

Từ thực tế thu được cũng cho thấy rằng, trong chu kỳ động dục tự

nhiên, chỉ có 2 – 3 đợt sóng nang xuất hiện. Nhưng khi tiến hành siêu âm hút

tế bào trứng liên tục ½ tuần/lần có nhiều đợt nang trứng được huy động hơn.

Số lượng các đợt sóng nang đã tăng lên rất nhiều trong một khoảng thời gian

nhất định. Như vậy đã có sự ảnh hưởng đến các hormone sinh sản, đặc biệt

khi siêu âm hút tế bào trứng liên tục làm cho nang trội không kịp phát triển

dẫn đến hàm lượng hormone inhibin và estradiol-17β trong máu không tăng

cao, kết quả là làm tăng hàm lượng FSH, LH và thay đổi các cơ chế phản hồi

của oestradiol. FSH và LH tăng cao đã kích thích một đợt nang mới phát

triển. Viana và cs. (2004) công bố rằng, tần suất hút tế bào trứng liên quan

đến giai đoạn nang trứng đang phát triển hay giai đoạn thoái hóa. Khi Nang

trứng ở giai đoạn thoái hóa, cấu trúc và chức năng bị thay đổi mối liên kết

giữa các tế bào cumulus và tế bào trứng, sự liên kết bị giảm, các tế bào

cumulus giãn nở và dễ bị lột trần (Bols và cs., 1996).

3.3. Ảnh hưởng của kích thước nang trứng

* Ảnh hưởng của kích nang trứng đến số lượng nang trứng được hút và tế bào

trứng thu được

Tổng số 60 lượt buồng trứng được siêu âm để xác định kích thước và

tiến hành siêu âm hút tế bào trứng của các nang trứng (2 – 5, 6 – 9 và ≥ 10

mm). Kết quả thu được cho thấy (Bảng 3.7), có sự ảnh hưởng rõ rệt giữa ba

mức độ kích thước khác nhau đến số lượng nang trứng được hút (P < 0,05).

Trong đó số lượng nang trứng được hút/buồng trứng/lần ở kích thước 2 – 5

mm cao nhất (P < 0,05), 9,63 nang. Tiếp đến là ở kích thước 6 – 9 mm, đạt

1,80 nang trứng/buồng trứng/lần. Và thấp nhất là nang trứng có kích thước từ

10 mm trở lên, chỉ có 0,85 nang trứng/buồng trứng/lần.

Số lượng tế bào trứng thu được cũng có sự ảnh hưởng rõ rệt (P < 0,05)

giữa các mức độ kích thước khác nhau. Ở kích thước 2 – 5 mm có số lượng tế

bào trứng/buồng trứng/lần cao nhất (p < 0,05), đạt 7,50 tế bào trứng. Trong

khi đó ở kích thước 6 – 9 mm và nang trứng từ 10 mm trở lên chỉ đạt, tương

ứng 1,47 và 0, 67 tế bào trứng/buồng trứng/lần.

Tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút không có sự chênh

lệch nhiều. Cao nhất ở kích thước 6 – 9 mm (81,48%), tiếp đến là kích thước

≥ 10 mm trở lên (78,43%) và thấp nhất là kích thước 2 – 5 mm (77,85%).

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến số lượng nang

Kích thước

Nang trứng được hút

Tế bào trứng thu được

%

nang trứng

n

X ± SE

n

X ± SE

2 – 5 mm

578

9,63a ± 0,22

450

7,50a ± 0,16

77,85

6 – 9 mm

108

1,80b ± 0,11

88

1,47b ± 0,09

81,48

78,43

≥ 10 mm

51

0,85c ± 0,09

40

0,67c ± 0,07

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; %: Tỉ lệ tế bào trứng thu

được/nang trứng được hút

trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được

Nang trứng

Đo kích thước nang trứng

Buồng trứng

Hình 3.7. Đếm và đo kích thước của các nang trứng trên máy siêu âm

Số lượng và kích thước nang trứng được thực hiện trên các phím

chức năng của màn hình máy siêu âm. Mỗi một kích thước của nang trứng

được lựa chọn trên buồng trứng sẽ tương ứng với kích thước thể hiện bên

cạnh màn hình máy siêu âm (Hình 3.7)

* Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến chất lượng tế bào trứng

Có sự sai khác có ý nghĩa về chất lượng tế bào trứng loại A giữa 3 mức

độ kích thước (P < 0,05). Số lượng tế bào trứng loại A ở kích thước 2 – 5 mm

cao nhất (P < 0,05), với 4,23 tế bào trứng/buồng trứng/lần. Tiếp đến là kích

thước 6 – 9 mm và thấp nhất là ở nang trứng có kích thước 10 mm trở lên,

tương ứng: 0,45 và 0,05 tế bào trứng/buồng trứng/lần (Bảng 3.8).

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến chất lượng tế bào

Chất lượng tế bào trứng

Kích thước

A

B

C

D

nang trứng

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

2 – 5 mm 4,23a ± 0,14 (254)

2,30a ± 0,17 (138) 0,52a ± 0,09 (31) 0,45a ± 0,09 (27)

6 – 9 mm

0,45b ± 0,77 (27)

0,60b ± 0,08 (36)

0,27b ± 0,07 (16)

0,15b ± 0,05 (9)

≥ 10 mm

0,05c ± 0,03 (3)

0,05c ± 0,03 (3)

0,25b ± 0,06 (15) 0,50a ± 0,08 (30) Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; A, B, C và D:Chất lượng

tế bào trứng theo thứ tự từ cao đến thấp

trứng

Tế bào trứng có chất lượng loại B/buồng trứng/lần của ba mức độ kích

thước có sự khác nhau (P < 0,05). Lớn nhất ở kích thước 2 – 5 mm (2,30 tế

bào trứng/buồng trứng/lần), tiếp đến là kích thước 6 – 9 mm (0,60 tế bào

trứng/buồng trứng/lần) và thấp nhất là kích thước 10 mm trở lên (0,05 tế bào

trứng/buồng trứng/lần).

Chất lượng tế bào trứng loại C ở nang trứng có kích thước 6 – 9 mm và

10 mm trở lên không có sự khác nhau rõ rệt (P < 0,05), tế bào trứng/buồng

trứng/lần thu được tương ứng: 0,27 và 0,25 tế bào. Song lại có sự khác biệt

giữa nang trứng có kích thước 2 – 5 mm so với hai mức độ kích thước trên (P

< 0,05), số lượng tế bào trứng thu được là 0,52 tế bào trứng/buồng trứng/lần.

Còn ở tế bào trứng loại D nang trứng có kích thước 10 mm trở lên cao hơn (P

< 0,05) so với kích thước 2 – 5 mm và 6 – 9 mm, tương ứng 0,50 so với 0,45

và 0,15 tế bào trứng/buồng trứng/lần.

* Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến hợp tử phân chia, phôi dâu và

phôi nang thu được

Số lượng tế bào trứng được nuôi thành thục để thụ tinh ở kích thước 2 –

5mm, 6 – 9 mm và 10 mm trở lên, tương ứng: 392, 63 và 6 tế bào trứng, thu

được số lượng hợp tử phân chia, tương ứng: 223, 35 và 3 hợp tử (Bảng 3.9).

Từ kết quả này cho thấy, có sự sai khác giữa ba mức độ kích thước khác nhau

(P < 0,05), số lượng hợp tử phân chia/buồng trứng/lần ở kích thước 2 – 5 mm

(3,72 hợp tử) lớn hơn (P < 0,05) so với kích thước 6 – 9 mm (0,58 hợp tử) và

10 mm trở lên (0,05 hợp tử). Bên cạnh số lượng hợp tử thu được/buồng

trứng/lần, tỉ lệ hợp tử phân chia ở kích thước 2 – 5 mm, 6 – 9 mm và 10 mm

trở lên không có sự chênh lệch đáng kể, tương ứng: 56,89; 55,56 và 50,00%.

Về kết quả phôi dâu và phôi nang thu được (Bảng 3.9) cho thấy, ở nang

trứng có kích thước 10 mm trở lên không có hợp tử phân chia nào phát triển

đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Trong quá trình siêu âm hút tế bào trứng

cho thấy, các nang trứng có kích thước 10 mm trở lên tế bào trứng thu được

thường không có màng cumulus.

Có sự khác biệt về số lượng phôi dâu và phôi nang thu được/buồng

trứng/lần siêu âm hút tế bào trứng (P < 0,05). Phôi dâu và phôi nang thu

được/buồng trứng/lần ở nang trứng có kích thước 2 – 5 mm cao hơn nang

trứng có kích thước 6 – 9 mm, tương ứng 1,58 phôi/buồng trứng/lần so với

0,20 phôi/buồng trứng/lần.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến sự phân chia của

Kích thước

Hợp tử phân chia

Phôi dâu và phôi nang

Tế bào trứng

nang trứng

nuôi in vitro (n)

X ± SE (n)

%

X ± SE (n)

%

2 - 5 mm

392

3,72a ± 0,10 (223) 56,89 1,58a ± 0,08 (95)

24,23

0,58b ± 0,07 (35)

55,56 0,20b ± 0,05 (12)

19,05

6 - 9 mm

63

≥ 10 mm

6

0,05c ± 0,03 (3)

50,00

-

0

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; %: Tỉ lệ hợp tử, phôi dâu

và phôi nang thu được/tế bào trứng nuôi in vitro

hợp tử, phôi dâu và phôi nang

* Kết luận

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, các nang trứng có kích thước 2 –

5 mm cho số lượng nang trứng được hút, số lượng tế bào trứng, hợp tử phân

chia, phôi dâu và phôi nang thu được/buồng trứng/lần lớn nhất, tương ứng:

9,63 nang, 7,50 tế bào trứng, 4,23 tế bào trứng loại A, 2,30 tế bào trứng loại

B, 3,72 hợp tử và 1,58 phôi dâu và phôi nang. Còn ở nang trứng có kích thước

6 – 9 mm, có số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng thu được, hợp tử

phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được thấp hơn và đặc biệt thấp hơn ở

nang trứng có kích thước từ 10 mm trở lên không thu được phôi dâu và phôi

nang.

Kết quả này là do ảnh hưởng của cơ chế phát triển nang trứng. Trong tự

nhiên, các nang trứng kích thước nhỏ (từ 2 mm trở lên) thường phát triển theo

nhóm, trong khi đó chỉ một số lượng rất ít các nang trứng có kích thước lớn

phát triển (nang trội). Sự phát triển của nang trội đã ức chế sự phát triển của

các nang trứng và làm chúng bị thoái hóa. Các nang trứng bị thoái hóa có sự

liên kết giữa các lớp màng cumulus ít chặt chẽ, do vậy các nang trứng dễ bị

mất màng cumulus trong quá trình siêu âm hút tế bào trứng. Mặt khác số

lượng màng cumulus liên quan chặt chẽ với kích thước nang trứng, ở các

nang trứng có kích thước lớn số lượng màng cumulus bị giảm dần và mối liên

kết với tế bào trứng lỏng lẻo hơn (Leibfried và First, 1979). Một thực tế cho

thấy khi siêu âm hút tế bào trứng, các nang trứng có kích thước lớn thường có

tế bào trứng trần trụi, đây cũng là nguyên nhân làm cho chất lượng tế bào

trứng thấp, hợp tử phân chia giảm, phôi dâu và phôi nang thu được thấp.

Ảnh hưởng của kích thước nang trứng được rất nhiều nhà khoa học trên

thế giới quan tâm nghiên cứu. Các tác giả đều cho rằng kích thước nang trứng

đóng một vai trò quan trọng trong việc nuôi tế bào trứng in vitro. Một số tác

giả cho rằng, tế bào trứng động vật có vú phải đạt đến một giai đoạn phát triển

hay kích thước nhất định để đạt được khả năng thành thục. Ở bò các tế bào

trứng phải đạt 110 µm để đạt được khả năng phân bào nguyên nhiễm đầy đủ

(Fair và cs., 1995; Otoi và cs., 1997). Có mối liên hệ chặt chẽ giữa kích thước

nang trứng và khả năng phát triển của tế bào trứng (Pavlok và cs., 1992).

Nang trứng kích thước < 2 mm không có khả năng phát triển đến giai đoạn

phôi nang (Pavlok và cs., 1992). Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng

không có sự khác biệt về khả năng thành thục giữa các tế bào trứng có kích

thước khác nhau sau khi nuôi in Vitro (Arlotto và cs., 1996). Fuhrer và cs.

(1989) báo cáo rằng, chỉ có 1,4% tế bào trứng thu từ nang trứng có kích thước

< 2 mm có khả năng thành thục, trong khi đó 47% tế bào trứng thu từ nang

trứng có kích thước 2 – 8 mm có khả năng thành thục.

Nguyễn Văn Lý và cs. (2006) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của kích

thước nang trứng ở trên buồng trứng lò mổ với các mức độ kích thước < 2, 2

– 5 và > 5 – 8 mm đến số lượng nang trứng, khả năng thành thục và khả nang

thụ tinh. Nghiên cứu của ông cho thấy có sự ảnh hưởng của kích thước nang

trứng. Số lượng nang trứng thu được tương ứng với nang trứng có kích thước

< 2 mm là 2974, 2 – 5 mm là 1010 và 398 nang ở nang trứng có kích thước >

10 mm và tỉ lệ thu tế bào trứng không có sự khác biệt giữa các mức độ kích

thước (P < 0,05). Tỉ lệ thụ tinh của nang trứng < 2 mm chỉ đạt 46,57%, trong

khi đó nang trứng có kích thước 2 – 5 mm đạt 55,73%. Cũng nghiên cứu ảnh

hưởng của kích thước nang trứng Lonergan và cs. (1994) thấy rằng, nang

trứng có kích thước 2 – 6 mm đạt 90,8% tỉ lệ hợp tử phân chia ở và 31,19%

hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Yang và cs. (1998) đã

nuôi tế bào trứng thu được từ những nang trứng có đường kính khác nhau:

0,5; 1,0; 1-2; 2 – 5 và 5 – 8 mm thu được tỉ lệ hợp tử tương ứng 31, 68, 84 và

77 %.

Hình 3.8. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 3 mức độ kích thước khác nhau

3.4. Ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội

* Ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội đến số

lượng nang trứng được hút và tế bào trứng thu được

Với 28 lượt buồng trứng được thực hiện cho thấy. Pha nang trứng phát

triển và pha nang trứng trội ảnh hưởng đến số lượng nang trứng được hút (P <

0,05). Có sự sai khác về số lượng nang trứng/buồng trứng/lần (P < 0,05), ở

pha nang trứng phát triển có số lượng nang trứng/buồng trứng/lần (14,93

nang) cao hơn pha nang trứng trội (8,93 nang).

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng

Nang trứng được hút

Tế bào trứng thu được

Pha của sóng

%

sóng nang

n

X ± SE

n

X ± SE

Pha phát triển

209

14,93a ± 0,67

163

11,64a ± 0,64

77,99

Pha trội

125

8,93b ± 0,46

99

7,07b ± 0,41

79,20

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; %: Tỉ lệ tế bào trứng thu

được/nang trứng được hút

trội đến số lượng nang trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được

Tế bào trứng thu được (Bảng 3.10) từ các nang trứng được hút cũng bị

ảnh hưởng bởi pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội một cách có ý

nghĩa (P < 0,05). Tế bào trứng thu được ở pha nang trứng phát triển cao hơn

(P < 0,05) pha nang trứng trội, tương ứng: 11,64 so với 7,07 tế bào

trứng/buồng trứng. Kết quả này có thể do các nang trứng ở pha nang trứng

trội một số nang trứng đã dần bị thoái hóa do có sự ức chế của nang trội. Mặc

dù số lượng nang trứng và tế bào trứng thu được khác nhau, nhưng tỉ lệ tế bào

trứng thu được/nang trứng được hút lại tương đối ổn định, với 77,99% ở pha

phát triển và 79% ở pha trội.

Hình 3.9. Buồng trứng ở pha nang trội

* Ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội đến chất

lượng tế bào trứng

Kết quả thu được (Bảng 3.11) cho thấy, có sự ảnh hưởng của pha nang

trứng phát triển và pha nang trứng trội đến chất lượng tế bào trứng loại A, B

và C (P < 0,05).

Có sự khác biệt giữa tế bào trứng loại A, B và C ở pha pha nang trứng

phát triển và pha nang trứng trội (P < 0,05). Ở pha nang trứng phát triển bình

quân số lượng tế bào trứng A, B và C/buồng trứng/lần tương ứng: 4,36; 4,14

và 2,00 tế bào trứng, cao hơn (p < 0,05) ở pha nang trứng trội tương ứng:

2,14; 2,36 và 1,00 tế bào trứng.

Không có sự sai khác giữa pha nang trứng phát triển và pha nang trứng

trội về số lượng tế bào trứng loại D (P > 0,05), bình quân số lượng tế bào

trứng loại D ở pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội, tương ứng:

1,14 và 1,57 tế bào trứng/buồng trứng/lần.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội

Chất lượng tế bào trứng

Pha sóng

A

B

C

D

nang

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

Pha phát

4,36a ± 0,31 (61)

4,14a ± 0,27 (58)

2,00a ± 0,36 (28)

1,14a ± 0,29 (16)

triển

1,00b ± 0,21 (14)

2,14b ± 0,21 (30)

2,36b ± 0,17 (33)

1,57a ± 0,17 (22) Pha trội Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; A, B, C và D: Chất lượng

tế bào trứng theo thứ tự từ cao đến thấp

đến chất lượng tế bào trứng

Tế bào trứng đem nuôi Tế bào trứng thành thục

(Các lớp tế bào cumulus liên chặt chẽ) (Các lớp màng cumulus giãn nở)

Hình 3.10. Tế bào trứng trước và sau khi nuôi

* Kết luận

Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi có thể đưa ra kết luận rằng, pha nang

trứng phát triển và pha nang trứng trội ảnh hưởng đến số lượng nang trứng

được hút và số lượng tế bào trứng thu được (P < 0,05). Ở pha nang trứng phát

triển cho số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, tế bào trứng loại A và

B/buồng trứng/lần cao nhât, tương ứng: 14,93 nang, 11,64 tế bào, 4,36 tế bào

trứng loại A và 4,14 tế bào trứng loại B.

Thu được thật nhiều tế bào trứng có chất lượng tốt từ bò được chọn lọc

là mục tiêu của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng để tạo phôi in vitro. Sự phát

triển của nang trứng trong một chu kỳ thay đổi theo từng giai đoạn của pha

nang trứng. Thí nghiệm này cho thấy ở pha nang trứng phát triển của pha

sóng nang cho kết quả cao hơn pha nang trứng trội. Có được kết quả này là do

ở pha nang trứng phát triển các nang trứng có kích thước từ 2mm trở lên phát

triển đồng loạt và chưa có sự ức chế của nang trội. Theo Các đợt sóng nang

được chia ra làm hai giai đoạn, bao gồm pha nang trứng phát triển, pha nang

trứng trội. Theo Hendriksen và cs. (2004), đợt sóng nang đầu tiên xuất hiện

vào ngày thứ 1 sau khi bò động dục, các nang trứng có kích thước 2mm trở

lên tham gia vào hình thành đợt sóng nang (pha phát triển), đến ngày thứ 3 trở

đi nang trứng trội bắt đầu phát triển nhanh hơn các nang trứng khác. Sau khi

nang trứng trội phát triển các ngày tiếp theo các nang trứng còn lại ngừng

phát triển và dần trở nên thoái hóa (pha nang trội). Còn ở pha nang trội kết

quả thu được thấp là do ở thời điểm này các nang trứng bị ảnh hưởng của pha

nang trứng trội lên các nang trứng còn lại, làm cho các nang trứng nhỏ hơn

dần bị thoái hóa.

Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi phù hợp với kết luận của

Hendriksen và cs. (2004), khi tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của pha nang

trứng trong đợt sóng nang lên khả năng phát triển của tế bào trứng bò và có

kết luận rằng, nang trội đã ức chế các nang còn lại, vì thế số lượng phôi thu

được có thể tăng lên khi siêu âm hút tế bào trứng vào khoảng thời gian từ 2 -

5 ngày sau khi bò động dục hay sau khi loại bỏ nang trội.

Siêu âm hút tế bào trứng được Hendriksen và cs. (2004) thực hiện vào

ngày thứ 2, thứ 5 và thứ 8 của chu kỳ động dục, tác giả thu được số lượng tế

bào trứng cao nhất ở ngày thứ 2 là 8,7 tế bào trứng/bò/lần (pha nang trứng

phát triển), trong khi đó ở ngày thứ 5 và thứ 8 thu được số lượng tế bào trứng

tương ứng: 4,3 và 5,4 tế bào trứng/bò (pha nang trội).

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu

của Machatkova và cs. (2004), khi ông thu được 9,6 tế bào trứng/bò ở pha

nang trứng phát triển và 3,9 tế bào trứng/bò ở pha nang trứng trội. Số phôi thu

được ở pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội, tương ứng: 3,5 và 1,1

phôi/bò/lần. Tác giả đưa ra kết luận rằng, pha nang trứng phát triển cho kết

quả tốt hơn pha nang trứng trội do ở pha nang trứng trội số lượng nang trứng

vừa và nhỏ bị giảm đáng kể. Như vậy từ kết quả nghiên cứu và các tác giả

khác đều cho thấy số lượng nang trứng ở pha nang trội rất thấp. Thực tế cho

thấy khi nang trội đạt đến kích thước từ 9 mm trở lên thì các nang trứng có

kích thước từ 2 mm trở lên rất ít (Hình 3.9).

Hình 3.11. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở hai pha sóng nang

3.5. Ảnh hưởng của liều lượng FSH

* Ảnh hưởng của liều lượng FSH số lượng nang trứng được hút và tế bào

trứng thu được

Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện trên 120 lượt buồng trứng. Kết

quả (Bảng 3.12) cho thấy, liều lượng FSH khác nhau có ảnh hưởng đến số

lượng nang trứng được hút (P < 0,05).

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các liều lượng FSH đến số lượng nang trứng

Nang trứng được hút

Tế bào trứng thu được

Liều FSH

%

n

X ± SE

n

X ± SE

ĐC

243

12,15a ± 0,36

184

9,20a ± 0,26

75,72

2 mg

250

12,50a ± 0,40

188

9,40a ± 0,33

75,20

3 mg

284

14,20b ± 0,68

215

10,75b ± 0,35

75,70

4 mg

285

14,25b ± 0,51

216

10,80b ± 0,42

75,79

5 mg

324

16,20c ± 0,57

248

12,40c ± 0,46

76,54

6 mg

321

245

12,25c ± 0,35

16,05c ± 0,47

76,32 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; ĐC: Đối chứng; %: Tỉ lệ

tế bào trứng thu được/nang trứng được hút

được hút và số lượng tế bào trứng thu được

Hầu hết bình quân số lượng nang trứng được hút ra ở các liều lượng

FSH , 3 mg, 4 mg, 5mg và 6 mg đều cao hơn so với liều lượng đối chứng

(không tiêm FSH; p < 0,05), tương ứng: 12,50; 14,20; 14,25; 16,20 và 16,05

nang trứng được hút/buồng trứng so với nhóm đối chứng 12,15 nang trứng

được hút/buồng trứng. Riêng liều lượng FSH 2 mg không có sự khác nhau rõ

rệt với nhóm đối chứng (P > 0,05). Ở hai liều lượng FSH 5 mg và 6 mg, số

lượng nang trứng được hút cao hơn có ý nghĩa so với các liều lượng 2mg,

3mg và 4mg.

Kết quả tế bào trứng thu được (Bảng 3.12) cho thấy, có sự sai khác

giữa các liều lượng FSH được sử dụng. Ở liều lượng FSH đối chứng và liều

lượng FSH 2 mg không có sự khác biệt, số lượng tế bào trứng thu được thấp

nhất, tương ứng: 9,20 và 9,40 tế bào. Tiếp đến là liều lượng FSH 3 mg và 4

mg có sự khác biệt (P < 0,05) và có số lượng tế bào trứng/buồng trứng cao

hơn liều lượng FSH đối chứng và liều lượng FSH 2 mg, tương ứng: 10,75 và

10,80 tế bào. Ở liều lượng FSH 5 mg và 6 mg có số lượng tế bào trứng/buồng

trứng cao (P < 0,05) hơn các liều FSH khác, tương ứng: 12,40 và 12,25 tế

bào.

Tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút tương đối ổn định giữa

các liều lượng FSH. Tỉ lệ tế bào trứng thu được ở các liều lượng tương ứng:

ĐC (75,72%), 2 mmg (75,20%), 3 mg (75,70%), 4 mg (75,79%), 5mg

(76,54%) và 6 mg (76,32%).

* Ảnh hưởng của liều lượng FSH đến chất lượng tế bào trứng

Kết quả nghiên cứu thu được (Bảng 3.13) cho thấy, có sự ảnh hưởng

của liều lượng FSH lên chất lượng tế bào trứng loại A và loại B, song không

có sự khác biệt về chất lượng tế bào trứng loại C. Còn chất lượng tế bào trứng

loại loại D có sự khác biệt (P < 0,05) giữu liều lượng FSH 6 mg với các liều

lượng còn lại.

Số lượng tế bào trứng loại A/buồng trứng/lần của liều lượng FSH đối

chứng và 2 mg không có sự khác nhau ( P < 0,05), số lượng tế bào trứng thu

được tương ứng: 3,25 so với 3,15 tế bào trứng/buồng trứng/lần. Tế bào trứng

loại A ở các liều lượng 3 mg, 4 mg, 5 mg và 6 mg không có sự sai khác có ý

nghĩa, số lượng tế bào trứng thu được, tương ứng 3,75; 3,80; 4,50 và 4,20 tế

bào trứng/buồng trứng/lần.

Không có sự sai khác (P < 0,05) giữa liều lượng FSH 2 mg, 3 mg và 4

mg so với liều lượng đối chứng, tương ứng: 3,20; 3,70 và 3,75 tế bào/buồng

trứng/lần so với 3,25 tế bào/buồng trứng/lần. Có sự sai khác về chất lượng tế

bào trứng loại B/buồng trứng/lần ở liều lượng 5 mg và 6 mg so với liều lượng

đối chứng, 2 mg, 3 mg và 4 mg (P < 0,05). Số lượng tế bào trứng/buồng

trứng/lần ở liều FSH 5 mg và 6 mg tương ứng: 4,45 và 4,20 tế bào trứng.

Chất lượng tế bào trứng

Liều

FSH

A

B

C

D

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

ĐC

3,15a ± 0,15 (63)

3,25a ± 0,24 (65) 2,10a ± 0,20 (42)

0,70a ± 0,19 (14)

2 mg

3,25a ± 0,23 (65)

3,20a ± 0,20 (64)

1,90a ± 0,14 (38)

1,05a ± 0,18 (21)

3 mg

3,75b ± 0,14 (75)

3,70a ± 0,29 (74)

2,10a ± 0,19 (42)

1,20a ± 0,21 (24)

4 mg

3,80b ± 0,22 (76)

3,75a ± 0,28 (75)

2,10a ± 0,14 (42)

1,15a ± 0,17 (23)

5 mg

4,50b ± 0,28 (90)

4,45b ± 0,21 (89)

2,40a ± 1,33 (48)

1,05a ± 0,17 (21)

6 mg

4,20b ± 0,24 (84)

4,20b ± 0,22 (84)

2,30a ± 0,13 (46)

1,55b ± 0,22 (31) Ghi chú: các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai khác

có ý nghĩa P < 0,05; X: bình quân/buồng trứng/lần; A, B, C và D: chất lượng tế

bào trứng theo thứ tự từ cao đến thấp; ĐC: đối chứng

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của liều lượng FSH đến chất lượng tế bào trứng

Không có sự khác biệt về tế bào trứng loại C/buồng trứng/lần (P >

0,05) ở tất cả các liều lượng FSH, số lượng tế bào trứng/buồng trứng/lần thu

được tương ứng ở các liều lượng: đối chứng, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg và 6 mg

tương ứng là 2,10; 1,90; 2,10; 2,10; 2,40 và 2,30 tế bào trứng..

Tế bào trứng có chất lượng loại D ở liều lượng FSH 6mg có sự sai khác

(P < 0,05) so với các liều lượng đối chứng, 2 mg, 3 mg, 4 mg và 5 mg, tương

ứng: 1,55 tế bào trứng so với 0,70; 1,05; 1,20; 1,15 và 1,05 tế bào trứng. Kết

quả này cho thấy số lượng tế bào trứng loại D ở liều lượng FSH 6 mg là cao

nhất. Thực tế cho thấy, khi siêu âm hút tế bào trứng những nang trứng có kích

thước lớn thì tế bào trứng thường bị lột trần, nguyên nhân này có thể là do tế

bào trứng ở các nang trứng lớn đang ở giai đoạn thành thục, do vậy các lớp

màng cumulus giãn nở, làm giảm sự liên kết giữa các lớp màng cumulus và tế

bào trứng. Vì vậy khi tăng liều lượng FSH lên 6 mg làm xuất hiện một số

nang trứng có kích thước lớn.

* Ảnh hưởng của liều lượng FSH đến hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi

nang thu được

Có sự sai khác giữa liều lượng FSH 5 mg và 6 mg so với liều lượng

FSH đối chứng, 2 mg, 3 mg và 4 mg (P < 0,05) về số lượng hợp tử phân

chia/buồng trứng/lần. Số lượng hợp tử phân chia ở kiều lượng FSH đối

chứng, 2 mg, 3 mg và 4 mg tương ứng: 3,35; 3,40; 4,00 và 4,10 hợp tử (Bảng

3.14). Trong khi đó số lượng tế bào trứng ở liều lượng FSH có sự khác biệt và

cao hơn so với các liều lượng trên, tương ứng: 5,05 và 4,55 hợp tử/buồng

trứng/lần.

Các liều lượng FSH đối chứng, 2 mg, 3 mg, 4 mg và 6 mg không có sự

sai khác (P < 0,05), số lượng phôi dâu và phôi nang thu được/buồng trứng/lần

tương ứng: 1,05; 1,10; 1,40; 1,45 và 1,80 phôi. Còn ở liều lượng FSH 5mg có

sự khác biệt so với các liều FSH còn lại (P < 0,05). Ở liều lượng FSH 5 mg

thu được 2,35 phôi dâu và phôi nang/buồng trứng/lần.

Tỉ lệ hợp tử phân ở các liều lượng đối chứng, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg

và 6 mg, tương ứng: 52,34; 52,71; 53,69; 54,30; 56,42 và 54,17%. Tương tự,

tỉ lệ phôi dâu và phôi nang/buồng trứng/lần ở các liều lượng FSH trên tương

ứng là: 16,41; 17,05; 18,79; 19,21; 31,13 và 20,11%. Như vậy ở liều FSH 5

mg có số lượng phôi dâu và phôi nang thu được lớn nhất, với 2,35 phôi/buồng

trứng/lần.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của liều lượng FSH đến sự phân chia của hợp tử,

Hợp tử phân chia

Phôi dâu và phôi nang

Liều

Tế bào trứng

FSH

nuôi in vitro (n)

X ± SE (n)

%

X ± SE (n)

%

ĐC

128

3,35a ± 0,65 (67)

52,34 1,05a ± 0,15 (21)

16,41

2 mg

129

3,40a ± 0,46 (68)

52,71 1,10a ± 0,16 (22)

17,05

3 mg

149

4,00a ± 0,49 (80)

53,69 1,40a ± 0,18 (28)

18,79

4 mg

151

4,10a ± 0,78 (82)

54,30 1,45a ± 0,15 (29)

19,21

5 mg

179

5,05b ± 0,87 (101)

56,42 2,35b ± 0,23 (47)

31,13

54,17 1.80a ± 0,24 (36)

4,55b ± 0,66 (91)

168

20,11 6 mg Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X:Bình quân/buồng trứng/lần; ĐC: Đối chứng; %: Tỉ lệ

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được/tế bào trứng nuôi in vitro

phôi dâu và phôi nang

* Kết luận:

Liều lượng FSH ảnh hưởng đến kết quả siêu âm hút tế bào trứng và tạo

phôi trong ống nghiệm (P < 0,05). Căn cứ vào phôi dâu và phôi nang thu

được/buồng trứng/lần cho thấy, liều lượng FSH 5 mg là thích hợp nhất.

Điều khiển sự phát triển của nang trứng luôn được các nhà khoa học

quan tâm nghiên cứu với nhằm tạo ra nhiều hơn những tế bào trứng có khả

năng phát triển và tạo phôi in vitro nhưng kết quả vẫn còn nhiều biến động.

Nuôi thành thục tế bào trứng là yếu tố khó cải tiến vì thậm chí sau khi đã lựa

chọn số lượng tế bào trứng rất đồng đều, nhưng chỉ 35% đạt sự thành thục về

tế bào chất và có khả năng phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang.

Phôi dâu chặt (A) Phôi nang sớm (A) Phôi nang sớm (A)

Phôi nang mở rộng (A) Phôi dâu chặt (B) Phôi dâu (B)

Phôi dâu chặt (C) Phôi dâu (C) Phôi chậm phát triển (D)

Phôi dâu (D) Phôi thoái hóa (D) Phôi nang thoát màng (A)

Hình 3.12. Một số hình ảnh về phôi dâu và phôi nang thu được có chất

lượng khác nhau

Thực tế cho thấy, nếu nuôi thành thục tế bào trứng được thực hiện bằng

cách nuôi thành thục in vitro, thụ tinh và nuôi phôi in vitro thì khả năng phát

triển của tế bào trứng tăng, tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được gấp đôi, xấp

xỉ 49% (Blondin và cs., 2002). Do vậy mà nguồn gốc nang trứng dường như

là yếu tố quan trọng nuôi dưỡng tế bào trứng để tế bào trứng phát triển. Và có

rất nhiều nghiên cứu xác định sự khác nhau về đặc điểm nang trứng với hy

vọng tìm ra yếu tố làm tăng khả năng phát triển nang trứng, tình trạng buồng

trứng, song kết quả vẫn bị hạn chế. Vì vậy các nhà khoa học đã thấy rằng sử

dụng hormone để kích thích làm tăng khả năng phát triển của nang trứng, kích

thước nang trứng và số lượng nang trứng trong pha phát triển. Có kết quả này

là do sự tác động của FSH đến sự phát triển của nang trứng ở tất cả các giai

đoạn (Govan và Black, 1975).

Liều FSH sử dụng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phát triển của

nang trứng. Nhiều tác giả đã sử dụng nhiều liều FSH để kích thích và thấy

rằng sử dụng nhiều liều FSH đem lại hiệu quả tốt hơn sử dụng 1 liều FSH

(Stubbings và cs., 1995; Walsh và cs., 1993). Sử dụng nhiều liều FSH làm

tăng kích thước nang trứng (Goodhand và cs., 2000). Bên cạnh đó, khoảng

cách thời gian cũng như phương pháp sử dụng FSH cũng ảnh hưởng trực tiếp

đến kết quả kích thích. Tiêm FSH 2 lần/ngày làm tăng khả năng phản ứng hơn

1 lần/ngày, với cùng một liều lượng (Walsh và cs., 1993).

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấy rằng, kết quả thu được ở liều

FSH 5 mg về số lượng nang được hút và số lượng tế bào trứng/buồng

trứng/lần mặc dù không có sự khác biệt so với liều lượng FSH 6 mg P <

0,05). Tương tự, số lượng tế bào trứng loại A/buồng trứng/lần không có sự

khác biệt so với liều lượng FSH 3 mg, 4 mg, 5 mg và 6 mg (P < 0,05), song

về số lượng phôi dâu và phôi nang thu được/buồng trứng/lần của liều lượng

FSH 5 mg lại có sự khác biệt và cao hơn liều lượng FSH 6 mg và các liều

lượng khác. Như vậy có thể nói rằng khi tăng hàm lượng FSH đến một mức

độ nhất định không những nâng cao được kích thước, số lượng nang trứng mà

còn tăng sự phát triển của hợp tử đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Tất cả

các liều FSH còn lại. Tuy nhiên nếu kích thích với một liều lượng vượt quá sự

cho phép có thể làm giảm chất lượng tế bào trứng, mặc dù kích thước và số

lượng tế bào trứng tăng lên.

Như vậy với liều lượng FSH thích hợp đã làm cho sự phát triển của tế

bào trứng đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang tăng lên. Hầu hết các tác giả

nghiên cứu đều có kết luận phù hợp với kết luận của chúng tôi, FSH làm tăng

số lượng nang trứng và chất lượng tế bào trứng (Goodhand và cs., 1999), làm

tăng số lượng tế bào trứng (Techakumphu và cs., 2000), làm tăng kích thước

của nang trứng (Goodhand và cs., 1999), làm tăng chất lượng tế bào trứng sau

khi tiêm FSH 3 ngày, phôi nang có chất lượng tốt hơn (Sirard và cs., 1999),

FSH thúc đẩy sự phát triển của nang trứng và tăng số lượng nang trứng có

mặt trên buồng trứng (Tanaka và cs., 2001). Ngoài ra giảm số lượng và thoái

hóa của nang trứng là do sự thiếu hụt hàm lượng FSH do nang trội sản xuất

insulin tác động ngược âm tính vào thùy trước tuyến yên làm giảm hàm hàm

lượng FSH dưới ngưỡng cần thiết hoặc do một số nguyên nhân khác. Do đó

khi đưa một bổ sung một liều lượng FSH ngoại sinh thích hợp sẽ làm giảm sự

thoái hóa của các nang trứng khi nang trội phát triển và tăng chất lượng tế bào

trứng.

Trong nghiên cứu này chúng tôi không tiến hành đánh giá ảnh hưởng

của FSH lên kích thước của nang trứng, song thực tế cho thấy, việc sử dụng

FSH để kích thích, các nang trứng có đồng đều hơn, thuận lợi cho việc quan

sát và hút tế bào trứng. Tuy nhiên, chi phí cho việc sử dụng FSH cũng góp

phần làm tăng giá thành của phôi tạo ra. Do vậy, sử dụng FSH cần được cân

nhắc trong một số trường hợp nhất định.

Hình 3.13. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 6 liều lượng FSH

khác nhau

3.6. Ảnh hưởng của giống bò

* Ảnh hưởng của giống đến số lượng nang trứng được hút và tế bào trứng thu

được

Siêu âm hút tế bào trứng được tiến hành trên 48 buồng trứng, số lượng

nang trứng ở bò F3 và bò HF thu được tương ứng, 244 và 272 nang trứng

được hút. Kết quả thu được ở bò HF và bò F3 cho thấy, có sự ảnh hưởng của

giống bò HF và bò F3 đến số lượng nang trứng được hút (P < 0,05). Số lượng

nang trứng/buồng trứng/lần HF lớn hơn ở bò F3, tương ứng: 11,33 so với

10,17 nang.

Có sự khác nhau rõ rệt (P < 0,05) về số tế bào trứng thu được/buồng

trứng/lần (Bảng 3.15) và ở bò HF cho số lượng tế bào trứng cao hơn (P <

0,05) bò F3, tương ứng: 8,92 so với 7,75 tế bào trứng.

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của giống bò cho tế bào trứng đến số lượng nang

Nang trứng được hút

Tế bào trứng thu được

Giống

%

n

X ± SE

n

X ± SE

F3

244

10,17a ± 0,27

186

7,75a ± 0,24

76,23

HF

272

11,33b ± 0,34

214

8,92b ± 0,25

78,68

Ghi chú:Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai khác

có ý nghĩa P < 0,05; X:Bình quân/buồng trứng/lần; %:Tỉ lệ tế bào trứng thu

được/nang trứng được hút

trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được

Không có sự chênh lệch nhiều về tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng

được hút ở bò F3 và HF, tương ứng: 76,23 và 78,68%.

* Ảnh hưởng giống đến chất lượng tế bào trứng

Tế bào trứng thu được từ hai giống bò khác nhau được đánh giá

theo mức độ A, B, C và D (bảng 3.16).

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của giống bò cho tế bào trứng đến chất lượng tế

Chất lượng tế bào trứng

Giống

A

B

C

D

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

F3

2,92 ± 0,16 (70)

2,83 ± 0,19 (68)

1,08 ± 0,20 (26)

0,92 ± 0,16 (22)

HF

3,25 ± 0,15 (78)

3,21 ± 0,17 (77)

1,42 ± 0,22 (34)

1,04 ± 0,18 (25)

Ghi chú: Bình quân về chất lượng tế bào trứng (A, B, C và D) giữa hai giống bò

được so sánh ở mức độ P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; A, B, C và D:

Chất lượng tế bào trứng theo thứ tự từ cao đến thấp

bào trứng

Qua kết quả thu được cho thấy, mặc dù có sự khác nhau về số lượng

nang trứng được hút, số lượng tế bào trứng/buồng trứng/lần, song chất lượng

tế bào trứng A, B, C và D lại không có sự khác nhau (P < 0,05).

Số lượng tế bào trứng loại A, B, C và D/buồng trứng/lần ở bò F3, tương ứng

là 2,92; 2,83; 1,08 và 0,92 tế bào trứng. Tương tự, bình quân số lượng tế bào

trứng A, B, C và D/buồng trứng/lần ở bò HF tương ứng là 3,25; 3,21; 1,42 và

1,04 tế bào.

* Ảnh hưởng của giống đến hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu

được

Từ số lượng tế bào trứng thu được, có 138 tế bào trứng được nuôi thành

thục (loại A và B), cho thấy, không có sự khác biệt về số lượng hợp tử phân

chia/buồng trứng/lần giữa bò HF và bò F3 (P < 0,05). Số lượng hợp tử/buồng

trứng/lần ở bò F3 là 3,33 hợp tử và 3,53 hợp tử ở bò HF.

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của giống bò cho tế bào trứng đến sự phân chia

Hợp tử phân chia

Phôi dâu và phôi nang

Tế bào trứng nuôi

Giống

in vitro (n)

X ± SE

%

X ± SE

%

3,33 ± 0,20 (80)

57,97

1,17 ± 0,08 (28)

20,29

F3

138

HF

155

3,54 ± 0,18 (85)

54,84

1,29 ± 0,11 (31)

20,00

Ghi chú: Bình quân về hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang giữa hai giống bò

được so sánh ở mức P < 0,05; X:Bình quân/buồng trứng/lần; %: Tỉ lệ hợp tử, phôi

dâu và phôi nang thu được/tế bào trứng nuôi in vitro

của hợp tử, phôi dâu và phôi nang

Số lượng phôi dâu và phôi nang thu được/buồng trứng/lần cũng không

có sự khác nhau giữa bò HF và bò F3 (P > 0,05), bình quân 1,17 dâu và phôi

nang thu được ở bò F3 và 1,29 phôi dâu và phôi nang ở bò HF.

Tỉ lệ hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu không có sự chênh

lệch nhiều giữa hai giống bò. Tỉ lệ hợp tử phân chia ở bò cho tế bào trứng F3

và HF tương ứng: 57,97 và 54,84%. Tương tự, tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu

được tương ứng: 20,29 và 20,00%.

Mặc dù không có sự khác biệt về chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân

chia, phôi dâu và phôi nang thu được/buồng trứng/lần nhưng số lượng nang

trứng được hút và số lượng tế bào trứng ở bò HF cao hơn bò F3, do vậy căn

cứ vào số lượng phôi dâu và phôi nang thu được/buồng trứng/lần cho thấy bò

HF cho kết quả tốt hơn, với 1,29 phôi.

* Kết luận:

Mặc dù chất lượng tế bào trứng, số lượng phôi dâu và phôi nang thu

được/buồng trứng/lần không có sự khác nhau giữa hai giống bò, song căn cứ

vào số lượng nang trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được/buồng

trứng/lần (P < 0,05) cho thấy, bò HF kết quả tốt hơn, với 1,29 phôi dâu và

phôi nang/buồng trứng/lần.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sự sai khác với tác giả Li và cs.

(2007) về số lượng nang trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được,

song về chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu

được lại phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi. Kết quả nghiên cứu của tác

giả cho thấy, không có sự khác nhau (P < 0,05) về số lượng nang trứng và số

lượng tế bào trứng thu được ở hai giống bê vàng Trung Quốc (Chinese

Yellow Heifer) và ở bò sữa HF (số lượng nang trứng được hút và số lượng tế

bào trứng/con cho/lần tương ứng: 12,1 và 6,6 so với 13,1 nang và 7,2 tế bào

trứng). Không có sự khác biệt về chất lượng tế bào trứng loại A, B và CD

giữa giống bê vàng Trung Quốc và bò HF (tương ứng: 1,5; 2,8 và 1,2 và 2,3;

3,3; 1,8 tế bào trứng; P > 0,05), tương tự tỉ lệ hợp tử phân chia/tế bào trứng

nuôi in vitro, phôi dâu và phôi nang thu được cũng không có sự khác nhau có

ý nghĩa (tương ứng: 69,5%; 25,7% và 68,3%; 24,4%). Song một số tác giả

khác lại công bố giống bò ảnh hưởng khả năng phát triển của tế bào trứng và

phôi (Goddard và Pratt, 1993); Fischer và cs., 2000).

Kết quả của chúng tôi không sai khác nhiều so với kết quả của một số

tác giả khác đã báo cáo. Nguyễn Thị Ước và cs. (1999) thu được tỉ lệ phát

triển đến giai đoạn phôi dâu đối với bò vàng là 22,8% và 26,9% ở bò Hà Ấn.

Nguyễn Hữu Đức và cs. (2003) đã nuôi hợp tử trong môi trường B2 có bổ

sung tế bào vero, tỉ lệ phôi nang quan sát được 25,88%. Tương tự, Bui Xuan

Nguyen. (2006) thu được tỉ lệ phôi dâu và phôi nang khi tiến hành thụ tinh

trong ống nghiệm ở bò lai Zebu-Yellow or Holstein-yellow là 30%.

Hình 3.14. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở hai giống bò cho tế

bào trứng khác nhau.

Do điều kiện kinh tế, khi hậu, điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng nên trong

ngành chăn nuôi bò sữa của nước ta đã tiến hành lai tạo bò sữa thuần (HF) với

giống bò địa phương để tăng khả năng thích nghi. Tuy năng suất sữa không

cao được bằng bò sữa thuần, song hiện nay giống bò F3 thường được nuôi

nhiều ở các nông hộ do khả năng thích nghi tốt và phù hợp với khả năng chăm

sóc nuôi dưỡng. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, việc khai thác tế bào trứng ở

bò F3 có năng suất và chất lượng tốt để tạo phôi in vitro se cho ra thế hệ đàn

con có khả năng thích nghi cao ở điều kiện nước ta.

3.7. Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng

* Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến số lượng nang trứng được hút

và tế bào trứng thu đươc

Với 114 lượt buồng trứng được thực hiện (Bảng 3.18) cho thấy, có sự

ảnh hưởng của bò 3 tuổi và bò 6 tuổi lên số lượng nang trứng được hút (p<

0,05). Số lượng nang trứng được hút ở bò 3 tuổi cao hơn (P < 0,05) bò 6 tuổi.

Số lượng nang trứng /buồng trứng/lần ở bò 3 tuổi và bò 6 tuổi tương ứng:

8,41 và 8,00 nang.

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến số lượng nang

Nang trứng được hút

Tế bào trứng thu được

Tuổi bò

%

n

X ± SE

n

X ± SE

3 tuổi

454

8,41a ± 0,22

389

7,20a ± 0,23

85,68

86,22

6 tuổi

472

8,00b ± 0,24

407

6,78b ± 0,13

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; %; Tỉ lệ tế bào trứng thu

được/nang trứng được hút

trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được

Từ nang trứng được hút, số lượng tế bào trứng thu được cũng có sự

khác nhau giữa bò 3 tuổi và bò 6 tuổi (P < 0,05). Số lượng tế bào trứng ở bò 3

tuổi thu được cao hơn bò 6 tuổi, số lượng tế bào trứng thu được tương ứng:

7,20 và 6,78 tế bào trứng/buồng trứng/lần. Như vậy có thể thấy, số lượng

nang trứng ở bò 3 tuổi cao hơn bò 6 tuổi thì số lượng nang trứng cũng cao

hơn. Kết quả này cũng được thể hiện qua tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang

trứng được hút ở bò 3 tuổi và bò 6 tuổi, tương ứng: 85,68% và 86,22%.

* Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến chất lượng tế bào trứng

Trong thí nghiệm này do điều kiện thời gian không cho phép nên chất

lượng tế bào trứng được đánh giá theo hai nhóm chất lượng AB và CD. Từ

kết quả thu được cho thấy, mặc dù có sự khác nhau về số lượng nang trứng và

số lượng tế bào trứng thu được/buồng trứng/lần nhưng chất lượng tế bào

trứng lại không có sự khác nhau. Kết quả thu được (Bảng 3.19) cho thấy,

không có sự khác nhau có ý nghĩa về chất lượng tế bào trứng loại AB giữa bò

3 tuổi và bò 6 tuổi. Số lượng tế bào trứng loại AB thu được ở bò 3 tuổi và bò

6 tuổi tương ứng: 5,39 và 5,12 tế bào.

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến chất lượng tế bào

Chất lượng tế bào trứng

Tuổi bò

A, B

C, D

n

X ± SE

n

X ± SE

3 tuổi

291

5,39 ± 0,12

98

1,81 ± 0,03

6 tuổi

307

5,12 ± 0,09

100

1,74 ± 0,13

Ghi chú: Bình quân về chất lượng tế bào trứng A, B và C, D được so sánh ở mức P

< 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; A, B, C và D: Chất lượng tế bào trứng theo

thứ tự từ cao đến thấp

trứng

Không có sự khác nhau về chất lượng tế bào trứng giữa bò 3 tuổi và bò

6 tuổi về tế bào trứng có chất lượng CD (P < 0,05). Số lượng tế bào trứng loại

CD tương ứng: 1,81 tế bào trứng/buồng trứng/lần và ở bò 6 tuổi là 1,74 tế bào

trứng/buồng trứng/lần.

* Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến hợp tử phân chia, phôi dâu và

phôi nang thu được.

Không có sự ảnh hưởng giữa bò 3 tuổi và bò 6 tuổi P > 0,05) về số

lượng hợp tử phân chia (Bảng 3.20). Số lượng hợp tử phân chia ở bò 3 tuổi và

bò 6 tuổi thu được/buồng trứng/lần tương ứng: 3,13 và 2,87 hợp tử, đạt tỉ lệ

tương ứng: 58,08 và 56,03%.

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến sự phân chia của

Tế bào trứng

Hợp tử phân chia

Phôi dâu và phôi nang

Tuổi bò

nuôi in vitro (n)

n

X ± SE

%

n

X ± SE

%

169

3,13 ± 0,13

58,08

59

1,09 ± 0,10

20,27

3 tuổi

291

6 tuổi

307

172

2,87 ± 0,17

56,03

56

0,93 ± 0,10

18,24

Ghi chú: Bình quân hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang giữa hai độ tuổi được

so sánh ở mức P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; %: Tỉ lệ hợp tử, phôi dâu

và phôi nang thu được/tế bào trứng nuôi in vitro

hợp tử, phôi dâu và phôi nang

Về kết quả phôi dâu và phôi nang thu được cũng không có sự sai khác

giữa bò 3 tuổi và bò 6 tuổi (P > 0,05). Tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được/tế

bào trứng nuôi in vitro ở bò 3 tuổi chiếm 20,27%, đạt 1,09 phôi dâu và phôi

nang/buồng trứng/lần. Ở bò 6 tuổi, phôi dâu và phôi nang đạt 0,93

* Kết luận:

phôi/buồng, chiếm 18,24 % tế bào đem nuôi in vitro.

Qua kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, không có sự khác nhau về

số lượng hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được giữa bò 3 tuổi và

bò 6 tuổi, nhưng số lượng nang trứng và số lượng tế bào trứng thu được lại

có sự khác nhau ta thấy rằng bò 3 tuổi cho kết quả tốt hơn bò 6 tuổi.

Hình 3.15. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở bò 3 tuổi và bò 6

tuổi

Su và cs. (2009) tiến hành siêu âm hút tế bào trứng ở bê (12 tháng tuổi),

bò đang ở độ tuổi sinh sản (7 – 8 tuổi) và bò già (15 tuổi trở lên) để đánh giá

sự ảnh hưởng của tuổi con cho tế bào trứng đến khả năng phát triển của tế bào

trứng khi siêu âm hút tế bào trứng từ bò sống. Kết quả thu được cho thấy số

lượng tế bào trứng thu được có sự khác nhau giữa ba nhóm bò cho tế bào

trứng (P < 0,05), bình quân tế bào trứng/bò/lần tương ứng với ba nhóm bò

trên: 7,3; 6,1 và 4,7 tế bào trứng. Số lượng hợp tử phân chia và phôi nang thu

được cũng có sự khác nhau rõ rệt ( P < 0,05) giữa các nhóm bò. Cũng nghiên

cứu ảnh hưởng của tuổi. Rizos và cs. (2005) số lượng nang trứng/buồng

trứng/lần ở bò hậu bị lớn hơn bò cái sinh sản, tương ứng: 10,4 và 7,8 nang.

Roth và cs. (2008) tiến hành nghiên cứu thu tế bào trứng ở bê và bò sữa HF

thấy rằng số lượng tế bào trứng thu được/bò/lần (16,0 tế bào) cao hơn ở bê

(16,0 tế bào trứng) và tỉ lệ phôi nang thu được ở bò và bê tương ứng: 32,5 và

22,8 %. Mermillod và cs. (1992) thấy rằng ở bò cho có độ tuổi 1 - 3 cao hơn

bò trưởng thành. Matthiesen (2011) nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi bò cho tế

bào trứng ở bê 14 tháng, bò 2 – 4 năm tuổi và bò cho thấy, có sự ảnh hưởng

của bò cho tế bào trứng. Số lượng nang trứng tăng lên khi tuổi bò tăng lên, số

lượng màng cumulus ở bò già cũng cao hơn bò bê 14 tháng tuổi và bò non 2 –

4 năm tuổi. Song tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi phôi nang ở bê 14 tháng

tuổi cao hơn ở bò non 2 – 4 năm (tương ứng: 17,4% và 5,1%). Ngoài ra một

số tác giả khác cũng đưa ra kết luận liên quan đến ảnh hưởng của tuổi như số

lượng nang trứng và chất lượng phôi giảm khi độ tuổi của bò tăng lên (Kruip

và cs., 1994). Hàm lượng estradiol giảm và progesterone tăng ở bò lớn tuổi có

thể là nguyên nhân làm cho số lượng nang trứng và số lượng tế bào trứng

giảm và do vậy ảnh hưởng của tuổi lên khả năng phát triển của tế bào trứng

có thể là do sự mất cân bằng của hormone. Nhìn chung bò cho tế bào trứng ở

độ tuổi khác nhau có tình trạng sinh lý sinh sản khác nhau. Sự thay đổi về tình

trạng sinh lý sinh sản sẽ thay đổi khả năng cho tế bào trứng, chất lượng tế bào

trứng và khả năng sản xuất phôi (Rizos và cs., 2005).

3.8. Ảnh hưởng của mùa vụ

* Ảnh hưởng của mùa vụ đến số lượng nang trứng được hút và tế bào trứng

thu được

Siêu âm hút tế bào trứng được tiến hành trên 48 lượt buồng trứng để

đánh giá mức độ ảnh hưởng của mùa vụ (đông – xuân và hè – thu) lên kết quả

số lượng nang trứng và tế bào trứng thu được, thấy rằng: không có sự ảnh

hưởng khác biệt giữa hai mùa vụ đông - xuân và hè - thu (P > 0,05). Bình

quân số lượng nang trứng thu được ở mùa vụ đông – xuân và hè – thu, tương

ứng là: 10,96 và 10,08 nang trứng/buồng trứng/lần. Tế bào trứng thu được từ

các nang trứng được hút cũng không có sự khác nhau (P > 0,05). Số lượng tế

bào trứng thu được/buồng trứng/lần ở mùa vụ đông – xuân và hè – thu, tương

ứng: 8,67 và 7,92 tế bào trứng.

Tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút không có sự chênh

lệch nhiều, ở vụ đông – xuân là 79,09% và vụ hè thu là 78,51%.

Bảng 3.21. Ảnh hưởng của mùa vụ đến số lượng nang trứng được hút và

Nang trứng được hút

Tế bào trứng thu được

Mùa vụ

%

n

X ± SE

n

X ± SE

Đông-xuân

263

10,96 ± 0,31

208

8,67 ± 0,27

79,09

78,51

Hè-thu

242

10,08 ± 0,26

190

7,92 ± 0,24

Ghi chú: Bình quân về nang trứng được hút và tế bào trứng được giữa hai vụ được

so sánh ở mức P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; %: Tỉ lệ tế bào trứng thu

được/nang trứng được hút

số lượng tế bào trứng thu được

* Ảnh hưởng của mùa vụ đến chất lượng tế bào trứng

Kết quả cho thấy, mặc dù số lượng nang trứng và số lượng tế bào trứng

thu được/buồng trứng/lần ở vụ đông – xuân và hè - thu không có sự khác

nhau, song chất lượng tế bào trứng loại A lại có sự khác nhau (P < 0,0%). Số

lượng tế bào trứng loại A thu được ở vụ đông – xuân cao hơn vụ hè thu,

tương ứng: 3,29 so với 2,67 tế bào trứng/buồng trứng/lần. Như vậy có thể nói

chất lượng tế bào trứng loại A ở vụ đông – xuân tốt hơn vụ hè – thu.

Không có sự khác biệt về chất lượng tế bào trứng B, C và D giữa vụ

đông – xuân và vụ hè – thu. Số lượng tế bào trứng loại B, C và D ở vụ đông –

xuân tương ứng: 2,86; 1,50 và 1,00 tế bào trứng/buồng trứng/lần. Tương tự, tế

bào trứng loại B, C và D ở vụ hè – thu tương ứng: 2,83; 1,36 và 1,04 tế bào

trứng/buồng trứng/lần.

Chất lượng tế bào trứng

Mùa vụ

A

B

C

D

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

X ± SE (n)

Đông-xuân

3,29a ± 0,19 (79)

2,86a ± 0,19 (69) 1,50a ± 0,14 (36) 1,00a ± 0,17 (24)

Hè-thu

2,83a ± 0,13 (68) 1,36a ± 0,2 (33)

2,67b ± 0,14 (64)

1,04a ± 0,15 (25) Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; A, B, C và D: Chất

lượng tế bào trứng theo thứ tự từ cao đến thấp

Bảng 3.22. Ảnh hưởng của mùa vụ đến chất lượng tế bào trứng

* Ảnh hưởng của mùa vụ đến hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu

được

Qua kết quả hợp tử phân chia cho thấy, mùa vụ có sự ảnh hưởng lên số

lượng hợp tử phân chia (P < 0,05) (Bảng 3.23).

Bảng 3.23. Ảnh hưởng của mùa vụ đến sự phân chia của hợp tử, phôi dâu

Tế bào

Hợp tử phân chia

Phôi dâu và phôi nang

Mùa vụ

trứng nuôi

X ± SE (n)

X ± SE (n)

%

%

in vitro (n)

Đông-Xuân

148

3,63a ± 0,24 (87)

58,78 1,46a ± 0,10 (35)

23,65

Hè–Thu

132

2,96b ± 0,15 (71)

53,79 1,08b ± 0,13b (26)

19,70

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai

khác có ý nghĩa P < 0,05; X: Bình quân/buồng trứng/lần; %: Tỉ lệ hợp tử phân

chia, phôi dâu và phôi nang thu được/tế bào trứng nuôi in vitro

và phôi nang

Mùa vụ đông - xuân có có số lượng hợp tử/buồng trứng/lần cao hơn (P

< 0,05) mùa vụ hè – thu, tương ứng: 3,63 hợp tử so với 2,96 hợp tử. Hợp tử

phân chia ở vụ đông – xuân và hè – thu có tỉ lệ (hợp tử phân chia/tế bào trứng

nuôi in vitro), tương ứng: 58,78% và 53,79%.

Bình quân số lượng phôi dâu và phôi nang thu được/buồng trứng/lần có

sự khác biệt giữa hai vụ (P < 0,05). Vụ đông – xuân có số lượng phôi dâu và

phôi nang/buồng trứng/lần là 1,46 phôi, cao hơn mùa vụ hè – thu là 1,08 phôi.

Căn cứ vào tỉ lệ cho thấy, tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được ở mùa vụ đông

– xuân và mùa vụ hè – thu, tương ứng: 23,65 và 19,70%.

* Kết luận

Từ kết quả thu được cho thấy, mặc dù số lượng tế bào trứng ở vụ đông

– xuân và vụ hè – thu không có sự khác nhau, song chất lượng tế bào trứng

loại A, số lượng hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được lại có sự

khác nhau. Và ở mùa vụ đông – xuân cho kết quả tốt hơn, với 3,63 hợp tử và

1,46 phôi/buồng trứng/lần.

Có thể thấy rằng nhiệt độ và độ ẩm của môi trường vào các mùa khác

nhau đã ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Vấn đề này được nhiều tác giả

trên thế giới quan tâm nghiên cứu và đưa ra kết luận: nhiệt độ và độ ẩm cao

ảnh hưởng xấu đến khả năng thành thục và thụ tinh của tế bào trứng

(Leibfried – Rutledge và cs.,1989), khả năng sống sót của phôi in vivo giảm

từ 59% xuống còn 27% vào mùa nóng (Rehman và cs., 1994), chất lượng tế

bào trứng giảm xuống vào mùa hè, thậm chí sau 42 ngày làm giảm nhiệt độ

xuống cũng chưa thay đổi được sự ảnh hưởng đó, tương tự thì khả năng phát

triển của hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi nang giảm xuống ở mùa hè (AI-

Katanani và cs., 2002), stress nhiệt có thể làm thay đổi các thành phần

phospholipid của tế bào trứng và có sự ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm của

môi trường đến các tuyến nội tiết và đến sự phát triển của nang trứng theo kết

quả nghiên cứu của (Zeron và cs., 2001).

Hình 3.16. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở vụ đông – xuân và

vụ hè – thu

Rocha và cs. (1998) đã nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ (mùa nóng

và mùa lạnh) cho thấy, có sự ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm của môi

trường (P < 0,01). Kết quả số lượng tế bào trứng thu được, tỉ lệ tế bào trứng

bình thường, phôi 2 tế bào, phôi 8 tế bào, tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được

(tương ứng: 67; 80,0; 59,8; 44,4; 34,2 và 29,0 ở mùa lạnh so so với 28; 24,6;

52,3; 1,1; 0 và 0 ở mùa nóng). Như vậy có thể thấy ở mùa vụ hè – thu ở nước

ta nhiệt độ cao và độ ẩm cao đã làm ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng,

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được.

Chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia thu được ở mùa vụ hè – thu

thấp hơn vụ đông xuân là do ảnh hưởng bởi stress nhiệt, do vụ hè – thu có

nhiệt độ cao và khí hậu hanh khô (phụ lục). Sự ảnh hưởng bởi stress nhiệt lên

kết quả siêu âm hút tế bào trứng có thể thấy như sau: Khi nhiệt độ tăng lên thì

nhiệt độ cơ thể bò cũng tăng lên làm ảnh hưởng đến khả năng thu nhận vật

chất khô để ngăn chặn sự tăng lên của nhiệt độ trong quá trình tiêu hóa và

điều khiển sự sinh nhiệt do quá trình trao đổi chất. Giảm quá trình trao đổi

chất làm thay đổi sự cân bằng năng lượng và dinh dưỡng, hạn chế quá trình

tiết hormone GnRH và LH (Hình 3.16). Quá trình trao đổi chất thay đổi làm

ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của tế bào hạt do glucose trong dịch

nang trứng giảm xuống (glucose được sử dụng chủ yếu như một loại nhiên

liệu cho các tế bào buồng trứng), do vậy làm giảm chất lượng tế bào trứng.

Ngoài ra nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu thấy rằng, giảm chất lượng tế bào

trứng là do urê trong dịch nang trứng tăng lên do quá trình dị hóa protein,

giảm tiết steroid. Theo Rensis và Scaramuzzi (2003), ảnh hưởng của stress

nhiệt có thể cũng tác động vào sự phát triển của nang trứng và progesterone là

nguyên nhân làm thay đổi chất lượng tế bào trứng. Còn theo Santos và cs.

(2008) dinh dưỡng là yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phát triển của nang

trứng, chất lượng tế bào trứng và khả năng phát triển in vitro của tế bào trứng.

Nghiên cứu công nghệ cấy truyền phôi ở nước ta trên gia súc được

nghiên cứu từ đầu những năm 1990 và cho đến nay các nhà khoa học nước ta

đã gặt hái được rất nhiều thành công. Bùi Xuân Nguyên và cs. (1994) đã

thành công trong việc nghiên cứu nuôi trứng và thụ tinh ống nghiệm ở trâu

bò. Tiếp theo sự thành công đó là sự thành công của rất nhiều nghiên cứu.

Nghiên cứu sự chín nhân ở tế bao trứng trâu đầm lầy được nuôi trong ống

nghiệm (Nguyễn Thị Ước và cs., 1996). Trạng thái phát triển của nhân tế bào

trứng thu từ buồng trứng của bò nội Việt Nam (Nguyễn Hữu Đức và cs.,

1996). Khả năng cung cấp tế bào trứng để thụ tinh trong ống nghiệm của trâu

và bò nôi (Bùi Xuân Nguyên và cs., 1997). Tinh trùng bò dùng trong thụ tinh

ống nghiệm (Nguyễn Hữu Đức và cs., 1998). Sản xuất phôi bò bằng thụ tinh

ống nghiệm, sản xuất bò sữa giống thương phẩm bằng cấy phôi thụ tinh ống

nghiệm và xác định giới tính (Nguyễn Thị Ước và cs., 1999). Bê thụ tinh ống

nghiệm đầu tiên đã ra đời tại Viện Công nghệ sinh học (Nguyễn Hữu Đức và

cs., 2003). Và cho đến nay hàng trăm nghiên cứu đã thành công, hàng trăm

con bê đã được sinh ra từ công nghệ cấy truyền phôi. Sự thành công của mỗi

nghiên cứu là vô cùng quan trọng, đặc biệt đàn gia súc có khả năng thích nghi

tốt với khí hậu của nước ta.

Oestradiol tiết ra

Chất lượng tế bào trứng

Glucose

Nhiệt độ cơ thể > 390C

Nhu cầu năng lượng duy trì

Cân bằng năng lượng thay đổi

Khả năng thu nhận vật chất khô

STRESS NHIỆT

Hình 3.17. Ảnh hưởng của stress nhiệt lên chất lượng tế bào trứng

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận

1. Luận án đã nghiên cứu 8 yếu tố ảnh hưởng đến việc thu tế bào trứng trên

bò sống để tạo phôi bò trong ống nghiệm. Xác định được từng yếu tố thích

hợp phù hợp với thiết bị, máy móc, khí hậu, bò cho tế bào trứng được nuôi

dưỡng chăm sóc và thích nghi với điều kiện khí hậu của nước ta. Nâng cao

được số lượng, chất lượng của tế bào trứng, hợp tử và phôi. Hạn chế tối đa

kính phí, thời gian và hạ giá thành của phôi.

2. Có sự ảnh hưởng của áp lực hút (60, 90, 120 và 150 mmHg) đến hiệu quả

của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm (P <

0,05). Ở áp lực hút 120 mmHg cho số phôi dâu và phôi nang/buồng trứng/lần

cao nhất, đạt 1,11 phôi.

3. Có sự ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng (2, 1 và ½ tuần) đến

hiệu quả của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống

nghiệm (P < 0,05). Ở tần suất ½ tuần/lần cho số lượng phôi dâu và phôi

nang/buồng trứng/lần cao nhất, đạt 1,83 phôi.

4. Có sự ảnh hưởng của kích thước nang trứng (2 – 5, 6 – 9 và ≥ 10 mm) đến

hiệu quả của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống

nghiệm (P < 0,05). Ở nang trứng có kích thước 2 – 5 mm cho số lượng phôi

dâu và phôi nang/buồng trứng/lần cao nhất, đạt 1,58 phôi.

5. Có sự ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội đến

hiệu quả của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống

nghiệm (P < 0,05). Ở pha nang trứng phát triển cho số lượng nang trứng, số

lượng tế bào trứng loại A và B/buồng trứng/lần cao hơn pha nang trội, đạt

14,93 nang, 4,36 tế bào trứng loại A và 4,14 tế bào trứng loại B.

6. Có sự ảnh hưởng của liều lượng FSH (0, 2, 3, 4, 5 và 6 mg) đến hiệu quả

của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm (P <

0,05). Ở liều lượng FSH 5mg cho số lượng phôi dâu và phôi nang/buồng

trứng/lần cao nhất, đạt 2,35 phôi.

7. Có sự ảnh hưởng của giống bò (bò HF và bò F3) đến hiệu quả của kỹ thuật

siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm (P < 0,05). Bò HF

số lượng phôi dâu và phôi nang/buồng trứng/lần cao nhất, đạt 1,29 phôi.

8. Có sự ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng (3 tuổi và 6 tuổi) đến số

lượng nang trứng và số lượng tế bào trứng thu được (P < 0,05). Bò 3 tuổi cho

số lượng phôi dâu và phôi nang/buồng trứng/lần cao hơn bò 6 tuổi, 1,09 phôi.

9. Có sự ảnh hưởng của mùa vụ (đông – xuân và hè – thu) đến hiệu quả của

kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm (P < 0,05).

Ở vụ đông - xuân cho số lượng phôi dâu và phôi nang/buồng trứng/lần cao

hơn vụ hè – thu, đạt 1,46 phôi.

10. Nghiên cứu thành công việc sử dụng kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng

trên bò sống để tạo phôi trong ống nghiệm, mở ra một bước ngoặt mới trong

việc khai thác tiềm năng di truyền của những bò sữa cao sản và nhân nhanh

giá trị di truyền đó vào thực tế sản xuất. Góp phần nâng cao hiệu quả và tăng

khả năng ứng dụng rộng rãi công nghệ cấy truyền phôi trong ngành chăn nuôi

bò sữa của nước ta. Nâng cao năng suất sữa và hạn chế quá trình nhập bò từ

các nước khác và làm tiền đề cho các nghiên cứu cơ bản khác.

Đề nghị

Để tăng được hiệu quả siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong

ống nghiệm nên siêu âm hút tế bào trứng ở bò HF (3 tuổi), từ các nang trứng

có kích thước 2 – 5 mm hoặc pha nang trứng phát triển với tần suất ½

tuần/lần, ở áp lực hút 120 mmHg, vào vụ đông – xuân, sử dụng FSH với liều

lượng 5mg để kích thích.

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Phan Lê Sơn, Nguyễn Thị Thoa, Lưu Công Khánh, Chu Thị Yến, Nguyễn

Thị Hương, Phạm Khánh Vân, Lưu Thị Ngọc Anh (2009), “Ảnh hưởng của

tuổi bò đến số lượng và chất lượng tế bào trứng chọc hút bằng siêu âm”, Tạp

chí khoa học công nghệ chăn nuôi – Viện Chăn nuôi, số 21, tr. 48-52.

2. Phan Lê Sơn, Nguyễn Văn Lý, Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Khánh Vân, Vũ

Ngọc Hiệu, Lưu Thị Ngọc Anh (2009), “Ảnh hưởng của tần suất siêu âm đến

kết quả thu tế bào trứng từ bò sống để tạo phôi in vitro”, Tạp chí khoa học

công nghệ chăn nuôi – Viện Chăn nuôi, số 21, tr. 53-58.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

* Tiếng việt

1. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu,

Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thùy

Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên (2003), Kết quả thụ tinh ống

nghiệm và cấy phôi ở bò lai Sind, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc.

NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 699-702.

2. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Bùi Xuân Nguyên (1996), Trạng

thái phát triển nhân tế bào trứng thu từ buồng trứng của bò nội Việt Nam,

Kỷ yếu Viện công nghệ Sinh học 1996.

3. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Bùi Linh Chi, Bùi Xuân

Nguyên (1998), Nghiên cứu chọn lọc tinh trùng bò dùng trong thụ tinh

ống nghiệm, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 1998. NXB Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 169 – 174.

4. Nguyễn Văn Lý (2006), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thụ

tinh trong ống nghiệm ở bò tại Việt Nam. Luận án tiến sỹ Nông nghiệp,

Viện Chăn nuôi, tr. 140-143.

5. Nguyễn Văn lý, Lưu Công Khánh, Nguyễn Thị Thoa, Phan Lê Sơn, Chu

Thị Yến, Nguyễn Thị Kim Anh, Vũ Ngọc Hiệu (2007), Nghiên cứu ứng

dụng kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng từ bò sống để tạo phôi trong ống

nghiệm. Tạp chí khoa học công nghệ chăn nuôi. Số 1, tr. 54-58.

6. Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Nguyễn Thị Ước

(1994), Kết quả bước đầu nghiên cứu nuôi trứng và thụ tinh in vitro trâu

bò, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 1994. NXB Khoa học và Kỹ thuật,

Hà Nội, tr. 166-168.

7. Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Nguyễn Thị Ước

(1997), Khảo sát khả năng cung cấp trứng để thụ tinh in vitro: nghiên cứu

so sánh ở trâu và bò nội, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 1997. NXB

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 510-517.

8. Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Bùi Xuân Nguyên

(1996), Sự chín nhân ở tế bào trứng trâu đầm lầy nuôi in-vitro trong môi

trường M 199 có bổ sung FSH và estradiol-17B, Kỷ yếu 1996, Viện Công

nghệ Sinh học.

9. Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Bùi Linh Chi, Hoàng

Nghĩa Sơn, Bùi Xuân Nguyên (1999), Sản xuất phôi bò bằng thụ tinh ống

nghiệm, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn Quốc. NXB Khoa học và Kỹ

thuật, Hà Nội, tr. 934-936.

* Tiếng anh

10. Adams G. P. (1999), Comparative patterns of follicle development and

selection in ruminants, Journal of Reproduction and Fertility,

Supplememt 54: Reproduction in Domestic Ruminants IV, pp. 17-32

11. Adams G. P., Matteri R, L,, Ginther O. J. (1992), Effect of progesterone

on ovarian follicles, emergence of follicular waves and circulating

follicle-stimulating hormone in heifers, Journal of Reproduction and

Fertility, 95, pp. 627-640.

12. Adashi E. Y. (1996), The ovarian follicular apparatus, Reproductive

endocrinology, Lippincott-Raven Publisher, pp. 17 - 40

13. Ahmad N., Townsend E. C., Dailey R. A., Inskeep E.K. (1997),

Relationship of hormonal patterns and fertility to occurrence of two or

three waves of ovarian follicles, before and after breeding, in beef cows

and heifers, Animal Reproduction Science, 49, pp. 13-28.

14. AI - Katanani Y. M., Webb D. W., Hansen P. J. (1999), Factors affecting

seasonal variation in 90-day nonreturn rate to first service in lactating

Holstein cows in a hot climate, Journal of Dairy Science, 82, pp. 2611-

2616.

15. Al - Katanani Y. M., Paula-Lopez F. F., Hansen P. J. (2002), Effect of

season and exposure to heat stress on oocyte competence in Holstein

cows, Journal of Dairy Science, 85, pp. 390 - 396.

16. Ali A., Coenon K., Bousquet D., Sirard M. A. (2004), Origin of bovine

follicular fluid and its effect during IVM on the development competence

of bovine oocytes, Theriogenology, 62, pp. 1596-1606.

17. Alvarez B. A., Merchan L. H. (1986), Mouse primordial germ cells use

fibronectin as a substrate for migration, Experimental Cell Research, 165,

pp. 362-368.

18. Arlotto, T., Schwartz, J.L., First, N.L. and Leibfried-Rutledge, M.L.

(1996), Aspect of follicle and oocyte stage that affect in vitro maturation

and development of bovine oocytes. Theriogenology, 45, pp. 943-956

19. Arlotto T., Schwartz J.L., First N. L., Leibfried-Rutledge M. L. (1999),

Aspects of follicle andoocyte stage that affect IVM and development of

bovine oocytes, Theriogenology, 51, pp. 1128-1134.

20. Austin C. R. (1951), Observations on the penetration of the sperm into the

mammalian egg, Australian Journal of Scientific Resreach, 4, pp. 581-

596.

21. Bavister B. D. (1996), Culture of preimplantation embryos: facts and

artifacts, Hum Reprod Update, 1, pp. 91-148.

22. Bavister B. D., Rose-Hallekent T.A., Pinyopumitr T. (1992),

Development of IVM-IVF bovine embryos to morulae and blastocyst in

defined culture media, Theriogenology, 45, pp. 227-246.

23. Bearden H. J., Fuquay J. W. (2000), The female reproduction system,

Applied Animal reproduction, Prentice Hall, InC, pp 7-20.

24. Bedford J. M., Kim H. H. (1993), Cumulus oophorus as sperm

sequestering device in vivo, Journal of Experimental Zoology, 265, pp.

321-328.

25. Block, Chase C. C. Jr., Hansen P. J. (2002), Inheritance of resistance of

bovine preimplantation embryos to heat shock: relative importance of the

maternal versus payernal contributin, Molecular Reprodcution and

Development, 63, pp. 32-37.

26. Blondin P., Sirard. (1995), Oocyte and follicular morphology as

determining characteristics for developmental competence in bovine

oocyte, Molecular Reproduction and Development, 1, pp. 54-62.

27. Blondin P., Bousquet D., Twagiramunga H., Barnes F., Sirard. (2002),

Manipulation of follicular developmentally competent bovine oocytes,

Biology of reproduction, 66, pp. 38-43.

28. Bols P. E. J., Leroy J. L. M. R., Vanholder T., Van soom A. (2003), A

comparision of mechanical sector and a linear array transducer for

ultrasound-guided transvaginal oocyte retrieval (OPU) in the cow,

Theriogenology, 62, pp. 906-914.

29. Bols P. E. J., Van Soom A., Ysebaert M. T., Vandenheede J. M. M., De

Kruif A. (1996), Effects of aspiration vacuum and needle diameter on

cumulus oocyte complex morphology and developmental capacity of

bovine oocytes, Theriogenology, 45, pp. 1001-1014.

30. Bondioli K. R., Wright R. W. (1983), In vitro fertilization of bovine

oocytes by sperm capacitated in vitro, Journal of Animal Science, 57, pp.

1001-1012.

31. Brackett B. G., Oliphan G. (1975), Capacitation of rabbit spermatozoa in

vitro, Biology of Reproduction, 12, pp. 260-274.

32. Braw-Tal R., Yossefi S. (1997), Studies in vivo and in vitro on the

initiation of follicle growth in the bovine ovary, Journal of Reproduction

and Fertility, 109, pp. 165-171.

33. Buccione R., Schroeder A. C., Eppig J. J. (1990), Interactions between

somatic cell and germ cells throughout mammalian oogenesis, Biology

Reproduction, 43, pp. 543-547.

34. Byskov A. G., Hoyer P. E. (1994), Embryology of mammalian gonads

and ducts: in: The physiology of reproduction. E Knobil and JD Neil, Raven press Ltd., New York, 2nd edition, pp. 487-540.

35. Callesen H., Greve T., Christensen F. (1987), Ultrasounically guided

aspiration of bovine follicular oocytes, Theriogenology, pp. 27- 217.

36. Camargo L. S. A., viana J. H. M., Sá W. F., Ferreira A. M., Ramos A. A.,

Freitas C., Vale Fijho V.R. (2006), Development competence of oocytes

obtained from Bos Taurus and Bos indicus dairy cows raised in tropical

climate, Reproductive Fertilization and Develpoment, 18, pp. 243-244.

37. Campbell B. K., Scaramuzzi R. J., Webb R. (1995), Control of antral

follicle development and selection in sheep and cattle, Journal of

Reproduction and fertility, 49, pp. 335-350.

38. Chang M. C. (1951), Fertilising capacity of spermatozoa deposited into

the fallopian tube, Nature, 168, pp. 697-698.

39. Chaubal S. A., Ferre L. B., Molina J. A., Faber D. C., Bols P. E. J.,

Rezamand P., Tian X., Yang X. (2007), Hormonal treatments for

increasing the oocyte and embryo production in an OPU-IVP system,

Theriogenology, 67, pp. 719-728.

40. Chaubal S. A., Molina J. A., Ohlrichs C. L., Ferre L. B., Faber D. C., Bols

P.E., Riesen J.W., Tian X., Yang X. (2006), Comparison of different

transvaginal ovum pick-up protocols to optimize oocyte retrieval and

embryo production over a 10 - week period in cows, Theriogenology, 65,

pp. 1631-1648.

41. Danila H. (2000), Technical aspect of in vitro embryo production, Duran

embryo biotechnology laboratory carabao center. Nueva Ecij 3120

Philipines, pp. 1 -13.

42. De Felici M., Pesce M. (1994), Growth factors in mouse primordial germ

cells migration and proliferation, Progress in Growth Factor Research, 5,

pp. 135-143.

43. De Loos F., Kastrop P., Vanmaurik P., Vanbeneden T. H., Kruip T. A. M.

(1991), Heterologous cell contacts and metabolic coupling in bovine

cumulus oocyte complexes, Molecular Reproduction and Development,

28, pp. 255-259.

44. De Loos F., Van Vliet C., van Maurik P., Kuip T. A. M. (1989),

Morphology of immature bovine oocytes, Gamete Research, 24, pp. 197-

204.

45. De Roover R., Feuguang J. M., Bols P.E., Genicot G., Hanzen C. (2008),

Effects of ovum pick-up frequency and FSH stimulation: a retrospective

study on seven years of beef cattle in vitro embryo production, Reprod

Domest Anim, 43, pp. 239-245.

46. De Roover R., Genicot G., Leonard S., Bols P., Dessy F. (2005), Ovum

pick up and in vitro embryo production in cows superstimulated with an

individually adapted superstimulation protocol, Animal Reproduction

Science, 86, pp. 13-25.

47. Downs M. P. D., Bavister B. D. (1989), Direct contact is required between

serum albumin hamster spermatozoa for capacitation in vitro, Gamete

Research, 23, pp. 171-180.

48. Dyce K. M., Sack W. O., Wensing C. J. G. (1966), The Urogenital Apparatus. In: Veterinary Anatomy, W.B. Saunders company, 2nd edition,

pp. 169-208.

49. Dyce K. M., Sack W. O., Wensing C. J. G. (1987), The pelvic and

reproductive organs of the female ruminants, Philadelphia: W.B. Saunder

Company.

50. Edward, R. G. (1965), Maturation in vitro of mouse, sheep, cow, pig,

rhesus monkey and human ovarian oocytes, Nature, 196, pp. 349-351.

51. Edward, L. A., Batt, P. A., Gandolfi, F. and Gardner, D. K. (1997),

Modifications made to culture medium by bovine oviduct epithelian cells:

changes to carbohydrates stimulate bovine embryo development,

Molecular Reproduction and Development, 46, pp. 146-154.

52. Eppig J. J., Downs S. M. (1984), Chemical signals that regulate

mammalian oocyte maturation, Biol Reprod, 30, pp. 1-11.

53. Erickson B. H. (1965), Symposium on atomic energy in animal science:

Radiation effects on gonadal development in farm animals, Journal of

Animal Science, 24, pp. 568-583.

54. Erickson B. H. (1966a), Development and radio-response of the prenatal

bovine ovary, Journal of Reproduction and Fertiliry, 10, pp. 97-105.

55. Erickson B. H. (1966b), Development and senescence of the postnatal

bovine ovary, Journal of Animal Science, 25, pp. 800-805.

56. Espey L. L. (1994), Current status of the hypothesis that mammalian

ovulation is comparable to an inflammatory reaction, Biol Reprod, 50, pp.

233-238.

57. Fair, T., Hytell, P. and Greve, T. (1995), Bonvine oocyte diameter in

relation to maturational competence and transcriptional activity.

Molecular Reproduction and Development, 42, pp. 437-442.

58. Fischer A. E., Bernal D. P., Gutierrez-Robayo C., Rutledge J. J. (2000),

Estimates of heterosis for using reciprocal crosses in cattle,

Theriogenology, 54, pp. 1433-1442.

59. French-Constant C., Hollingsworth A., Heasman J., Wylie C. C. (1991),

Response to fibronectin of mouse primordial germ cells before, during

and after migration, Development, 113, pp. 1365-1373.

60. Fuhrer, F., Mayr, B., Schellander, K., Kalat, M. and Schleger, W. (1989),

Maturation competence and chromatin behaviour in growing and fully

grown cattle oocytes. Journal of Veterinary Medicine, 36, pp. 285-291.

61. Fukui Y., Ono H. (1989), Effects of sers, hormones and granulose cells

added to culture medium for in vitro maturation, fertilization, cleavage

and development of bovine oocytes, Journal of Reproduction and

Fertilization, 86, pp. 501-506.

62. Fukui Y., Sakama Y. (1980), Maturation of bovine oocytes cultured in

vitro. Relation to ovaries activity, follicular size and the presence or

absence of cumulus cells, Biology of Reproduction, 22, pp. 669-673.

63. Fukui Y., Sonoyama T., Mochizuki H., Ono H. (1990), Effects of heparin

dosage and sperm capacitation time on in vitro fertilization and cleavage

of bovine oocytes matured in vitro, Theriogenology, 34, pp. 579-591.

64. Furuya, Endo, Oba, Suzuki (1992), Protein phosphorilation regulates the

mouse sperm acrosome reaction induced by the zona pellucida, Journal of

Assisted Reproduction and Genetics, 9, pp. 384-390.

65. Galli C. (2003), Bovine embryo technologies, Theriogenology, 59, pp.

599-616.

66. Garcia A., Salahaddine M. (1998), Effects of repeated ultrasound-guided

transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery and

subsequent follicular development, Theriogenology, 50, pp. 575-585.

67. Garello C., Baker H., Rai J., Montgomery S., Wilson P., Kennedy C. R.

(1999), Pronuclear orientation, polar body placement, and embryo quality

after intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization: further

evidence for polarity in human oocytes, Human Reproduction, 14, pp.

2588-2595.

68. Gibbons J. R., Beal W. E., Krisher R. L., Faber E. G., Pearson R. E.,

Gwazdauskas F. C. (1994), Effects of one versus twice weekly

transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery and embryo

development, Theriogenology, 41, p. 206.

69. Ginther O. J., Knopf L., Kastelic J. P. (1989), Temposal associations

among ovarian events in cattle during estrus cycles with two or three

follicular waves, Journal of Reproduction and Fertility, 108, pp. 271-279.

70. Goddard M. J., Pratt H. P. (1993), Control of events during early cleavage

of the mouse embryo: an analysis of the ‘2 - cell block’, Embryo Exp

Morphol, 73, pp. 111-133.

71. Godin I., Wylie C. C. (1991), TGFβ1 inhibits proliferation and a

chemotropic effect on mouse primordial germ cells in culture,

Development, 113, pp. 1451-1457.

72. Goodhand K. L,. Staines M. E,. Hutchinson J. S. M., Broadbent P. J.

(1999), In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from

doner aspirated at different frequencies or following FSH treatment,

Theriogenology,51, pp. 951-961.

73. Goodhand K. L., Staines M. E., Hutchinson J. S. M., Broadbent P. J.

(2000), In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from

bovine oocyte doner treated with progestagen, oestradiol, Animal

reproduction, 63, pp. 145-185.

74. Goovaerts I. G. F., Leroy J. L. M. R., Jorssen E. P. A., Bols P. E. J.

(2010), Noninvasive bovine oocyte quality assessment: Possibilities of a

single oocyte culture, Theriogenology, 74, pp. 1509-1520.

75. Gordon I. (1994), Laboratory production of cattle embryos, Wallingford,

UK: CAB international.

76. Gordon I., Lu K. H. (1990), Production of embryos in vitro and its impact

on livestock production, Theriogenology, 33, pp. 77-87.

77. Govan A. D. T., Black W. P. (1975), Ovarian morphology in

oligomennorrhea, European Journal of Obstrics, Gynecology and

Reproductive Biology, 5, pp. 317-326.

78. Hagemann L. J., Beauont S. E., Berg M., Donnison M. J., Ledgard A.,

Peterson A.J., Schurmann A., Tervit H.R. (1999), Development during

single IVP of bovine oocytes from dissected follicles: interactive effects

of estrous cycle stage, follicle size and atresia, Molecular Reproduction of

Development, 53, pp. 451-458.

79. Hamano S., Kawayama M. (1993), In vitro fertilization and development

of bovine oocytes recovered from the ovaries of individual doners: A

comparison between cutting and aspiration methods, Theriogenology, 39,

pp. 703-712.

80. Hanada A. (1985), In vitro fertilisation in goats, Japanese Journal of

Animal Reproduction, 31, pp. 21-26.

81. Handrow R.R., Lenz R. W., Ax R. L. (1982). Structural comparisons

among glycosaminoglycans to promote and accrosome reaction in bovine

spermatozoa, Biochemical Biophysiology, 107, pp. 1326-1332.

82. Hashimoto S., Takakura R., Minami N., Yamada M. (1998), Ultrasound-

guided follicle aspiration: Effect of the frequency of a linear transvaginal

probe on the collection of bovine oocytes, Embryo transplantation

laboratory of Snow brand milk products Co., Ltd., Tomakomai, Hokkaido

059-1365, Japan.

83. Hasler F. J. (2003), Current status and future of commercial embryo

transfer in cattle, Animal Reproduction Science, 79, pp. 245-264.

84. Hendriksen P. J. M., Steenweg W. N. M., Harkema J. C., Merton J. S.,

Bevers M. M., Vos L. A. M., Dieleman S. J. (2004), Effect of different

stages of the follicular wave on in vitro developmental competence of

bovine oocytes, Theriogenology, 61, pp. 909-920.

85. Hensleigh H. C., Hunter A. G. (1983), In vitro maturation of bovine

cumulus enclosed primary oocytes and their subsequent in vitro

fertilization and cleavage, Journal of dairy science, 68, pp. 1456-1462.

86. Hernandez-Ochoa I., Karman B. N., Flaws J. A. (2009), The role of the

aryl hydrocarbon receptor in the female reproduction system, Biochem

Phamacol, 77, pp. 547-559.

87. Heres A. A., Merton J. S., Haseleger W., Van A. M., Wagertendenke-

delecuw and Kemp B. (1996), Optimization of sperm oocyte ration during

IVF of bovine cumulus oocyte complexes, Theriogenology, 45, pp. 226.

88. Hirshfield A. N. (1991), The theca cells may be present at outset of

follicular grown, Biol Reprod, 44, pp. 1157-1162.

89. Hirshfield A. N., Desanti A. M. (1995), Patterns of ovarian cell

proliferation in rats during the embryonic period and the first three weeks

postpartum, Biology of Reproduction, 53, pp. 1208-1221.

90. Holland E. J., Bindon B. M., Piper L. R., Thimonier J., Cornish K. A.,

Radford H. M. (1981), Endoscopy in cattle: techniques for ovarian

examination by the paralumbar and midventral routes, Animal

Reproduction Science, 4, pp. 127-135.

91. Hoshi H. (2003), In vitro production of bovine embryos and their

application for embryo transfer, Theriogenology, 59, pp. 675-685.

92. Hunter R. H. F. (1985), Fertility in cattle: basis reasons why late

insemination should be avoided, Anamal Breeding, 53, pp. 83-87.

93. Ijaz A., Lambert R. D., Sirard M. A. (1994), in vitro cultured bovine

granulose and oviductal cells secrete sperm motility-maintaining factor(s),

Molecular Reproduction and Development, 37, pp. 54-60.

94. Imai K., Tagawa M., Yoshioka H., Matoba S., Narita M., Inaba Y.,

Aikawa Y., Ohtake M., Kobayashi S. (2006), The effiency of embryo

production by ovum pick-up and in vitro fertilization in cattle, Journal of

Reproduction and Development, 52, pp. 19-29.

95. Ireland J. J., Roche J. F. (1983), Development of non ovulation antral in

heifers: changes in steroid in follicular fluid and receptors for

gonadotropins, Endocrinology, 112, pp. 150-156.

96. Jaskowski J. M. (2001), Ovum pick up in cows, Medycyna Wet, 57, pp.

792-795.

97. Kajihara Y., Kometani N., Kobayashi S.. Shitanaka Y., Koshiba Y.,

Hishijama K., Shiraiwa K., Goto K. (1999), pragnancy rates and births

after co-culture of cumulus cells with bovine embryos derived from in

vitro fertilization of in vitro matured follicular oocytes, Theriogenology,

33, p. 264.

98. Kane M. T. (2003), A review of in vitro gamete maturation and embryo

culture and potential impact on future animal biotechnology, Animal

Reproduction Science, 79, pp. 171-190.

99. Khurana N. K., Niemann H. (2000), Effects of oocyte quality, oxygen

tension, embryo density, cumulus cells and energy substrates on cleavage

and morula/blastocyst formation of bovine embryos, Theriogenology, 54,

pp. 741-756.

100. Kochhar S. H., Kanwal P., Kochhar P., Parvathi K., Basrur, King W. A.

(2003), Influence of the duration of gamete interaction on cleavage,

growth rate and sex distribution of in vitro produced bovine embryos,

Animal Reproduction Science, 77, pp. 33-49.

101. Kruip Th. A. M., Boni R., Wurth Y. A., Roelofsen M. W. M., Pieterse

M.C. (1994), Potetial use ovum pick up for embryo production and

breeding in cattle, Theriogenology, 42, pp. 675-684.

102. Lambert R. D., Bernard C., Rioux J. E., Beland R., D’Amours D.,

Montreuil A. (1983), Endoscopy in cattle by the paralumbar rout:

technique for ovarian examination and follicular aspiration,

Theriogenology, 20, pp. 149-161.

103. Leibfried M. L., First (1979), Characterization of bovine follicular

oocytes and their ability to mature in vitro, Journal of Animal Science, 48,

pp. 76-86.

104. Leibfried- Rutledge M., Crister E. S., Parrish J. J., First N. L. (1989), in

vitro maturation and fertilization of bovine oocytes, Theriogenology, 31,

pp. 61-74.

105. Li F., Chen X., Pi Ư., Liu C., Shi Z. (2007), Collection of oocyte

through transvagianal ovum pick-up for in vitro embryo production in

Nayang Yellow cattle, Reprod Dom Anim, 42, pp. 666-670.

106. Ling Z. J., Lu K. H. (1990), Frequency of cleavage and development of

in vitro bovine oocytes fertilized in different numbers in drops with

different sperm concentrations, Theriogenology, 33, p. 275.

107. Lintern M. S. (1977), Initiation of follicular growth in the infant mouse

ovary by exogenous gonadotropin, Biology of Reproduction, 17, pp. 635-

639.

108. Lonergan P. (1992), Studies on the in vitro maturation, fertilization and

culture of bovine fillicular oocyte, PhD Thesis, National University of

Ireland, Dublin.

109. Lonergan P., Monaghan P., Rizos D., Boland M. P., Gordon I. (1994),

Efect of follicle size on bovine oocyte quality and development

competence following maturation, fertilization and culture in vitro,

Molecular Reproduction and Development, 37, pp. 48-53.

110. Lonergan P., Rizos D., Gutierrez A-Adan, Fair T., Boland M. P.

(2003), Oocyte and embryo quality: Effect of origin, culture conditions

and gene expression patterns, Reproduction of Domestic Animal, 38, pp.

259-267.

111. Lopez A. S., Martinussen T., Greve T., Callesen H. (2006), Effect of

days post-partum, breed and ovum pick-up scheme on bovine oocyte

recovery and embryo development, Reprod Domest Anim, 41, pp. 196-

203.

112. Lundy T., Smith P., O’ Connell A., Hudson N. L., McNatty K. P.

(1999), Populations of granulose cells in small follicles of the sheep

ovary, Journal of Reproduction and Fertility, 115, pp. 251-262.

113. Lussier J. G., Matton P., Dufour J. J. (1987), Growth rates of follicles

in the ovary of cow, Journal of Reproduction and Fertility, 81, pp. 301-

307.

114. Lu H. H., Seidel G. E., Chen M. (2004), Effects of heparin and sperm

concentration on cleavage and blastocyst development rates of bovine

oocytes inseminated with flow cytometrically-sortedsperm,

Theriogenology, 5, pp. 819-830.

115. Machado S. A., Reichenbach H. D., Weppert M., Wolf E., Goncalve P.

B. (2006), The variability of ovum pick-up response and in vitro embryo

production from monozygotic twin cows, Theriogenology, 65, pp. 573-

583.

116. Machatkova M., Jokesova E., Horky F., Krepelova A. (2000),

Utilization of the growth phase of the first follicular wave for bovine

oocyte collection improves blastocyst production, Theriogenology, 54, pp.

543-550.

117. Machatkova M., Krausova K., Jokesova E., Tomanek. (2004),

development competence of bovine oocytes: effects of follicle size and

the phase of follicular wave on in vitro embryo production,

Theriogenology, 61, pp. 329-335.

118. Mahl P. S., Adam G. P., Mapletoft R. J., Singh J. (2008),

Superovulatory response in a bovine model of reproductive aging, Anim

Reprod Sci, 109, pp. 1-4.

119. Manjunatha B. M., Gupta P. S. P., Ravindra J. P., Devaraj M., Nandi.

S. (2008), In vitro embryo development and blastocyst hatching rates

following vitrification of river buffalo embryos produced from oocytes

recovered from slaughterhouse ovaries or live animals by ovum pick-up,

Animal Reproduction Science, 104, PP. 419-426.

120. Manor D., Drugan A., Stein D., Pillar M., Itskovitz-Eldor (1999),

Unequal pronuclear size a powerful predictor of embryonic chromosome

anomalies, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 16, pp. 385-

389.

121. Mao J. W., Guangming M. F., Smith C., Cauely M. C., Cantely T. C.,

Prather B. A., Didion, Day B. N. (2002), Effects of culture medium,

serum type and various concentrations of FSH on Porcine prenatal

follicular development and antrum formation in vitro, Biological

Reproduction, 67, pp. 1197-1203.

122. Matthiesen M. (2011), Effect of donor age on the developmental

capacity of bovine cumulus oocyte complexes obtained by repeated OPU

from nonstimulated and FSH-superstimulated German Simmental heifers

and cows at different life cycle stages, phD, pp. 64-65.

123. Mendes J. O. B., Burns P. D., De La Tore-Sanchez J. F., Seidel G. E.

(2003), Effect of heparin on cleavage rates and embryo production with

four bovine sperm preparation protocols, Theriogenology, 60, pp. 331-

340.

124. Mermillod P., Wils C., Masip A., Dessy F. (1992), Collection of

oocytes and production of blastocysts in vitro from individual, slaughtered

cows, Journal of Reproduction and Fertilization, 96, pp. 717-723.

125. Merton J. S., Roos A. P. W., Mullaart E., Ruigh L., Kaal L., Vos P. L.

M., Dieleman S. J. (2003), Factors affecting oocyte quality and quantity in

commercial application of embryo technologies in cattle breeding

industry, Theriogenology, 59, pp. 651-674.

126. Miller D. J., Ax R. L. (1990), Carbohydrates and Fertilization in

animals, Molecular Reproduction and Development, 26, pp. 184-198.

127. Monniaux D., Monget P., Besnard N., Huet C., Pisselet C. (1997),

Growth factor and antral follicular development in domestic ruminants,

Theriogenology, 47, pp. 3-12.

128. Moreno J. F., Flores-Foxworth G., Westhusin M., Kraemer D. C.

(1993), Influence of pregnancy and presence of a CL on quantity and

quality of bovine oocytes obtained from ovarian follicles aspirated post-

mortem, Theriogenology, 39, p. 27.

129. Munne S., Cohen J. (1998), Chromosome abnormalties in human

embryos, Human Reproduction, 4, pp. 842-855.

130. Nagano M., Hishinuma M., Takagiri S., Takahashi Y. (2007), The

relationship between oocyte morphology and ovarian status in cattle,

Journal of Reproduction and Development, 53, pp. 953-958.

131. Bui Xuan Nguyen. (2006), Current status and trends of animal

reproductive biotechnology in Vietnam. Embryo transfer Newsletter,

Reprod. Fert.& Development, V4, No 2, pp. 5-10.

132. Numabe T., Oikawa T., Kikuchi T., Horiuchi T. (2000), Birth weight

and birth rate of heavy calves conceived by transfer of in vitro or in vivo

produced bovine embryos, Animal Reproduction Science, 64, pp. 13-20.

133. Otoi, T., Yamamoto, K., N., Tachikawa, S., and Suzuki, T. (1997),

Bonvine oocyte diameter in relation to developmental competence.

Theriogenology, 48, pp. 769-774.

134. Parrish J. J., First N. L. (1984), Effect of swim-up separation and

heparin pretreatment of frozen-thawed spermatozoa on in vitro

fertilization of bovine oocytes, Biology of Reproduction, 30, p. 112.

135. Paula-Lopes F. F., Chase Jr C. C., AI-Katanani Y. M., Krininger 3rd C.

E., Rivera R. M., Tekin S., Majewski A. C., Ocon O. M., Olson T. A.,

Hansen P. J. (2003), Genetic divergence in cellular resistance to heat

shock in cattle: differences between breeds developed in temperate verus

hot climates in responses of preimplantation embryos, reproductive tract

tissuses of lymphocytes to increased culture temperatures, Reproduction,

125, pp. 285-294.

136. Pavlok, A., Lucas-Hann, A. and Niemann, H. (1992), Fertilisation and

developmental competence of bonvine oocytes derives from defferences

categories of antral follicle. Molecular Reproduction and Development,

31, pp. 63-67.

137. Pawel A., Jaskowski J. M., Marcin J., Jan o. (2007), The influence of

vacuum pressure on quality and number of recovered oocytes aspirated

from ovarian follicles of swine and cows, Arch. Tierz., Dummerstorf, 50,

pp. 260-266.

138. Pawshe C. H., Palanisami A., Taneja M., Jain S. K. (1996),

Comparision of various maturation treatments on IVM of goat oocytes

and their early embryonic development and cell numbers,

Theriogenology, 46, pp. 971-982.

139. Picton H. M. (2001), Activation of follicle developmemt: the

primordial follicle, Theriogenology, 55, pp. 1193-1210.

140. Pieterse M. C., Kapen K. A., Kruip Th. A. M., Taverne M. A. M.

(1988), Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound

scanning of the ovaries, Theriogenology, 30, pp. 751-762.

141. Rajakoski E. (1960), The ovarian follicular system in sexually mature

heifers with special reference to seasonal, cyclical, and left variations,

Acta Endocrinogica, 52, pp. 6-68.

142. Rehman N., Collins A. R., Suh T. K., Wright R. W. (1994), Effect of

sperm exposure time on IVF and embryo development of bovine oocytes

matured in vitro, Theriogenology, 41, pp. 1447-1452.

143. Reis A., Staines M. E., Watt R. G., Dolman D. F., McEvoy T. G.

(2002), Embryo production using defined oocyte maturation and zygote

culture media following repeated ovum pick-up (OPU) from FSH-

stimulated Simental heifers, Theriogenology, 72, pp. 137-151.

144. Rensis F. D., Scaramuzzi R. J. (2003), Heat stress and seasonal effects

on reproduction in the dairy cow-review, Theriogenology, 60, pp. 1139-

1151.

145. Rizos D., Burke L., Duffy P., Wade M, John F., Mee., Kevin

J.,O’Farrell., MacSiurtain M., Maurice P., Boland., Lonergan P. (2005),

Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte doners for

embryo production in vitro, Theriogenology, 63, pp. 939-949.

146. Rita V., Reuben J., Mapletoft., Stefano A., Jaswant S., Gregg P.,

Adams. (2003), Morphology and developmental competence of bovine

oocytes relative to follicular status, Theriogenology, 60, pp. 923 – 932.

147. Rocha A., Randel R. D., Broussard J. R., Lim J. M., Blair R. M.,

Roussuel J. D., Godke R. A., Hansel W. (1998), High environmental

temperature and humidity decrease oocyte quality in Bos Taurus but not

in Bos indicus cows, Theriogenology, 49, pp. 657-665.

148. Rodriguez-Gonzalez E., Lopez-Bejar M., Velilla E., Paramino M. T.

(2002), Selection of prepubertal goat oocyte using the brilliant cresyl blue

test, Theriogenology, 57, pp. 1397-1409.

149. Rose T. A., Bavister B. D. (1992), Effect of oocyte maturation medium

on in vitro development of in vitro fertilized bovine oocyte maturation and

embryo development in vitro, Mollecular Reproduction and Development,

33, pp. 72-77.

150. Roth Z., Arav A., Bor A., Zeron Y., Brw-Tal R., Wolfenson D. (2001),

Improvement of quality of oocytes collected in the autumn by enchanced

removal of impaired follicles from previously heat-stressed cows,

Reproduction, 122, pp. 737-744.

151. Roth Z., Inbar G., Arav (2008), Comparison of oocyte

developmental competence and follicular steroid content of

nulliparous heifers and cows at diffent stages of lactation,

Theriogenology, 69, pp. 932-939.

152. Russe I. (1983), Oogenesis in cattle and sheep, Bibliotheca Anatomica,

24, pp. 77-92.

153. Saeki K., Nagao Y., Hoshil M., Nagai M. (1995), Effects of heparin,

sperm concentration and bull variation on in vitro fertilization of bovine

oocytes in a protein-free media, Theriogenology, 43, pp. 751-759.

154. Sagirkaya H. (2006), Developmental and molecular correlates of

bovine preimplantation embryos, Reproduction, 131, pp. 895-904.

155. Saitoh N., Kanagawa H., Shimihira I. (1995), Manual of bovine

embryo transfer, Japan Livestock Technology Association.

156. Sanbuissho A., Threfall W. R. (1985), The effect of estrous cow serum

on the maturation and fertilization of bovine follicular oocyte in vitro,

Theriogenology, 23, pp. 226.

157. Santos J. E., Cerri R. L., Sartori R. (2008), Nutritional management of

the donor cow, Theriogenology, 69, pp. 88-97.

158. Schellander K., Fayrer-Hosken R., Keefer C., Brown L., Malter H.,

Mcbride C., Brackett B. (1989), In vitro fertilization of bovine follicular

oocytes recovered by laparoscopy, Theriogenology, 31, pp. 927-933.

159. Schellander K., Fuhrer F., Brackett B. G., Korb B., Schleger W. (1990),

In vitro fertilization and cleavage of bovine oocytes matured in medium

supplemented with estrous cow serum, Theriogenology, 33, pp. 477-485.

160. Scott L., Alvero R., Leondires M., Miller B. (2000), The morphology

of human pronuclear embryo is positively related to blastocyst

development and implantion, Human Reproduction, 15, pp. 2394-2403.

161. Senger P. L. (1997), Embryogenesis of the pituitary gland and the male

and female reproductive system, Pathways to Pregnancy and Parturition,

pp. 58-76.

162. Shiora Y., Kywayama M., Fukushima M., Iwasaki S., Hanada A.

(1988), In vitro fertilization and cleavage capability of bovine follicular

oocytes classified by cumulus and matured in vivo, Theriogenology, 39, p.

312.

163. Sirard M. A., Coenon K. (1993), The use of a defined medium to

evaluate meiotic resumption of immature bovine oocytes, Theriogenology,

39, p. 314.

164. Sirard M. A., Leibfried-Rutledge M. L., Parrish J. J., Ware C., First N.

L. (1988), The culture of bovine oocytes to obtain developmentally

competent embryos, Biological Reproduction, 39, pp. 546-552.

165. Sirard M. A., Picard L., Dery M., Coenen K., Blondin P. (1999), The

time interval between FSH administration and ovarian aspiration

influences the development of cattle oocytes, Therigenology, 51, pp. 699-

708.

166. Sirois J., Fortune J. E. (1990), Lengthening the bovine estrus cycle with

low levels of exogenous progesterone: A model for studying ovarian

follicular dominance, Endocrinology, 127, pp. 916-925.

167. Smetanina I. G., Tatarinova L. V., Krivokharchenoko A. S. (2000), The

effect of composition of culture media on bovine oocyte maturation and

embryo development in vitro, Ontogenez, 31, pp. 139-143.

168. Smitz J. E. J., Cortvrindt R. G. (2002), The earliest stages of

Folliculogenesis in vitro, Reproduction, 123, pp. 185-202.

169. Stubbings, R. B., Walton, J. S. (1995), Effect of ultrasonically-guided

follicle aspiration on estrous cycle and follicular dynamics in Holstein

cows, Theriogenology, 43, pp. 705-712.

170. Su L., Yang S., He X., Li X., Ma J., Wang Y., Presicce G., Ji W.

(2009), Effect of donor age on the development competence of bovine

oocytes retrieved by ovum pick up, Reproduction in Domestic Animals,

25.

171. Sylvie Bilodeau-Goeseels and Paul Panich (2002), Effects of oocyte

quality on development and transcriptional activity in early bovine

embryos, Animal Reproduction Science, 71, pp. 143-155.

172. Takuma T., Sakai s., Ezoe D., Ichimaru H., Jinnouchi T., Kaeday Y.,

Nagai T., Otoi T. (2010), Efect of season and reproductive phase on

quality, quantity and developmental comprtence of oocytes aspirated from

Japanese black cows, Journal of reproduction and development, 56, pp.

55 – 59.

173. Tanaka Y., Nakada K., Moriyoshi M., Sawamukai Y. (2001),

Appearance and number of follicles and change in the concentration of

serum FSH in female bovine fetuses. Animal Reproduction, 121, pp. 777-

782.

174. Tanghe S., Vansoom A., Duchateau L., Nauwynck H., De Kruip A.

(2004), Carbonhydrates and glycoprotein involved in bovine fertilization

in vitro, Molecular Reproduction and Development, 68, pp. 492-499.

175. Techakumphu M., Lohachit C., Tantasuparak W., Intaramongkol C.,

Intaramongkol S. (2000), Ovarian response and oocyte recovery in

prepubertal swamp buffalo (Bubalus bubalis) calves after FSH or PMSG

treatment, Theriogenology, 54, pp. 305-312.

176. Tesarik J., Greco E. (1999), The probability of abnormal

preimplantation development can be predicted by a single static

observation on pronuclear stage morphology, Human Reproduction, 14,

pp. 318 - 323.

177. Townson D. H., Tsang P. C. W., Butler W. R., Frajblat M., Griel Jr. L.

C., Johnson C. J., Milvae R. A., Niksis G. M., Pate J. L. (2002),

Relationship of fertility to ovarian follicular waves before breeding in

dairy cows, Journal of Animal Science, 80, pp. 1053-1058.

178. Van Blerkom J. (1990), Occurrence and development consequences of

abberant cellular organization in meiotically mature oocytes after

exogeneous ovarian hyperstimulation, J. Electron Microsc, Technique, 16,

pp. 324-346.

179. Van Soom A. S., Tanghe I., de Pauw D., Maes, de Kruif (2002),

Function of the cumulus oophorus before and during mammalian

fertilization, Reprod. Dom. Anim, 37, pp. 144-151.

180. Viana J. H. M., Camargo L. S. A., Ferreina A. M., De Sa., Fernades C.

A. C., Junior A. P. M. (2004), Short intervals between

ultrasonographically guided follicle aspiration improve oocyte quality but

do not prevent establishment of dominant follicles in Gir breed (Bos

indicus) of cattle, Animal Reproduction Science, 84, pp. 1-12.

181. Viana J. H. M., Ferreira A. M., So W. F., Camagor L. S. A (2000),

Factors effecting recovery and quality of oocyte for bovine embryo

production in vitro using ovum pick-up technology, Theriogenology, 54,

pp. 433-446.

182. Viana J. H. M., Palhao M. P., Siqueira L. G. B Fonseca J. F., Camargo

J.S.A. (2010), Ovarian follicular dynamics, Follicle deviation, and oocyte

yield in Gyr breed (Bos indicus) cows undergoing repeated ovum pick-up,

Theriogenology, 73, pp. 966-972.

183. Wahid H., Gordon I., Sharif H., Lonergan P., Mongha P., Gallagher M.

(1992), Effect and efficiency of recovery methods for obtaining ovine

follicular oocytes for in vitro procedures, Theriogenology, 37, pp. 318.

184. Walsh, J. H., Montovani, R., Duby, R. T., Overstrom, E. W.,

Dobrinsky, J. R., Enright, W. J., Roche, J. F., Boland, M. P. (1993), The

effects of once or twice daily injections of pFSH on the superovulatory

response in heifers, Theriogenology, 40, pp. 313-322.

185. Ward F. A. P., Lonergan B. P., Enright M. P. (2000), Boland. Factors

affacting recovery and quality of oocytes for bovine embryo production in

vitro using ovum pick up technology, Theriogenology, 54, pp. 433-446.

186. Wandij S. A., Fortier M. E., Sirard M. A. (1992), Differential response to

gonadotropins and prostaglandin E2 in ovarian tissue during prenatal and

postnatal development in cattle, Biology of Reproduction, 46, pp. 1034-

1041.

187. Wolfenson D., Roth Z., Meidan R. (2000), Impaired reproduction in

heat-stressed cattle: basis and applied aspects, Animal Reproduction

Science, 60/61, pp. 535-547.

188. Yamada O., Abe M., Takehana K., Hiraga T., Iwasa K., Hiratsuka T.

(1995), Microvascular changes during the development of follicles in

bovine ovaries: a study of corrosion casts by scanning electron

microscopy, Arch Histol Cytol, 58, pp. 567-574.

189. Yang X., Kubota C., Suzuki H., Taneja M., Bols P. E., Presicce G. A.

(1998), Control of oocyte maturation in cows-biological factors,

Theriogenology, 49, pp. 471-482.

190. Yang Y. B., Lu K. H. (1990), The influence of bovine oocyte type on in

vitro fertilization and subsequent in vitro development, Theriogenology,

33, p. 355.

191. Younis A. I., Brckett B. G., Fayrer-Hosken R. A. (1989), Influence of

serum and hormones on bovine oocyte maturation and fertilization in

vitro, Gamete Research, 23, pp. 189-201.

192. Zeron Y. A., Ocheretny O., Keda A., Borochov D., Skla., Arav A.

(2001), Seasonal changes in bovine fertility: Relation to developmental

competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition

of follicles, Reproduction, 121, pp. 447-454.

193. Ziebe S., Petersen K., Lindenberg S., Anderson A. G., Gabrielsen A.,

Andersen A. N. (1997), Embryo morphology or cleavage stage: How to

select the best embryo for transfer after in vitro fertilization, Human

Reproduction, 12, pp. 1545-1549.

PHỤ LỤC

1. Dụng cụ và hóa chất

- Hệ thống siêu âm hút tế bào trứng gồm: màn hình siêu âm HS-2000,

HONDA, đầu dò siêu âm có đường dẫn kim hút tế bào trứng 7,5 MHz của

HBV-4710 MV, máy tạo áp suất FHK, Model 4, kim hút tế bào trứng 18 G,

COVA, và bình ổn nhiệt Fujihira của Nhật Bản.

- Các loại kính hiển vi soi nổi: Kính hiển vi vi thao tác Nikon TE 300; Kính

hiển vi soi nổi Wild M3B; Kính hiển vi soi nổi Leica MZ6; Kính hiển vi soi

nổi Olympus SD 30; Kính hiển vi Olympus CH30.

- Tủ nuôi cấy CO2 – Sanyo CO2 Incubator.

- Buồng vô trùng Labcaire.

- Cân phân tích Precisa.

- Máy li tâm Universal 32R.

- Bồn nước ổn nhiệt Memer Waterbath.

- Máy ổn nhiệt HT 50.

- Máy rửa dụng cụ bằng siêu âm.

- Tủ sấy khô SL Shel lab.

- Tủ sấy ẩm Sanyo Incubator.

- Tủ sấy áp suất Tomy autoclave SS-325.

- Máy đông lạnh CL – 2000.

- Buồng đếm Thoma.

- Pippetteman các cỡ: 100µl, 200 µl, 1000 µl.

- Các loại đĩa petri: Falcon disk, Grainer disk, Nunc disk.

- Pippete pasteur.

- Găng tay vô trùng, bơm tiêm 5 ml, kim tiêm 18G, microfilter 0,22 µm.

- Các loại hóa chất chuyên dụng:

Sucrose C12H22O11 196-00015 Wako Japan.

Disodium Hydrogenphosphate Na2HPO4 197-02865 Wako Japan.

D(+) – Glucose C6H12O6 041-00595 Wako Japan.

Potassium Dihydrogenphosphate KH2PO4 165-04242 Wako Japan.

Potassium Chloride KCl 163-03545 Wako Japan.

Sodium Hydrogen Carbonate NaHCO3 191-01305 Wako Japan.

Sodium Chloride NaCl 191-01665 Wako Japan.

Sodium Dihydrogen Phosphate Dihydrate NaH2CO3.2H2O 192-02815

Wako Japan.

Calcium Chloride Dihydrate CaCl2.2H2O 031-00435 Wako Japan.

Phenol Red Solution 0,5% P0290 Sigma.

Magnesium Chloride Hexahydrate MgCl2.6H2O 131-00162 Wako

Japan.

Ethylene Glycol C2H6O2 Prolabo Germany.

Glycerol Prolabo Germany.

Medium 199 3769 GIBCO.

BME Amino Acide Solution 50x B-6766 Sigma.

MEM Non-Essential Amino Acide Solution 100x 02380 GIBCO.

Penicilin G Potassium 200.000 Meiji Seika Kaisha LTD Tokyo Japan.

Novo-Heparin Pharmaceutical Products LTD V ventis Japan.

Streptomycin Sulphate 1g Meiji Kaisna LTD Tokyo Japan.

L-Glutamic Acid G-4815 Sigma.

Albumin, Bovine A-4378 Sigma.

Caffein Sodium Benzoate C-4144 Sigma.

L(+)-Lactic Acid L-4388 Sigma.

Albumin, Bovine A-7030 Sigma.

Sodium Pyruvate 199-03062 Wako Japan.

2. Chuẩn bị môi trường

2.1. Môi trường siêu âm hút tế bào trứng (mDPBS)

Pha môi trường PBS (-)

NaCl 8,0g

KCl 0,2g

1,15g Na2HPO4

0,2g KH2PO4

Nước cất khử ion 700ml

Pha môi trường PBS (+)

0,1g CaCl2

0,1g MgCl2.6H2O

Nước cất khử ion 200ml

Sau khi đã chuẩn bị xong, rót từ từ môi trường PBS (+) vào môi

trường PBS (-) để tránh kết tủa. Sau đó bổ sung thêm 100ml nước cất khử ion

để đủ 1000ml. Sau đó, bổ sung thêm 1,0 g glucose, 0,036 g Sodium pyruvate

sẽ được mDPBS. Sau đó lọc seize và bảo quản trong tủ lạnh. Để siêu âm hút

tế bào trứng sử dụng môi trường mDPBS bổ sung 2% heparin và 100.000iu

penicilin/ml + 100l streptomycin/ml.

2.2. Môi trường lọc và tìm trứng

Sử dụng môi trương mDPBS, bổ sung 5% huyết thanh bê mới sinh và

100.000iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml.

2.3. Môi trường nuôi thành thục tế bào trứng

TCM 199 47,5 ml

CS 2,5 ml

Penicilin-G 10.000IU (100IU/ml)

Streptomycin Sulfate 10mg (100µg/ml)

Bịt bằng parafil lắc đều nhiều lần ta được 50 ml môi trương nuôi, sau

đó lọc bằng microfilter

2.4. Môi trường BO để hoạt hóa tinh trùng, rửa tế bào trứng và thụ tinh in

vitro

2.4.1. Chuẩn bị dung dịch BO gốc (BO = Brackett và Oliphan)

Dung dịch A

NaCl 4,3092g

KCl 0,1974g

0,2171g CaCl2.2H2O

0,0840g NaH2PO4.2H2O

0,0697g MgCl2.6H2O

Phenol Red (dung dịch 0,5%) 0,1ml

Nước khử ion Thêm đủ 500ml

Dung dịch B

2,5873g NaHCO3

Phenol Red 0,5% 0,04ml

Nước khử ion Thêm đủ 200ml

2.4.2. Chuẩn bị môi trường BO

Dung dịch A 76ml

Na pyruvate 0,01375g

Penicilin 10.000IU

Streptomycin 10mg

Dung dịch B 24ml

Sau khi chuẩn bị xong, lọc bằng microfilter

2.4.3. Chuẩn bị môi trường hoạt hóa tinh trùng

Dung dịch BO 50ml

Na Caffein benzoate 0,1942g

Heparin (Novo-heparin: 5000IU/ml) 50 µl

2.4.4.Chuẩn bị dung dịch rửa tế bào trứng

Dung dịch BO 40ml

BSA 400mg

2.4.5. Dung dịch thụ tinh trong ống nghiệm

Dung dịch BO 10ml

BSA 200mg

2.5. Chuẩn bị môi trường nuôi phôi (CR1aa)

Dung dịch A

NaCl 6,7031g

KCl 0,2311g

Na Pyruvate 0,0440g

2,2011g NaHCO3

Phenol Red 5% 2ml

Nước cất khử ion Thêm đủ 760ml

Dung dịch B

Hemicalcium lactate 0,5996g

Nước cất khử ion Thêm đủ 200ml

Môi trường CR1aa

Dung dịch A 76ml

Dung dịch B 20ml

BME Essential Amino Acids 2ml

MEM Non Essential Amino Acids 1ml

L-Glutamic Acid (2mg/ml) 1ml

BSA 3mg/ml

Penicilin-G 10.000IU (100IU/ml)

Streptomycin Sulfate 10mg (100µg/ml)