Nguyên tắc cơ bản của PCR
+ Khái quát chung:
PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN
theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt,
hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi
một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là
biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắt
cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều
5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên
bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi
mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết
quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được
thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi
cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng
phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy là do nếu
chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được đoạn gene
đích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được thiết kế thì
chúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trường
hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm PCR không đặc
hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định typ vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzym
ADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94oC và như
vậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này
đã được cải thiện do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus
) chịu nhiệt. Enzym này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc độ
xúc tác cho phản ứng của enzym này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại
755oC. Hoạt tính enzym giảm một nửa khi xử lý tại 92.5oC trong 230 phút hoặc 40
phút tại 95oC. Như vậy khi dùng enzym này thì không cần bổ sung enzym mới sau
mỗi chu kỳ phản ứng.
+ Các thông số kỹ thuật:
Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi
khuôn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo
ra sản phẩm nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn
bị ADN theo phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản
ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (acide
éthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm giảm Mg++
(do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có
thể nhân được đoạn gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế thường dùng để nhân các
đoạn có kích thước ngắn hơn (<2 Kb). Có thể tham khảo các thông số thành phần
phản ứng PCR trong bảng dưới đây.
Bảng 1.8. Thành phần phản ứng PCR.
Thành phần Số lượng
ADN khuôn 10-100 ng
dNTP (mỗi loại) 200 mM
Mồi xuôi 0.1 – 1.0 mM
Mồi ngược 0.1 – 1.0 mM
Taq polymerase 1 U
KCL 50 mM
Tris HCL (pH 8.4) tại 25oC 10 mM
MgCl2 2.85 mM
Gelatin 100 mg/l
Nonidet-40 0.05%
Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ý
là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có trình
tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồi
cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện
tượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc chọn mồi nhờ
sự trợ giúp của các chương trình máy tính.
Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu,
điều này thường hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin.
Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng
có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành phần như nhiệt
độ, nồng độ Mg++ và enzym có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt của
nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng.
Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanh
chóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này yêu cầu sản
phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo cách này trình tự có thể được thực hiện
như sau: Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa với
ethanol. Kết tủa được hoà với đệm thích hợp và sau đó được xử lý với enzym cắt
hạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thường trên gel agarose, trong một số
trường hợp có thể trên gel polyacylamid để thu được độ phân giải cao hơn. Chú ý
rằng thông thường hoạt tính enzym giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy có thể
ước lượng 50% hiệu quả khuyếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng.
+ Một số khó khăn với phản ứng PCR:
PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhưng
cũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện một số bệnh virus
hay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đều