Nhân nhanh hoa hoàng lan bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi soma

33(4): 72-78 T¹p chÝ Sinh häc 12-2011<br /> <br /> <br /> <br /> NH¢N NHANH HOA Hoµng LAN<br /> B»NG Kü THUËT NU¤I CÊY PH¤I SOMA<br /> <br /> Bïi ThÞ T−êng Thu, TrÇn V¨n Minh<br /> <br /> ViÖn Sinh häc nhiÖt ®íi<br /> <br /> Vi nh©n gièng truyÒn thèng trªn loµi hoa lan M«i tr−êng dinh d−ìng kho¸ng c¬ b¶n ®−îc<br /> hiÖn nay dÉn ®Õn mét vÊn ®Ò mµ c¸c phßng thÝ sö dông trong nu«i cÊy lµ MS (Murashige &.<br /> nghiÖm vi nh©n gièng th−êng gÆp ph¶i ®ã lµ tèn Skoog, 1962) [6]. Cã bæ sung: BA (6-<br /> nhiÒu chi phÝ lao ®éng ®Ó s¶n xuÊt c©y con víi benzylaminopurine), TDZ (thidiazuron), kinetin<br /> khèi l−îng lín, khi ®−a ra thÞ tr−êng gi¸ thµnh (6-furfurylaminopurine), IAA (β-indolacetic<br /> c©y con l¹i cao [7]. HÖ thèng nh©n gièng b»ng acid), IBA (β-indolacetic acid), NAA (α-<br /> ph«i v« tÝnh [2] sÏ gi¶i quyÕt ®−îc rµo c¶n nªu napthalene acetic acid), B1 (5 mg/l), n−íc dõa,<br /> trªn víi c¸c lîi thÕ: nh©n nhanh d−íi d¹ng tÕ ®−êng sucrose (30 g/l).<br /> bµo, ph«i v« tÝnh lµ mét thÓ biÖt hãa cã hÖ sè t¸i §iÒu kiÖn nu«i cÊy: nhiÖt ®é phßng 26 ±<br /> sinh cao, tèn Ýt chi phÝ lao ®éng vµ gi¸ thµnh h¹<br /> 2oC, RH = 65%, thêi gian chiÕu s¸ng 10<br /> [4]. VËt liÖu khëi ®Çu lµ thÓ ph«i gi¶ (PLB) vµ<br /> bÑ l¸ non in vitro trong nu«i cÊy ph«i v« tÝnh cã giê/ngµy, c−êng ®é chiÕu s¸ng 33,3 µmol/m2/s,<br /> vai trß ®¶m b¶o ®−îc ®Æc ®iÓm di truyÒn bè mÑ tèc ®é l¾c 100 rpm.<br /> vµ duy tr× hÖ sè t¸i sinh cao trong thêi gian dµi ThiÕt kÕ thÝ nghiÖm: bè trÝ theo khèi ®Çy ®ñ<br /> [9]. M«i tr−êng nu«i cÊy ph«i v« tÝnh thÝch hîp ngÉu nhiªn, 3 lÇn lËp l¹i, mçi lÇn lËp l¹i nu«i<br /> chiÕm vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh sinh cÊy 3 b×nh tam gi¸c (chøa 60 ml m«i tr−êng b¸n<br /> tr−ëng vµ biÖt hãa tÕ bµo ph«i [1]. §iÒu khiÓn r¾n hay 50 ml m«i tr−êng láng). Sè liÖu ®−îc<br /> qu¸ tr×nh biÖt hãa vµ t¸i sinh ph«i v« tÝnh d−íi ph©n tÝch b»ng phÇm mÒm MSTATC (t = 0,05).<br /> t¸c ®éng cña c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng BA,<br /> kinetin, TDZ, NAA ®V trë thµnh quy luËt [3]. II. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN<br /> PLB lµ mét thÓ ®a ph«i ph«i ®Æc biÖt ph¸t sinh<br /> trong nu«i cÊy c¸c lßai hoa lan chÞu nhiÒu t¸c 1. Nu«i cÊy t¹o thÓ ph«i PLB<br /> ®éng cña cytokinin [8]. Nghiªn cøu t¹o m« sÑo<br /> Chåi non hoa lan in vitro cã ®é tuæi 20 ngµy<br /> ph«i hãa, nu«i cÊy t¹o ph«i soma, vµ t¸i sinh<br /> nu«i cÊy ®−îc sö dông lµm nguyªn liÖu nu«i<br /> ph«i soma lµ rµo c¶n ®Çu tiªn trong kü thuËt<br /> cÊy. MÉu nu«i cÊy lµ l¸ non cßn bÑ tr¾ng. MÉu<br /> nu«i cÊy ph«i soma [5, 10]. Bµi b¸o nµy nghiªn<br /> ®−îc nu«i cÊy trªn m«i tr−êng t¹o ph«i PLB:<br /> cøu nh©n nhanh hoa hoµng lan th«ng qua kü<br /> MS + CW (10%) cã bæ sung IAA, IBA, NAA,<br /> thuËt nu«i cÊy ph«i soma.<br /> BAvµ TDZ.<br /> I. PH¦¥NG PH¸P nghiªn cøu KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy (b¶ng 1): Sau<br /> 45 ngµy, PLB xuÊt hiÖn m¹nh trªn m«i tr−êng<br /> 1. Nguyªn liÖu nu«i cÊy MS + CW (10%) cã bæ sung c¸c tæ hîp<br /> chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng IBA+BA, IAA+BA.<br /> Nguyªn liÖu lµ gièng hoa hoµng lan Bæ sung tæ hîp TDZ+NAA vµ TDZ cho ph¸t<br /> Dendrobium cv. sonia earsakul nhËp néi tõ sinh 3,4-8,2 PLB/ mÉu nu«i cÊy; trong ®ã tæ hîp<br /> Singapore. MÉu nu«i cÊy: (i) Corm ®Ønh sinh TDZ (1 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) ®¹t hiÖu suÊt<br /> tr−ëng chåi in vitro 20 ngµy tuæi; (ii) L¸ non t¹o 8,2 PLB/mÉu. PLB ®−îc t¸ch rêi khái mÉu<br /> (cßn bÑ l¸ tr¾ng) chåi in vitro 20 ngµy tuæi; (iii) nu«i cÊy, ®−îc sö dông lµm nguyªn liÖu cho<br /> PLB ®−îc c¾t l¸t máng. nghiªn cøu vi nh©n gièng hay nu«i cÊy t¹o tÕ<br /> 2. Ph−¬ng ph¸p bµo soma.<br /> <br /> <br /> 72<br />  B¶ng 1<br /> ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng ®Õn ph¸t sinh thÓ ph«i PLB<br /> ChÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng Tû lÖ ph¸t sinh PLB (%) Sè PLB /mÉu<br /> 2,4D (0,1 mg/l) 100 1,2<br /> 2,4D (0,2 mg/l) 100 1,5<br /> 2,4D (0,3 mg/l) 100 1,6<br /> 2,4D (0,4 mg/l) 100 1,8<br /> 2,4D (0,5 mg/l) 100 2,0<br /> 2,4D (1 mg/l) 92 2,2<br /> 2,4D (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 83 2,0<br /> IBA (0,5 mg/l) 100 2,4<br /> IBA (0,5 mg/l) + BA (1 mg/l) 80 3,6<br /> IAA (0,5 mg/l) 100 2,2<br /> IAA (0,5 mg/l) + BA (1 mg/l) 100 3,4<br /> Kinitin (0,5 mg/l) + 2,4D (0,5 mg/l) 100 2,6<br /> Kinitin (0,5 mg/l) + IAA (0,5 mg/l) 100 2,8<br /> Kinitin (2 mg/l) + 2,4D (0,5 mg/l) 80 3,8<br /> Kinitin (2 mg/l) + IAA (0,5 mg/l) 93 4,2<br /> TDZ (1 mg/l) 92 5,8<br /> TDZ (3 mg/l) 96 2,8<br /> NAA (0,5 mg/l) 100 2,6<br /> TDZ (1 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) 100 8,2<br /> TDZ (3 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) 100 5,6<br /> CV% 12,8 9,4<br /> <br /> 2. Nu«i cÊy t¹o dÞch huyÒn phï m« sÑo c¾t, trªn m«i tr−êng agar MS + CW (30%) +<br /> ph«i hãa 2.4D (0,5 mg/l). L¸t c¾t cã m« sÑo ®−îc ®−a vµo<br /> nu«i cÊy trong m«i tr−êng láng MS + CW<br /> MÉu nu«i cÊy lµ PLB ®−îc c¾t thµnh tõng l¸t (30%) + 2.4D (0,5 mg/l), sau 8 tuÇn nu«i cÊy,<br /> máng dµy 1 mm vµ ®−îc ®−a vµo nu«i cÊy trªn läc läai bá l¸t c¾t PLB, ®−îc dÞch huyÒn phï tÕ<br /> m«i tr−êng ph¸t sinh m« sÑo ph«i hãa MS + CW bµo m« sÑo. M«i tr−êng nu«i cÊy t¹o m« sÑo lµ<br /> (30%) cã bæ sung 2.4D (0-0,3-0,5 mg/l). MS kh«ng bæ sung chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng (0-<br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, sau 4 tuÇn PGR) vµ ph¸t sinh t¹o dÞch huyÒn phï tèt nhÊt lµ<br /> nu«i cÊy, m« sÑo h×nh thµnh trªn bÒ mÆt l¸t MS + CW (30%) + 2.4D (0,3 mg/l) (b¶ng 2).<br /> <br /> B¶ng 2<br /> ¶nh h−ëng cña m«i tr−êng nu«i cÊy ®Õn ph¸t sinh m« sÑo<br /> M«i tr−êng nu«i cÊy Tû lÖ ph¸t sinh T¹o dÞch huyÒn phï tÕ<br /> Trªn agar (4 tuÇn) Trong láng (4 tuÇn) m« sÑo (%) bµo m« sÑo (mg/50ml)<br /> 2.4D (0,3 mg/l) 2.4D (0,3 mg/l) 50 1.286<br /> 2.4D (0,5 mg/l) 2.4D (0,5 mg/l) 70 1.864<br /> 2.4D (0,0 mg/l) 2.4D (0,3 mg/l) 100 1.483<br /> CV% 12 10,8<br /> <br /> 3. Nu«i cÊy t¨ng sinh tÕ bµo m« sÑo ph«i hãa 500 mg/mÉu. M«i tr−êng nu«i cÊy t¨ng sinh m«<br /> M« sÑo tõ nghiªn cøu trªn ®−îc sö dông sÑo ph«i hãa MS + CW (10%) cã bæ sung NAA<br /> trong nghiªn cøu nu«i cÊy t¨ng sinh m« sÑo (0-0,1-0,5-1,0 mg/l) vµ 2.4D (0-0,1-0,5-1,0<br /> ph«i hãa. Khèi l−îng m« sÑo ®−a vµo nu«i cÊy mg/l) vµ ®èi chøng kh«ng bæ sung chÊt ®iÒu hßa<br /> <br /> <br /> 73<br /> sinh tr−ëng (0-PGR). Theo nhiÒu t¸c gi¶, do m« sÑo hoa hoµng lan cã<br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, sau 30 ngµy hiÖn t−îng häai tö sau thêi gian dµi nu«i cÊy,<br /> nu«i cÊy, m« sÑo ph«i hãa t¨ng sinh nhanh trªn nªn m«i tr−êng duy tr× t¨ng sinh m« sÑo ph«i<br /> m«i tr−êng cã bæ sung NAA (0,5 mg/l) + 2.4D hãa lµ m«i tr−êng nu«i cÊy c¸ch qu¶ng cã bæ<br /> (0,1 mg/l) ®¹t hÖ sè t¨ng sinh 4,6 vµ cao h¬n so sung NAA (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l) vµ 0-<br /> víi ®èi chøng (hÖ sè t¨ng sinh 2,2) (b¶ng 3). PGR lµ thÝch hîp.<br /> <br /> B¶ng 3<br /> ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng ®Õn t¨ng sinh tÕ bµo m« sÑo<br /> M«i tr−êng nu«i cÊy Sinh khèi tÕ bµo m« sÑo HÖ sè t¨ng sinh<br /> NAA (mg/l) 2.4D (mg/l) sau 30 ngµy nu«i cÊy (mg) sau 30 ngµy nu«i cÊy<br /> 0,0 0,0 1.146 2,2<br /> 0,1 - 1.425 2,8<br /> 0,5 - 1.628 3,2<br /> 1,0 - 1.846 3,6<br /> - 0,1 1.245 2,4<br /> - 0,5 1.672 3,2<br /> - 1,0 1.656 3,8<br /> 0,5 0,1 2.374 4,6<br /> 0,5 0,5 2.136 4,2<br /> CV% 12,4 9,6<br /> <br /> 4. ¶nh h−ëng cña m« nu«i cÊy ®Õn t¸i sinh m« sÑo) (b¶ng 4). M« sÑo ph«i hãa t¨ng sinh<br /> m« sÑo ph«i hãa nhanh trong nu«i cÊy kÐo dµi. M« sÑo ph«i hãa<br /> ®Æt d−íi ¸nh s¸ng cã ®iÓm xanh. M« sÑo ph«i<br /> MÉu nu«i cÊy lµ PLB ®−îc c¾t thµnh tõng l¸t hãa ®Æt d−íi ¸nh s¸ng khuÕch t¸n cã mµu tr¾ng<br /> máng dµy 1 mm vµ l¸ non t¸ch rêi cßn bÑ tr¾ng ngµ. M« sÑo xanh ®−îc sö dông trong nghiªn<br /> (chåi in vitro 10-20 mm), chåi ®Ønh vµ h¹t lai cøu t¸i sinh, m« sÑo vµng ngµ thÝch hîp cho<br /> ®−îc sö dông lµm nguyªn liÖu nu«i cÊy t¹o m« nu«i cÊy t¨ng sinh trong m«i tr−êng láng.<br /> sÑo ph«i hãa. Khèi l−îng m« sÑo ®−a vµo nu«i<br /> cÊy t¸i sinh lµ 500 mg/mÉu. M«i tr−êng nu«i cÊy t¸i sinh m« sÑo ph«i<br /> hãa: MS + NAA (0,1 mg/l) + BA (0,5 mg/l). Sau<br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, sau 30 ngµy 30 ngµy nu«i cÊy: M« sÑo ph«i hãa tõ bèn läai<br /> nu«i cÊy: Trªn m«i tr−êng nu«i cÊy ph¸t sinh m« ®−a vµo nu«i cÊy ®Òu cã kh¶ n¨ng t¸i sinh<br /> t¹o m« sÑo ph«i hãa: MS + 2.4D (0,5 mg/l) + cao. HiÖu suÊt t¸i sinh 100% lo¹i mÉu ®−a vµo<br /> CW (10%). C¶ bèn läai m« ®−a vµo nu«i cÊy nu«i cÊy. Sè chåi ®¹t trung b×nh 6,2-8,6<br /> ®Òu ph¸t sinh m« sÑo ph«i hãa (72-92% mÉu t¹o chåi/mÉu nu«i cÊy.<br /> <br /> B¶ng 4<br /> ¶nh h−ëng cña m« nu«i cÊy ®Õn t¸i sinh m« sÑo<br /> MÉu nu«i M«i tr−êng nu«i cÊy t¹o m« sÑo (sau 30 ngµy nu«i cÊy) HiÖu suÊt t¸i sinh<br /> cÊy Tû lÖ t¹o m« sÑo (%) HÖ sè t¨ng sinh cÊy truyÒn (chåi/côm)<br /> L¸t c¾t PLB 74 3,8 8,4<br /> BÑ l¸ non 92 4,2 6,2<br /> Tõ chåi ®Ønh 74 3,6 8,6<br /> Tõ h¹t lai 72 3,8 7,2<br /> <br /> 5. T¸i sinh m« sÑo ph«i hãa trong nghiªn cøu t¸i sinh m« sÑo ph«i hãa. Khèi<br /> M« sÑo tõ nghiªn cøu trªn ®−îc sö dông l−îng m« sÑo ®−a vµo nu«i cÊy 500 mg/mÉu ®V<br /> <br /> <br /> 74<br /> ®−îc cÊy truyÒn 6 lÇn. M«i tr−êng nu«i cÊy t¸i ngµy nu«i cÊy, tû lÖ t¸i sinh ®¹t 74-100% trªn c¸c<br /> sinh m« sÑo ph«i hãa MS + CW (10%) cã bæ nghiÖm thøc chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng bæ sung.<br /> sung NAA (0-0,1-0,5-1,0 mg/l) vµ 2.4D (0-0,1- Sè chåi ®¹t cao 6,8 chåi/côm ë tæ hîp NAA (0,1<br /> 0,5-1,0 mg/l) vµ ®èi chøng kh«ng bæ sung chÊt mg/l) + BA (0,1 mg/l) (b¶ng 5). Tû lÖ t¸i sinh cao<br /> ®iÒu hßa sinh tr−ëng (0-PGR). ë m« sÑo, cho thÊy tÕ bµo m« sÑo ph«i hãa lµ ®¬n<br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, sau 30 vÞ nh©n gièng thÝch hîp trong nu«i cÊy láng.<br /> <br /> B¶ng 5<br /> ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng ®Õn t¸i sinh m« sÑo ph«i hãa<br /> ChÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng Tû lÖ t¸i sinh (%) Sè chåi /côm<br /> NAA (mg/l) BA (mg/l) sau 30 ngµy nu«i cÊy<br /> 0,0 0,0 74 2,0<br /> 0,1 - 76 3,2<br /> 0,5 - 82 2,2<br /> 1,0 - 84 1,8<br /> - 0,1 100 3,6<br /> - 0,5 100 4,2<br /> - 1,0 100 3,8<br /> 0,1 0,1 100 6,8<br /> 0,1 0,5 100 4,4<br /> 0,1 1,0 100 4,2<br /> CV% 10,6 8,8<br /> <br /> 6. Nu«i cÊy t¨ng sinh dÞch huyÒn phï tÕ bµo vµo nu«i cÊy 1g/50ml thÓ tÝch m«i tr−êng ®V<br /> m« sÑo ph«i hãa: ®−îc cÊy truyÒn 6 lÇn. M«i tr−êng láng nu«i cÊy<br /> t¨ng sinh m« sÑo ph«i hãa MS + CW (10%) cã<br /> M« sÑo tõ nghiªn cøu trªn ®−îc sö dông bæ sung NAA (0-0,1-0,5-1,0 mg/l) vµ 2.4D (0-<br /> trong nghiªn cøu t¨ng sinh dÞch huyÒn phï tÕ 0,1-0,5-1,0 mg/l) vµ ®èi chøng kh«ng bæ sung<br /> bµo m« sÑo ph«i hãa. Khèi l−îng m« sÑo ®−a chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng (0-PGR).<br /> <br /> B¶ng 6<br /> ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng ®Õn t¨ng sinh dÞch huyÒn phï m« sÑo<br /> M«i tr−êng nu«i cÊy Sinh khèi dÞch huyÒn phï HÖ sè t¨ng sinh<br /> NAA (mg/l) 2.4D (mg/l) tÕ bµo m« sÑo (mg)<br /> 0,0 0,0 2.248 3,2<br /> 0,1 - 5.672 5,6<br /> 0,5 - 4.274 4,2<br /> 1,0 - 2.834 2,8<br /> - 0,1 5.896 5,8<br /> - 0,5 4.688 4,6<br /> - 1,0 3.282 3,2<br /> 0,5 0,1 11.496 11,4<br /> 0,5 0,5 8.224 8,2<br /> CV% 14,2 8,8<br /> <br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, sau 30 ngµy (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l), ®¹t hÖ sè t¨ng sinh<br /> nu«i cÊy, dÞch huyÒn phï m« sÑo ph«i hãa t¨ng 11,4 vµ cao h¬n so víi ®èi chøng (hÖ sè t¨ng<br /> sinh nhanh trªn m«i tr−êng cã bæ sung NAA sinh 2,2) (b¶ng 6). Theo nhiÒu t¸c gi¶, do m«<br /> <br /> <br /> 75<br /> sÑo hãa hoµng lan cã hiÖn t−îng häai tö sau thêi 10 g/50 ml thÓ tÝch m«i tr−êng. M«i tr−êng nu«i<br /> gian dµi nu«i cÊy, nªn m«i tr−êng duy tr× t¨ng cÊy häat hãa ph¸t sinh ph«i MS + CW (10%) cã<br /> sinh dÞch huyÒn phï tÕ bµo m« sÑo ph«i hãa lµ bæ sung NAA (0,1 mg/l) + BA(0,1 mg/l).<br /> m«i tr−êng nu«i cÊy c¸ch quVng cã bæ sung KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, sau 4 tuÇn<br /> NAA (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l) vµ 0-PGR lµ nu«i cÊy, hiÖu suÊt häat hãa ph¸t sinh ph«i (tÕ<br /> thÝch hîp h¬n c¶. bµo ph«i h×nh cÇu, h×nh tim, h×nh thñy l«i) ®¹t<br /> 7. Nu«i cÊy c¶m øng ph¸t sinh ph«i cao nhÊt 88,4% trªn m«i tr−êng nu«i cÊy MS +<br /> CW (10%) + NAA (0,1 mg/l) + BA (0,1 mg/l)<br /> Nu«i cÊy c¶m øng ph¸t sinh ph«i lµ nu«i cÊy (b¶ng 7). Tèc ®é t¨ng sinh gi¶m nhanh, ng−îc<br /> kÝch thÝch m« sÑo ph«i hãa biÖt hãa thµnh ph«i l¹i tèc ®é ph©n hãa ph«i t¨ng nhanh. DÞch huyÒn<br /> soma trong m«i tr−êng nu«i cÊy láng. DÞch phï ph©n hãa ph«i cao sau 4 tuÇn nu«i cÊy,<br /> huyÒn phï tÕ bµo m« sÑo ph«i hãa ®−îc cÊy sau giai ®äan nµy tÕ bµo m« sÑo t¨ng sinh khèi,<br /> truyÒn 6 lÇn ®−îc sö dông lµm nguyªn liÖu nu«i lµm gi¶m hiÖu suÊt häat hãa (42,4% sau 6 tuÇn<br /> cÊy. Khèi l−îng tÕ bµo ®−a vµo nu«i cÊy lµ nu«i cÊy).<br /> <br /> B¶ng 7<br /> ¶nh h−ëng cña thêi gian nu«i cÊy ®Õn hiÖu suÊt häat hãa c¶m øng ph¸t sinh ph«i<br /> Thêi gian nu«i cÊy MËt ®é tÕ bµo ho¹t ho¸ HiÖu suÊt ho¹t ho¸ (%) so<br /> (tuÇn) (CFU/ml) sau 4 tuÇn víi mËt ®é tÕ bµo ban ®Çu<br /> 1 0,8 × 10 4<br /> 58,0<br /> 2 0,9 × 10 4<br /> 68,3<br /> 3 1,2 × 104 82,6<br /> 4 1,4 × 10 4<br /> 88,4<br /> 5 0,8 × 10 4<br /> 50,6<br /> 6 0,7 × 104 42,4<br /> CV% 12,4 9,2<br /> <br /> 8. Tr¶i vµ t¸i sinh tÕ bµo ph«i soma trªn m«i tr−êng agar<br /> B¶ng 8<br /> ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng ®Õn t¸i sinh ph«i<br /> M«i tr−êng nu«i cÊy cã bæ sung Tû lÖ t¸i sinh (%) Sè chåi /5ml dÞch huyÒn<br /> NAA (mg/l) BA (mg/l) TDZ (mg/l) phï tÕ bµo ph«i<br /> - - - 86 12<br /> 0,1 - - 68 10<br /> 0,2 - - 72 8<br /> - 0,1 - 100 16<br /> - 0,2 - 100 18<br /> - - 0,1 92 14<br /> - - 0,2 78 16<br /> 0,1 0,1 - 100 22<br /> 0,1 0,2 - 100 24<br /> 0,1 - 0,1 100 15<br /> 0,1 - 0,2 100 18<br /> CV% 10.8 10<br /> <br /> DÞch huyÒn phï tÕ bµo ph«i hãa ®−îc sö nu«i cÊy 5 ml/60 ml m«i tr−êng nu«i cÊy b¸n<br /> dông lµm nguyªn liÖu nu«i cÊy. ThÓ tÝch tr¶i r¾n. M«i tr−êng nu«i cÊy tr¶i vµ t¸i sinh dÞch<br /> <br /> 76<br /> huyÒn phï ph«i soma MS + CW (10%) cã bæ ph«i hãa: MS + NAA (0,1 mg/l) + BA (0,5<br /> sung NAA (0,1-0,2 mg/l), TDZ (0,1-0,2 mg/l), mg/l). M« sÑo ph«i hãa tõ hai läai m« nu«i cÊy<br /> BA(0,1-0,2 mg/l), vµ ®èi chøng kh«ng bæ sung ®Òu cã hiÖu suÊt t¸i sinh 100%, ®¹t 6-8<br /> chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng (0-PGR). chåi/mÉu nu«i cÊy.<br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, sau 45 ngµy T¸i sinh m« sÑo ph«i hãa: M«i tr−êng nu«i<br /> nu«i cÊy: TDZ øc chÕ qu¸ tr×nh ph¸t sinh m« cÊy t¸i sinh m« sÑo ph«i hãa MS + CW (10%) +<br /> sÑo, tÕ bµo bÞ häai tö cao, h¹n chÕ tû lÖ t¸i sinh. NAA (0,1 mg/l) + BA (0,1 mg/l). Sau 30 ngµy<br /> M«i tr−êng nu«i cÊy cã bæ sung tæ hîp NAA nu«i cÊy: Tû lÖ t¸i sinh ®¹t 74-100% trªn c¸c<br /> (0,1 mg/l) + BA (0,2 mg/l) vµ m«i tr−êng 0- nghiÖm thøc. Sè chåi ®¹t cao 6,8 chåi/côm.<br /> PGR, cho ph¸t sinh m« sÑo ®i ®«i víi t¸i sinh Nu«i cÊy t¨ng sinh dÞch huyÒn phï tÕ bµo<br /> (b¶ng 8). Sè chåi ®Ønh ®¹t cao (24 chåi ®Ønh/5 m« sÑo ph«i hãa: M«i tr−êng láng nu«i cÊy t¨ng<br /> ml dÞch huyÒn phï tÕ bµo ph«i nu«i cÊy) trªn sinh m« sÑo ph«i hãa MS + CW (10%) cã bæ<br /> m«i tr−êng MS + CW (10%) cã bæ sung tæ hîp sung NAA (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l) cã hÖ sè<br /> NAA (0,1 mg/l) + BA (0,2 mg/l). Sau 60 ngµy t¨ng sinh 11,4 vµ cao h¬n so víi ®èi chøng (hÖ<br /> nu«i cÊy, m« sÑo ph¸t triÓn nhanh trªn m«i sè t¨ng sinh 2,2) sau 30 ngµy nu«i cÊy.<br /> tr−êng cã bæ sung tæ hîp NAA (0,1 mg/l) + BA<br /> (0,2 mg/l), ®i ®«i víi sù h×nh thµnh côm chåi tõ Nu«i cÊy c¶m øng ph¸t sinh ph«i: HiÖu suÊt<br /> mÉu m« ph«i nu«i cÊy. häat hãa (tÕ bµo ph«i h×nh cÇu, h×nh tim, h×nh<br /> thñy l«i) ®¹t 88,4% trªn m«i tr−êng nu«i cÊy<br /> III. KÕT LUËN MS + CW (10%) + NAA (0,1 mg/l) + BA (0,1<br /> mg/l) sau 30 ngµy nu«i cÊy.<br /> Nu«i cÊy t¹o thÓ ph«i PLB: Chåi non hoa Tr¶i vµ t¸i sinh tÕ bµo ph«i soma trªn m«i<br /> lan in vitro cã ®é tuæi 20 ngµy nu«i cÊy ®−îc sö tr−êng agar: DÞch huyÒn phï tÕ bµo ph«i hãa<br /> dông lµm nguyªn liÖu nu«i cÊy. MÉu nu«i cÊy lµ ®−îc tr¶i nu«i cÊy 5 ml/60 ml trªn m«i tr−êng<br /> l¸ non cßn bÑ tr¾ng. PLB xuÊt hiÖn m¹nh trªn nu«i cÊy b¸n r¾n MS + CW (10%) cã bæ sung tæ<br /> m«i tr−êng nu«i cÊy MS + CW (10%) cã b«<br /> hîp NAA (0,1 mg/l) + BA (0,2 mg/l). Sau 45<br /> sung tæ hîp TDZ (1 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) ®¹t ngµy nu«i cÊy: cho ph¸t sinh m« sÑo ®i ®«i víi<br /> hiÖu suÊt t¹o 8,2 PLB/mÉu. PLB ®−îc t¸ch rêi<br /> t¸i sinh tíi 24 chåi ®Ønh/5ml dÞch huyÒn phï tÕ<br /> khái mÉu nu«i cÊy, ®−îc sö dông lµm nguyªn bµo ph«i.<br /> liÖu cho nghiªn cøu vi nh©n gièng hay nu«i cÊy<br /> t¹o tÕ bµo soma. Lêi c¶m ¬n: Ch©n thµnh c¸m ¬n V¨n phßng<br /> C¸c ch−¬ng tr×nh träng ®iÓm cÊp nhµ n−íc vµ<br /> Nu«i cÊy t¹o dÞch huyÒn phï m« sÑo ph«i Ch−¬ng tr×nh C«ng nghÖ sinh häc KC04 ®V cÊp<br /> hãa: M« sÑo h×nh thµnh trªn l¸t c¾t PLB trªn<br /> kinh phÝ thùc hiÖn ®Ò tµi KC04.15/06-10 “øng<br /> m«i tr−êng agar MS + CW (30%) + 2.4D (0,5<br /> dông kü thuËt nu«i cÊy l¸t máng tÕ bµo, c«ng<br /> mg/l) sau 4 tuÇn nu«i cÊy. L¸t c¾t PLB cã m«<br /> sÑo ®−îc ®−a vµo nu«i cÊy trong m«i tr−êng nghÖ ph«i soma vµ bioreactor trong nh©n nhanh<br /> láng MS + CW (30%) + 2.4D (0,5 mg/l), sau 8 c¸c c©y trång kinh tÕ”.<br /> tuÇn nu«i cÊy, thu nhËn dÞch huyÒn phï tÕ bµo<br /> m« sÑo. TµI LIÖU THAM KH¶O<br /> <br /> Nu«i cÊy t¨ng sinh tÕ bµo m« sÑo ph«i hãa: 1. Arditti J., 2008: Micropropagation of<br /> M«i tr−êng nu«i cÊy t¨ng sinh m« sÑo ph«i hãa orchids. Blackwell Publishing, 1523 pages.<br /> MS + CW (10%) cã bæ sung NAA (0,5 mg/l) +<br /> 2.4D (0,1 mg/l) ®¹t hÖ sè t¨ng sinh 4,6 cao h¬n 2. Chandler S. F., Lu C. Y., 2005:<br /> so víi ®èi chøng 2,2. Biotechnology in ornamental horticulture. In<br /> Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 41: 591-601.<br /> ¶nh h−ëng cña m« nu«i cÊy ®Õn t¸i sinh m«<br /> sÑo ph«i hãa: Sau 30 ngµy nu«i cÊy: Trªn m«i 3. Chung H. H., Chen J. T., Chang W. C.,<br /> tr−êng nu«i cÊy ph¸t sinh t¹o m« sÑo ph«i hãa: 2005: Cytokinin induce direct somatic<br /> MS + 2.4D (0,5 mg/l) + CW (10%). C¶ bèn läai embryogenesis of Dendrobium Chiengmai<br /> m« ®−a vµo nu«i cÊy ®Òu ph¸t sinh m« sÑo ph«i Pink and subsequent plant regeneration. In<br /> hãa. Trªn m«i tr−êng nu«i cÊy t¸i sinh m« sÑo Vitro Cell Dev. Biol. - Plant, 41: 765-769.<br /> <br /> <br /> 77<br /> 4. Gamborg O. L., 2002: Plant tissue culture: from leaf subepidermal cells of<br /> biotechnology and milestones. In Vitro Cell. Doritaenopsis hybrid using thin-section<br /> Dev. Biol.-Plant, 38: 84-92. culture. Plant Cell Report, 21: 46-51.<br /> 5. Jaime A., Teixeira da Silva, Singh N., 9. Roy J., Naha S., Majumdar M., Banerjee<br /> Tanaka M., 2006: Priming biotic factorsfor N., 2007: Direct and callus-mediated<br /> optomal PLB and callus induction in hybrid protocorm-like body induction from shoot-<br /> Cymbidium, and assessment of cytogenetic tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl.<br /> stability in regenerated plants. Plant Cell (Orchidaceae). Plant Cell Tiss Organ Cult,<br /> Tissue and Organ Culture, 84: 135-144. 90: 31-39.<br /> 6. Murashige T., Skoog R., 1962: A revised 10. Zhao, Phttp://www.bioone.org/doi/abs/<br /> medium for rapid growth and bioassays with 10.1007/s11627-007-9101-2 - aff1, Wu<br /> tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: Fhttp://www.bioone.org/doi/abs/10.1007/s11<br /> 431-497. 627-007-9101-2 - aff1, Feng FS<br /> 7. Paek K. Y., Chakrabarty D., Hahn E. J., http://www.bioone.org/doi/abs/10.1007/s116<br /> 2005: Application of bioreactor systems for 27-007-9101-2 - aff1, Wan-Jun Wang WJ<br /> large scale production of horticultural and (2008). Protocorm-like body (PLB) formation<br /> medicinal plants. Plant Cell, Tissue and and plant regeneration from the callus culture<br /> Organ Culture, 81: 287-300. of Dendrobium candidum Wall ex Lindl. In<br /> Vitro Cellular and Developmental Biology-<br /> 8. Park S. Y., Yeung E. C., Chakrabarty D.,<br /> Plant, 44(3): 178-185.<br /> 2002: An efficient direct induction of PLB<br /> <br /> <br /> MICROPROPAGATION OF DENDROBIUM SP.<br /> VIA SOMATIC EMBRYOGENESIS CULTURE<br /> <br /> Nguyen Thi Ngoc Tu, Bui Thi Tuong Thu, Tran Van Minh<br /> <br /> <br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Protocorm like bodies were used as planting materials. PLBs were cut into slices and placed on the<br /> medium for callus initiated. Callus was initiated on the medium MS + CW (30%) + 2.4D (0.5 mg/l). Callus<br /> proliferates on the medium MS + CW (10%) supplemented with NAA (0.5 mg/l) + 2.4D (0.1 mg/l). Callus<br /> was regenerated on the medium MS + (10%) supplemented with + NAA (0.1 mg/l) + BA (0.1 mg/l). Somatic<br /> cell suspension was initiated on MS + 2.4D (0.5 mg/l) and proliferated on the medium MS + CW (10%)<br /> supplemented was NAA (0.5 mg/l) + 2.4D (0.1 mg/l). Somatic cell suspension was differentiated to<br /> embryogenic cell suspension on the medium MS + CW (10%) supplemented with NAA (0.1 mg/l) + BA (0.1<br /> mg/l). Embryogenic cell suspension was plating and regeneration on the medium MS + CW (10%) + NAA<br /> (0.1 mg/l) + BA (0.1 mg/l).<br /> <br /> <br /> Ngµy nhËn bµi: 2-8-2010<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 78<br />