Nuôi cấy mô lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) tạo rễ tơ và định lượng hoạt chất saponin tích lũy

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 184­189<br />  DOI: 10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NUÔI CẤY MÔ LÁ ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa L. Harms) <br /> TẠO RỄ TƠ VÀ ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT SAPONIN TÍCH LŨY<br /> <br /> Nguyễn Trung Hậu1, Lê Thị Như Thảo2, Trần Văn Minh3*<br /> Trương Đ<br /> 1<br /> ̀ ại học Công Nghiệp tp. Hồ Chí Minh <br /> 2<br /> Trương Đ<br /> ̀ ại học Nông Lâm tp. Hồ Chí Minh<br /> 3<br /> Trương Đ<br /> ̀ ại học Quốc Tế, ĐHQG HCM, *drminh.ptntd@yahoo.com<br /> <br /> TÓM TẮT: Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) la loai cây d ̀ ̀ ược liêu đ<br /> ̣ ược trông phô biên<br /> ̀ ̉ ́ <br /> trong vung Đông Nam Á va đ<br /> ̀ ̀ ược sử  dung nh<br /> ̣ ư  thực phâm ch<br /> ̉ ức năng. Ngoai viêc s<br /> ̀ ̣ ử  dung nuôi<br /> ̣  <br /> ̉ ̉ ̣<br /> cây đê phat triên vung nguyên liêu, nuôi cây rê t<br /> ́ ́ ̀ ́ ̃ ơ  la môt ky thuât đ<br /> ̀ ̣ ̃ ̣ ược sử  dung đê thu nhân<br /> ̣ ̉ ̣  <br /> ̣<br /> saponin tich tu. La cây đinh lăng môt năm tuôi đ<br /> ́ ́ ̣ ̉ ược sử  dung lam vât liêu nuôi cây. La đ<br /> ̣ ̀ ̣ ̣ ́ ́ ược vô  <br /> trung băng n<br /> ̀ ̀ ươc javel pha loang 50% trong 10 phut đat hiêu qua cao. Môi tr<br /> ́ ̃ ́ ̣ ̣ ̉ ường MS co bô sung<br /> ́ ̉  <br /> 1 mg/l NAA thich h ́ ợp cho nuôi cây phat sinh rê. <br /> ́ ́ ̃ Ở các công thức có bổ sung chất điều hòa sinh  <br /> trưởng 2,4­D cho thấy không có sự hình thành rễ tơ và mô sẹo được tạo ra mạnh mẻ. Rê t ̃ ơ tăng <br /> ̣<br /> sinh manh me trên môi tr<br /> ̃ ương MS co bô sung 0,5 mg/l NAA. R<br /> ̀ ́ ̉ ễ tơ in vitro được nuôi cấy trong  <br /> môi trường có bổ sung IBA tạo sợi rễ mảnh và nhỏ hơn so với rễ tơ được nuôi cấy trong môi  <br /> trường có bổ  sung NAA. Nuôi cấy bổ  sung kinetin cho thấy không có tác động đến quá trình  <br /> tăng sinh rễ tơ. Đinh tinh oleanolic acid va saponin trong rê t<br /> ̣ ́ ̀ ̃ ơ băng ph<br /> ̀ ương phap HPLC cho thây<br /> ́ ́ <br /> ́ ự tich tu oleanolic acid 40,1 µg/g va saponin 396,2 µg/g. <br /> co s ́ ̣ ̀<br /> ̣ ̃ ơ, saponin, tăng sinh.<br /> Keywords: Polyscias fruticosa, tich tu, rê t<br /> ́<br /> <br /> MỞ ĐẦU bốn mùa nhưng tốt nhất là giữa mùa xuân, cây <br /> Hiện nay, việc tìm kiếm các hoạt chất tự  ra hoa từ tháng 4 đến tháng 7 [17].<br /> nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc là   Đinh lăng có tác dụng hồi phục sức khỏe,  <br /> một xu thế  được rất nhiều các nhà khoa học  chống stress, tăng khả  năng chịu đựng của cơ <br /> quan tâm. Việt Nam là một trong những quốc   thể,   giảm   rối   loạn   tiền   đình,   phòng   chống <br /> gia thuộc các vùng nhiệt đới, nơi chứa đựng   nhiễm ký sinh trùng sốt rét, bức xạ  siêu cao <br /> giá trị  đa dạng sinh học cao chưa được khám   tần   [12].   Đinh   lăng   còn   có   tác   dụng   kháng <br /> phá [3]. Khoảng 40­50 năm trở  lại đây, nhiều  viêm, giảm đau, chống xơ vữa động mạch dựa <br /> nhà khoa học trên thế  giới đã chú ý đến tác  trên tác dụng hạ cholesterol toàn phần và lipid <br /> dụng tăng lực, bồi bổ  cơ  thể  của nhiều cây  toàn   phần   trong   huyết   thanh.   Có   tác   dụng <br /> cùng   họ   với   cây   nhân   sâm   [9].  Một   số   cây  kháng khuẩn và kháng tốt trên các chủng Gr <br /> trong họ này cho những vị  thuốc bổ  nổi tiếng  (+) như  Staphylococcus, yếu ở vi khuẩn Gr (­) <br /> và được dùng từ lâu đời trong nhân dân ta như  và nấm mốc. Cao đinh lăng có độc tính thấp <br /> nhân sâm, ngũ gia bì, tam thất…và đinh lăng có  LD50 là 8,51 g/kg thể trọng. Lá đinh lăng chứa  <br /> tác dụng như nhiều cây họ hàng với nó. saponin   triterpen   chiếm   1,65%   là   một   genin <br /> Đinh lăng (Polyscias fruticosa  (L.) Harms)  dạng   acid   oleanolic   có   tác   dụng   dược   liệu  <br /> là cây sống nhiều năm, ưa ẩm, ưa sáng, nhưng   [23]. Trung tâm Sâm và Dược liệu tp. Hồ Chí <br /> có khả  năng chịu hạn, chịu bóng nhưng không  Minh   đã   phân   lập   được   5   loại   hợp   chất <br /> chịu  ngập  úng.   Có thể  phát  triển trên  nhiều  polyacetylen   từ   lá   đinh   lăng   là:   Panaxynol, <br /> loại   đất   nhưng   tốt   nhất   là   đất   pha  cát.   Cây  Panoxydol, Heptadeca ­ 1,8(E) ­ dien ­ 4,6diyn ­ <br /> phát  triển mạnh khi nhiệt   độ  dưới  25oC (từ  3,4diol, Heptadeca ­ 1,8 (E) ­ dien ­ 4,6diyn ­ <br /> giữa thu đến cuối xuân). Có thể  trồng được  3ol ­ 10on và Heptadeca ­ 1,8 (Z) ­ 4,6diyn ­ 3ol <br /> ­   10on.   Trong   rễ   chỉ   tìm   thấy   5   hợp   chất  <br /> <br /> <br /> 184<br /> polyacetylen Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca  acid), NAA (α­naphthaleneacetic acid), IBA ( β­<br /> ­ 1,8 (E) ­ dien ­ 4,6diyn ­ 3ol ­ 10on là ba hợp   indolbutyric   acid),   Kinetin   (6­<br /> chất giống trong lá. Các hợp chất này có tác  furfurylaminopurine).   Chất   khử   trùng   nước <br /> dụng kháng khuẩn mạnh và có tác dụng chống  javen   (nồng   độ   chlor   5%).   Chất   bám   dính <br /> một số dạng ung thư [21]. tween   (80%).   Chất   chuẩn   oleanolic   acid   và <br /> Với nhu cầu sử  dụng các loài dược liệu   saponin (Sigma Aldrich)<br /> làm thuốc ngày càng tăng, do khai thác liên tục   Thiết bị  HPLC: Agilent 1200 (USA) bơm  <br /> trong nhiều năm không chú ý tới bảo vệ  tái  mẫu tự động, đầu dò DAD<br /> sinh, cộng với nhiều nguyên nhân khác đã làm    Môi trường nuôi cấy được  khử  trùng  ở <br /> cho nguồn tài nguyên dược liệu Việt Nam bị  121 C (1 at), nhiệt độ phòng nuôi cấy 26±2oC, <br /> o<br /> <br /> giảm sút nghiêm trọng, nhiều loài đang đứng  cường độ  chiếu sáng 22,2 µmol/m2/s, độ   ẩm <br /> trước nguy cơ  bị  tuyệt chủng. Cac d ́ ịch chiết   Rh 65%.<br /> từ   lá  sim,   ngải   cứu,   đinh   lăng   và   bách   bộ  Phương pháp<br /> không  ức chế  sự  sinh cytokin khang viêm IL­<br /> ́<br /> 10, chứng to chung la nh<br /> ̉ ́ ̀ ưng dich chiêt khang<br /> ̃ ̣ ́ ́   Thí nghiệm lặp lại 3 lần, nuôi cấy 3 bình <br /> viêm tiêm năng [14]<br /> ̀ .  Dựa vào đặc điểm hình  tam giác cho 1 lần lặp lại, mỗi bình nuôi cấy 7  <br /> thái, dược chất và phân tích di truyền là cơ sở  mẫu. Kết quả thí nghiệm được xử lý thống kê <br /> khoa học cho phép chọn giống Đinh lăng ( P.  bằng phần mềm Microsoft Excel va SAS v9.1.<br /> ̀<br /> fruticosa)   có   nguồn   từ   Hưng   Yên3   vào   sản  Thiết kế thí nghiệm<br /> xuất   thuốc   [15].   Đã  xây  dựng  và   thẩm   định    Thí nghiệm 1:   Ảnh hưởng  của  nồng  độ <br /> phương pháp định lượng acid oleanolic trong   chất   khử   trùng   javen   và   thời   gian   khử   trùng <br /> cao khô đinh lăng bằng HPLC [2]. Nghiên cứu  mẫu lá cây đinh lăng: Xác định sự   ảnh hưởng  <br /> phát   triển   nguồn   gen   của nồng độ chất khử trùng javen và thời gian. <br /> P.   fruticosa  ở   miền   Đông   Nam   Bộ  [16]  và  Dùng cồn 70% ngâm mẫu trong 1 phút để  khử <br /> bước đầu xây dựng  quy trình nhân giống in   trùng  sơ   bộ,  rửa   lại mẫu bằng  nước  cất  vô  <br /> vitro   trùng   3   lần,   sau   đó   dùng   javen   với   nồng   độ <br /> P. fruticosa [6].  khảo   sát   để   khử   trùng   sạch   trong   thời   gian <br /> Nuôi cấy mô in vitro nhằm mục tiêu bảo  khảo sát. Có bổ  sung 3­4 giọt tween 80% để <br /> tồn, cải thiện chất lượng và phát triển các loài  tăng độ bám dính chất khử trùng mẫu, tiếp tục <br /> dược liệu mang lại hiệu quả  thiết thực [19].   rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng. <br /> Trong đó, kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ in vitro [1, 4,  Các mẫu lá sau khi khử trùng sẽ được cắt thành <br /> 7, 10], giúp tạo nguồn nguyên liệu vô tận sản   những đoạn nhỏ có kích thước khoảng 0,5 × 1 <br /> xuất   saponin   [8,   18],   không   phụ   thuộc   điều  cm, sau đó nuôi cấy trên môi trường thạch. Sau  <br /> kiện thời tiết, khí hậu môi trường, giảm chi   2 tuần, quan sát và ghi nhận kết quả. Nước  <br /> phí và nguồn lực đầu tư, là một trong những   javen có nồng độ  (50% và 100%) và thời gian <br /> phương pháp lý tưởng, có tiềm năng ứng dụng   khử trùng mẫu (10, 15, 20 phút).<br /> rất lớn cho sản xuất các hoạt chất thứ cấp có    Thí nghiệm 2:  Ảnh hưởng của 2,4­D và <br /> trong nhiều loại thực vật [5, 20, 22]. NAA đến quá trình tạo rễ  tơ  in vitro lá đinh <br /> lăng: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ 2,4­<br /> VÂT LI<br /> ̣ ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯU<br /> ́<br /> D và NAA đến quá trình tạo rễ tơ in vitro cây <br /> Vật   liệu  là  cây   Đinh   lăng   (Polyscias  đinh lăng. Môi trường MS mới có bổ sung 2,4­<br /> fruticosa)   một   năm   tuổi,   được   thu   thập   tại  D (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l), NAA (0,5; 1,0; 1,5; <br /> quận 12, tp. Hồ Chí Minh. Mô lá non được sử  2,0 mg/l).<br /> dụng làm mẫu nuôi cấy.   Thí   nghiệm   3:   Ảnh   hưởng   của   2,4­D,  <br />   Môi trường khoáng nuôi cấy MS [11] có  NAA và IBA đến quá trình tăng sinh rễ  tơ  in <br /> bổ   sung   2,4­D   (2,4­dichlorophenoxyacetic  vitro cây đinh lăng: Khảo sát nồng độ  tối  ưu <br /> <br /> 185<br /> nhất của 2,4D (0,3; 0,5; 1,0 mg/l), NAA (0,3;   thu   được   của   các   điểm   chuẩn,   lấy   tín   hiệu <br /> 0,5; 1,0 mg/l), IBA (0,3; 0,5; 1,0 mg/l) và có  diện   tích   mũi   sắc   ký   của   từng   điểm   chuẩn <br /> kết hợp Kinetin (1 mg/l) trong quá trình tăng  được các giá trị  S1, S2, S3, S4 và S5. Từ  đó,  <br /> sinh rễ tơ in vitro cây đinh lăng. dựng đường tuyến tính diện tích mũi sắc ký <br />   Thí nghiệm 4: Định lượng saponin trong  theo   nồng   độ   thu   được   hàm   số   bậc   nhất:  <br /> mẫu rễ  tơ: Định lượng saponin trong rễ  tơ   ở  y=ax+b. trong đó y là diện tích mũi, x là nồng <br /> thí nghiệm 3 bằng phương pháp HPLC. độ dung dịch chuẩn oleanoic đã biết từ sắc ký <br /> đồ  của các mẫu phân tích, lấy diện tích của <br /> Xác   định   hàm   lượng   saponin   bằng   phương   mũi sắc ký oleanoic acid được giá trị  S mẫu. <br /> pháp phân tích HPLC giá trị  S mẫu được áp vào đường tuyến tính  <br />   Chuẩn  bị   mẫu phân tich ́  Oleanolic  acid:  y=ax+b sẽ  thu được giá trị  nồng độ  oleanoic <br /> Cân 150 mg mẫu vào  ống COD, chiết siêu âm  acid trong mẫu.<br /> 4  lần   với   10   mL  ethylacetatat   chứa   1%   acid  <br /> formic.   Thổi   khô   ethyl   acetat.   Hòa   tan   phần  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> cặn   bằng   pha   động,   lọc   qua   màng   lọc   0,45 <br /> Ảnh hưởng của nồng  độ  chất  khử  trùng <br /> micro trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.<br /> javen   và   thời   gian   khử   trùng   mẫu   lá   cây <br />  Chuẩn bị  mẫu phân tich saponin t<br /> ́ ổng số:  <br /> Cân 150 mg mẫu vào bình cầu cổ nhám. Thêm  đinh lăng<br /> 50 mL nước nóng và ủ  tại 90oC trong 10 phút.  Với nồng độ  javen 50% và 100% trong 3  <br /> Thêm 7,5 mL HCl đậm đặc và đun hoàn lưu   khoảng thời gian 10 phút, 15 phút và 20 phút,  <br /> cách thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x   có tỷ  lệ  mẫu sống vô trùng cao. Với nồng độ <br /> 100  mL   dicloromethan.   Pha   dicloromethan   cô  javen 50% và thời gian khử trùng mẫu 10 phút <br /> quay tới gần cạn, phần còn lại được thổi khô  có tỉ  lệ mẫu chết 4,7% và tỷ  lệ  mẫu sống vô <br /> hoàn toàn bằng dòng khí N2. Hòa tan phần cặn  trùng là 96,3% đạt hiệu quả tốt nhất trong quá <br /> bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro  trình khử trùng mẫu so với các công thức khác <br /> trước khi tiêm. (bảng 1). Nồng độ  javen 50%, khử trùng mẫu <br /> trong 10 phút thích hợp cho khử  trùng mẫu lá <br />  Để định lượng saponin tổng số, các nhánh  cây  đinh  lăng.   Mẫu  được   nuôi   cấy  trên  môi <br /> đường gắn trên aglycone được thủy phân trong  trường MS không bổ  sung chất điều hòa sinh <br /> môi   trường   acid   để   chuyển   hết   về   dạng  trưởng.<br /> aglycone.  Do  đó,  saponin tổng số   được  định <br /> lượng thông qua oleanolic acid. Ảnh   hưởng   của   2,4­D   và   NAA   đến   quá <br /> trình tạo rễ tơ đinh lăng in vitro<br /> Quy trình HPLC phân tách và định lượng <br /> oleanolic acid và saponin Môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4­D <br /> thì không tạo rễ tơ, bổ sung NAA cho thấy có  <br /> Pha tĩnh:   cột   ACE3  C18  (4,6  × 150  mm, <br /> sự  hình thành rễ  tơ. Bổ  sung NAA 1 mg/l vào <br /> kích thước hạt 3,5 micro)<br /> môi trường nuôi cấy MS kích thích tạo rễ  tơ <br /> Pha   động:   đệm   triethylamine/   HCl   pH3   :  cao 0,322 g/cụm. Bổ  sung NAA có nồng độ <br /> MeOH tỷ lệ 10:90 v/v. 1,5 mg/l ­ 2 mg/l thì trọng lượng rễ tơ tạo ra ít. <br /> Tốc độ  dòng pha động 0,5 mL/phút; bước  Ở  nồng độ  NAA 0,5 mg/l ­ 1 mg/l thì trọng <br /> sóng 210 nm; nhiệt độ cột 20oC. lượng rễ  tạo ra tương đương nhau và nhiều <br /> Phương pháp tính toán hàm lượng oleanoic  hơn so với các công thức khác (bảng 2). Ở các <br /> acid và saponin tổng số  trong mẫu được thực  công   thức   có   bổ   sung   chất   điều   hòa   sinh <br /> hiện   theo   phương   pháp   ngoại   chuẩn:   Pha   5  trưởng 2,4­D cho thấy không có sự hình thành <br /> điểm chuẩn oleanoic acid các nồng độ C1, C2,  rễ  tơ  và mô sẹo được tạo ra mạnh mẻ. Môi  <br /> C3, C4 và C5. Sau đó tiến hành ghi tín hiệu  trường thích hợp nuôi cấy tạo rễ  tơ từ  lá cây <br /> sắc ký của các điểm chuẩn này. Từ sắc ký đồ  đinh lăng là môi trường MS + 1 mg/l NAA.<br /> <br /> <br /> 186<br /> Ảnh hưởng của 2,4­D, NAA và IBA đến  trường   MS   cho   trọng   lượng   rễ   tăng   sinh   là <br /> quá trình tăng sinh rễ tơ đinh lăng in vitro 2,018   g/cụm   (bảng   3).   Rễ   tơ   in   vitro   được <br /> nuôi cấy trong môi trường có bổ sung IBA tạo <br /> Trên môi trường nuôi cấy MS có bổ  sung  <br /> sợi rễ  mảnh và nhỏ  hơn so với rễ  tơ   được <br /> 2,4­D cho thấy không có sự tăng sinh rễ; riêng <br /> nuôi cấy trong môi trường có bổ  sung NAA. <br /> trên môi trường có bổ  sung NAA và IBA đều <br /> Môi trường kết hợp kinetin cho thấy không có <br /> có sự tăng sinh rễ tơ sau 4 tuần nuôi cấy. Trên  <br /> tác  động  đến quá  trình  tăng  sinh rễ  tơ.  Môi <br /> môi trường MS có bổ sung NAA cho tăng sinh <br /> trường thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh rễ  tơ <br /> rễ  tơ  nhiều hơn môi trường có bổ  sung IBA.  <br /> in vitro cây đinh lăng là môi trường MS + 0,5 <br /> Với nồng độ  NAA 0,5 mg/l bổ  sung vào môi  <br /> mg/l NAA.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng javen và thời gian khử trùng mẫu đến khả năng <br /> khử trùng mẫu lá cây đinh lăng<br /> Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu chết Tỷ lệ vô trùng<br /> 10 4,7 a 96,3 a<br /> Javen<br /> 15 20,4 b 79,6 b<br /> (50%)<br /> 20 16,4 b 83,6 b<br /> 10 20,3 c 79,7 c<br /> Javen<br /> 15 24,2 d 75,8 d<br /> (100%)<br /> 20 48,6 e 51,4 e<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của 2,4­D và NAA đến quá trình tạo rễ tơ đinh lăng<br /> Nồng độ chất ĐHST ngoại sinh (mg/l) Trọng lượng tươi rễ tơ (g/cụm)<br /> NAA 0,5 0,309 b<br /> NAA 1,0 0,322 a<br /> NAA 1,5 0,296 c<br /> NAA 2,0 0,263 d<br /> <br /> Bảng 3. Ảnh hưởng của NAA, IBA và 2,4­D đến quá trình tăng sinh rễ tơ đinh lăng<br /> Nồng độ chất ĐHST ngoại sinh (mg/l) Trọng lượng tươi rễ tơ (g/cụm)<br /> NAA 0,3 1,977 b <br /> NAA 0,5 2,018 a <br /> NAA 1,0 1,985 b <br /> NAA 0,3 + KI 1,0 1,979 b <br /> NAA 0,5 + KI 1,0 1,988 b <br /> NAA 1,0 + KI 1,0 1,965 c <br /> IBA 0,3 1,808 g <br /> IBA 0,5 1,854 e <br /> IBA 1,0 1,864 d <br /> IBA 0,3 + KI 1,0 1,803 g <br /> IBA 0,5 + KI 1,0 1,823 f <br /> IBA 1,0 + KI 1,0 1,857 d <br /> Các số liệu được theo sau bởi các ký tự khác nhau rất có ý nghĩa khác biệt với độ tin cậy 95%.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 187<br />  Hình 1. Định lượng oleanolic acid và saponin trong mẫu rễ tơ tăng sinhbằng HPLC<br /> Định lượng saponin trong mẫu rễ tơ 4. Fukui H., Hasan A. F. M. F., Ueoka T., Kyo <br /> Phân tích định lượng bằng HPLC cho thấy  M., 1998. Formation and secretion of a new <br /> hàm lượng oleanolic acid 40,1 µg/g và saponin  brown benzoquinone by hairy root cultures <br /> 396,2 µg/g tích lũy trong mẫu rễ tơ (hình 1). of  Lithospermum   erythrorhizon. <br /> Phytochemistry, 47: 1037­1039.<br /> KẾT LUẬN 5. Gupta S. K., Kuo C. L., Chang H. C., Chan <br /> Nồng độ  khử  trùng mẫu lá đinh lăng thực  H. S., Chen E. C. F., Chueh F. S., Tsay H. <br /> sinh   thích   hợp   là   dung   dịch   javen   nồng   độ  S.,   2012.   In   vitro   propagation   and <br /> 50%, trong 10 phút. Môi trường MS bổ sung 1  approaches   for   metabolites   production   in <br /> mg/l NAA thích hợp cho nuôi cấy mô lá tạo rễ  medicinal   plants.   Advances   in   Botanical <br /> tơ.   Sự   tăng   sinh   rễ   tơ   mạnh   mẽ   trên   môi   Research, 62: 49­55.<br /> trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA. Rễ tơ in   6. Hà Bích Hồng, Vũ Thị Thơm, Vũ Đức Lợi,  <br /> vitro tạo ra từ  môi trường nuôi cấy tăng sinh  Lê Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Hải, 2013. <br /> có   chứa   hợp   chất   oleanic   acid   40,1   µg/g   và  Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống <br /> saponin 396 µg/g tích lũy. in   vitro   cây  Đinh   lăng  lá   nhỏ   (Polyscias <br /> fruticosa  L.   Harms).   Tạp   chí   Dược   học, <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO 450(10): 25­30.<br /> 1. Asada   Y.,   Li   W.,   Yoshikawa   T.,   1998.  7. Jung K. H., Kwak S. S., Choi C. Y., Liu J. <br /> Isoprenylated   flavonoids   from   hairy   root  R., 1994. Development of two stage culture <br /> cultures   of  Glycyrrhia   glabra.  process   by   optimization   of   inorganic   salts <br /> Phytochemistry, 47: 389­392. for   improving   catharanthine   production   in <br /> hairy root cultures of  Catharanthus roseus.  <br /> 2. Chử  Thị  Thanh Huyền, Nguyễn Thị  Kiều <br /> J   Fermentation  and  Bioengineering,   77(1): <br /> Anh, Trịnh Thị  Nhung, Nguyễn Huy Văn, <br /> 57­61.<br /> Lâm   Thị   Bích   Hồng,   2012.  Nghiên   cứu <br /> định   lượng   acid   oleanolic   trong   cao   khô  8. Kwon B. M., Ro S. H., Kim M. K., Nam J. <br /> đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao .  Y., Jung H. J., Lee I. R., Kim Y. K., Bok S. <br /> Tạp chí Dược học, 457(10): 34­38 25­30  H.,   1997.  Polyacetylene   analogs   isolated <br /> from hairy roots of  Panax ginseng, inhibit <br /> 3. Đỗ  Huy Bích và nnk, 2004. Cây thuốc và <br /> acyl­CoA­cholesterol.  Planta   Medica,  63: <br /> động vật làm thuốc. Nxb. Khoa học và Kỹ <br /> 552­553.<br /> Thuật, Hà Nội. Trang 793­796.<br /> <br /> <br /> <br /> 188<br /> 9. LaCaille­Dubois M. A., Wagner H., 1996. A  16. Nguyễn   Thị   Ngọc   Trâm,   Nguyễn   Văn <br /> review   of   the   biological   and  Thiện,   Hoàng   Tuyết   Minh,   Phạm   Thị <br /> pharmacological   activities   of   saponins.  Thùy, 2014.  Nghiên cứu phát triển nguồn <br /> Phytomedicine, 2(4): 363­386. gen cây đinh lăng lá nhỏ Polyscias fruticosa <br /> (L.) Harms  ở miền Đông Nam Bộ. Tạp chí <br /> 10. Liu C. Z., Wang Y. C., Ouyang F., Ye  <br /> Dược học, 462(10): 30­35. <br /> H.   C., Li   G.   F.,   1997.   Production   of <br /> artemisinin   by   hairy   root   cultures   of  17. Phạm Hoàng Hộ, 2003. Cây cỏ Việt Nam, <br /> Artemisia annua  L.  Biotechnology Letters,  quyển II. Nxb Trẻ, trang 668.<br /> <br /> 18. Routa G. R., Samantarayb S., Dasa P., <br /> 19(9): 927­929.<br /> 11. Murashige   T.,   Skoog   R.,   1962.   A   revised <br /> medium   for   rapid   growth   and   bioassays  2000. In vitro manipulation and propagation <br /> with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant.,  of   medicinal   plants.  Biotechnology <br /> (15): 431­497. Advances, 18: 91­120.<br /> 12. Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích,  19. Shahzad  A.,  Sahai  A.,  2013.  In   vitro <br /> Nguyễn Thới Nhâm, 2001. Tác dụng dược  conservation protocols for some endangered <br /> lý cao toàn phần chiết xuất từ rễ và lá đinh   medicinal­plant.  Recent   Trends   in <br /> lăng   (Polyscias   fruticosa  L.Harms  Biotechnology   and   Therapeutic <br /> Araliacea). Công trình nghiên cứu khoa học  Applications   of   Medicinal   Plants,   pp305­<br /> 1987­2000 Viện dược liệu, Nxb. Khoa học  321. <br /> và Kỹ thuật. Trang 241­244. 20. Shanks J. V., Morgan J., 1999. Plant ‘hairy <br /> 13. Nguyễn   Kim   Phi   Phụng,   2007.   Phương   root’   culture.   Current   Opinion   in <br /> pháp  cô   lập  hợp   chất   hữu  cơ.   Nxb.   Đại  Biotechnology, 10: 151­155.<br /> học quốc gia, tp Hồ Chí Minh, trang 137. 21. Trần  Công  Luận,   1996.   Phân   lập  và   xác <br /> 14. Nguyêñ   Thị   Mai   Phương,   Trinh<br /> ̣   Tât́  định cấu trúc hợp chất polyacetylen trong <br /> Cương,̀  Trân Thi<br /> ̀ ̣  Nhung, Dương  Thi Nu, ̣ ̣  lá đinh lăng (Polyscias Fruticosa L. Hamrs, <br /> ̣   Ngoc̣   Quang,  2013.  Xây   dựng   mô <br /> Đăng Alariaceae). Trung tâm nghiên cứu sâm và <br /> hinh<br /> ̀   sang̀   loc̣   chât́   khang<br /> ́   viêm   thông   qua  dược liệu thành phố Hồ Chí Minh.<br /> ̣ ̉<br /> thu thê toll like 4 (TLR4) trên mang tê bao ̀ ́ ̀  22. Toivonen L., 1993. Utilization of hairy <br /> macrophage   chuôṭ .   Tạp   chí   Dược   học,  root   cultures   for   production   of   secondary <br /> 443(3): 5­10. metabolites.  Biotechnology Progress, 9(1): <br /> 15. Nguyễn   Thị   Ngọc   Trâm,  Đặng   Trọng  12­20.<br /> Lương, 2014. Nghiên cứu đa hình di truyền  23. Võ   Duy   Huấn,  Yamamura  S.,   Ohtani   K., <br /> tập   đoàn   các   giống  Đinh   lăng  (Polyscias  Kasai   R.,   Yamasaki   K.,   Nguyễn   Thới  <br /> fruticosa  L. Harms) có  ở  Việt Nam bằng  Nhâm, Hoàng Minh Châu, 1998. Oleanane <br /> kỹ   thuật   RAPD.   Tạp   chí   Dược   học,  saponins   from  Polyscias   fruticosa. <br /> 457(5): 25­30. Phytochemistry, 47(3): 451­457.<br /> <br /> CULTIVATION OF LEAF­TISSUE OF Polyscias fruticosa (L.) Harms <br /> FOR QUANTITY OF SAPONIN ACCUMULATION<br /> <br /> Nguyen Trung Hau1, Le Thi Nhu Thao2, Tran Van Minh3<br /> University of Industry HCM<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> University of Agriculture and Forestry HCM <br /> <br /> <br /> 189<br />  3<br /> International University, VNU­HCM<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Polyscias fruticosa (L.) Harms is the medicinal plant, popularly cultivated in south­east asia and using as  <br /> functional­foods.  Besides  of  plantlets  micropropagation  for   area   development,  hairy­root  culture   was  the <br /> techniques manipulated for saponin accumulation. The leaves of young Dinh lang 1­year trees were used as  <br /> culture materials. Sterilisation with javel water diluted to 50% in 10 minutes gave good results. MS medium  <br /> supplemented   with   1   mg/l   NAA   was   favored   for   hairy­root   induction   from   leaves   tissue   cultivation. <br /> Treatments with 2.4­D showed that hairy­root was not performed and induced callus strongly. Hairy­root was  <br /> proliferation strongly in the MS medium supplemented with 0.5 mg/l NAA. Hairy­root cultivated on medium <br /> supplemented with IBA was weakly and thin in comparison with NAA. Kinetin was not affected on hairy­<br /> root proliferation. Quantity of oleanolic acid and saponin in proliferated hairy­root by HPLC method to show  <br /> oleanolic acid 40,1 µg/g and saponin 396,2 µg/g accumulation. <br /> Keywords: Polyscias fruticosa, accumulation, hairy­root, proliferation, saponin.<br /> <br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 190<br />