intTypePromotion=3

Phá vỡ escherischia coli tái tổ hợp bằng Lysozym để phân tích các enzym được biểu hiện

Chia sẻ: Văng Thị Bảo Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

0
30
lượt xem
2
download

Phá vỡ escherischia coli tái tổ hợp bằng Lysozym để phân tích các enzym được biểu hiện

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Phá vỡ escherischia coli tái tổ hợp bằng Lysozym để phân tích các enzym được biểu hiện trình bày việc thu thập protein tái tổ hợp sau khi biến nạp vào Escherichia coli, nhất là những protein có hoạt tính enzym, đòi hỏi một phương pháp phá vỡ tế bào hợp lý để hoạt tính enzym được bảo toàn. Nghiên cứu nhằm sử dụng lysozim để phá vỡ Escherichia coli,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Phá vỡ escherischia coli tái tổ hợp bằng Lysozym để phân tích các enzym được biểu hiện

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> PHÁ VỠ ESCHERISCHIA COLI TÁI TỔ HỢP BẰNG LYSOZYM<br /> ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC ENZYM ĐƯỢC BIỂU HIỆN<br /> Lê Thị Kim Tuyến1, Bạch Khánh Hòa2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Thăng Long, 2Trường Đại học Y Hà Nội<br /> <br /> Việc thu thập protein tái tổ hợp sau khi biến nạp vào Escherichia coli, nhất là những protein có hoạt tính<br /> enzym, đòi hỏi một phương pháp phá vỡ tế bào hợp lý để hoạt tính enzym được bảo toàn. Nghiên cứu nhằm<br /> sử dụng lysozim để phá vỡ Escherichia coli. Phương pháp nghiên cứu: chủng tế bào ER 3081 được biến<br /> nạp với pSAPV6 tái tổ hợp chứa gen enzim hạn chế của chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931.<br /> Lysozim được dùng để phá vỡ tế bào ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau và đồng thời hoạt tính enzym<br /> hạn chế được kiểm tra. Kết quả cho thấy phương pháp sử dụng lysozim để phá vỡ vi khuẩn cho phép thu<br /> thập enzim hạn chế tái tổ hợp giữ hoạt tính cao.<br /> Từ khóa: Phá vỡ tế bào - Escherichia coli, protein tái tổ hợp, nguyên sinh chất, lysozim<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> không quá 40°C hoặc một số hóa chất thích<br /> <br /> được sử dụng khi nghiên cứu các thành phần<br /> <br /> hợp. Những phương pháp thường được dùng<br /> như siêu âm, nghiền nát, áp lực cao đã được<br /> <br /> của sinh tổng hợp tế bào. Gần đây, với sự phát<br /> triển ngành sinh học phân tử, vi khuẩn này còn<br /> <br /> nhiều tác giả nghiên cứu so sánh với nhau [1].<br /> Việc dùng máy móc thường tạo ra hiệu lực rất<br /> <br /> được dùng làm tế bào chủ cho các plasmit tái<br /> tổ hợp trong phương pháp clon gen. Phương<br /> <br /> cao để vỡ màng tế bào nhưng cũng ảnh<br /> <br /> Trong lịch sử, Escherichia coli thường<br /> <br /> pháp này rất cần thiết cho việc sản xuất các<br /> loại protein ứng dụng trong nghiên cứu và<br /> <br /> hưởng không ít đến sự nguyên vẹn của các<br /> protein được giải phóng. Mặt khác, các vách<br /> <br /> nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội [2]. Việc<br /> <br /> tế bào vi khuẩn chứa một lớp peptidoglycan<br /> và lysozim là một enzim có chức năng phân<br /> <br /> nghiên cứu các protein trong nguyên sinh chất<br /> của Escherichia coli đòi hỏi trải qua giai đoạn<br /> <br /> hủy đặc hiệu peptidoglycan, do vậy nó có vai<br /> trò làm phá vỡ các vi khuẩn. Tuy nhiên, pepti-<br /> <br /> phá vỡ tế bào vi khuẩn. Có rất nhiều phương<br /> pháp vật lý đã được dùng như nghiền nát,<br /> <br /> doglycan là thành phần chính của vách tế bào<br /> <br /> siêu âm hoặc nhiệt độ cao để làm vỡ cả màng<br /> <br /> ở vi khuẩn Gram + trong khi ở vi khuẩn Gram trong đó có Escherichia coli, lớp peptidoglycan<br /> <br /> và vách tế bào. Có phương pháp sử dụng<br /> chất hóa học như dùng hóa chất kiềm. Vấn đề<br /> <br /> mỏng và còn bị bao phủ bằng một lớp màng<br /> bên ngoài [3]. Sử dụng phương pháp enzym<br /> <br /> đặt ra là lựa chọn một phương pháp phù hợp<br /> nhằm bảo vệ được hoạt tính cao của những<br /> <br /> để phá vỡ vi khuẩn là tốt nhất để giữ nguyên<br /> vẹn các protein trong nguyên sinh chất, thêm<br /> <br /> protein dễ bị thoái hóa. Điều đó có nghĩa là<br /> phương pháp này chỉ sử dụng với nhiệt độ<br /> <br /> nữa không đòi hỏi máy móc.<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Bạch Khánh Hòa, bộ môn Huyết học Truyền máu, trường Đại học Y Hà Nội,<br /> Email: hoa17med@gmail.com<br /> Ngày nhận: 08/01/2013<br /> Ngày được chấp thuận: 20/6/2013<br /> <br /> 8<br /> <br /> Đã có một quy trình sử dụng lyzozim<br /> ở nhiệt độ cao 100ºC để phá vi khuẩn<br /> Escherichia coli trong quá trình tách chiết ADN<br /> [4]. Tuy nhiên, quy trình này không áp dụng<br /> được cho việc nghiên cứu protein vì nhiệt độ<br /> cao làm thoái hóa và mất hoạt tính protein. Vì<br /> lý do đó, chúng tôi nghiên cứu sử dụng<br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> lysozim để phá vỡ vi khuẩn Escherichia coli ở<br /> <br /> mM EDTA, 3,3mM Tris HCl pH8, 0,017% SDS<br /> <br /> nhiệt độ ≤ 40°C nhằm bảo vệ được hoạt tính<br /> protein. Quy trình này áp dụng cho việc phân<br /> <br /> và 0,015% bromophenol blue). Sản phẩm<br /> phản ứng được phân tích trên gel 1% agarose<br /> <br /> tích các enzym tái tổ hợp được biểu hiện<br /> trong nguyên sinh chất.<br /> <br /> cùng với các thang ADN chuẩn lambda - Hind<br /> III và PhiX174 - HaeIII hoặc lambda - BstEII và<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> pBR322 - MspI [5]. Các gel được chụp với<br /> máy ảnh Canon 50D theo phương pháp của<br /> <br /> 1.<br /> <br /> Chủng vi khuẩn<br /> <br /> Sử dụng chủng tế bào ER 3081 (F-λ- fhuA2<br /> lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal attB::(pCD13lysY, lacIq) sulA11 R(mcr-73::miniTn10-TetS)2<br /> [dcm] R(zgb- 210::Tn10 –TetS) endA1 D<br /> <br /> Porch T. và Erpelding J.E [6].<br /> 4. Tinh chế enzim trên cột HeparineSepharose 6B (Pharmacia)<br /> Nguyên sinh chất được tinh chế qua 1ml<br /> cột Heparine-Sepharose 6B đã cân bằng với<br /> <br /> (mcrC-mrr)114::IS10). Chủng này được biến<br /> nạp với pSAPV6 [6] tái tổ hợp chứa gen<br /> <br /> dung dịch đệm phá tế bào có thêm 0,05 M<br /> <br /> enzym hạn chế của chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931.<br /> <br /> đệm phá tế bào chứa 0,05 M NaCl trước khi<br /> <br /> NaCl. Cột được rửa 5 lần với 1ml dung dịch<br /> tiến hành loại enzim bằng 10 ml gradient NaCl<br /> <br /> 2. Phá tế bào<br /> <br /> 0,1 - 0,9M trong đệm phá tế bào. Thể tích mỗi<br /> <br /> 30 ml huyền dịch tế bào nuôi cấy trong môi<br /> <br /> phân đoạn thu được là 0,3 ml.<br /> <br /> trường LB + Amp ở 37°C qua đêm được ly<br /> tâm trong tuyp Falcon 5', với tốc độ 8000 rpm.<br /> Cặn tế bào được hòa tan trong 1,5ml dung<br /> dịch đệm phá tế bào (20 mM Tris, 1mM DTT,<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Quán sát sự phá vỡ E. coli<br /> Hình<br /> <br /> 1<br /> <br /> cho<br /> <br /> thấy hỗn<br /> <br /> dịch<br /> <br /> tế<br /> <br /> bào<br /> <br /> 0,1 mM EDTA). Nhiều nồng độ tế bào được<br /> hòa loãng từ 1/1, 1/2, 1/4 và 1/8. Thêm tuần<br /> <br /> Escherichia coli trong dần sau khi được xử lý<br /> <br /> tự vào các ống 20, 10, 5 và 2,5 µl dung dịch<br /> lysozim 10 mg/ml (Sigma) để có một tỷ lệ<br /> <br /> của tế bào bị phân hủy dẫn đến tế bào vi khuẩn<br /> <br /> tương đương giữa tế bào/lysozim. Ủ 1 giờ ở<br /> 4°C. Ly tâm 5' ở 12.000v/p ở 4°C.<br /> 3. Phản ứng cắt ADN hạn chế<br /> Hoạt tính của enzim hạn chế được thử ở<br /> nhiều độ pha loãng của nước nổi bậc 3 (9, 3,<br /> <br /> bằng lysozim. Điều này chứng tỏ peptidoglycan<br /> bị phá vỡ, làm giảm độ đục của hỗn dịch.<br /> Cũng có thể quan sát tế bào Escherichia<br /> coli bị phá vỡ bằng lysozim sau khi ly tâm ở<br /> hình 2.<br /> 1: Escherichia coli chứng cho thấy vi khuẩn<br /> <br /> 1, 1/3 µl) trong đệm phản ứng (NEBuffer 4: 20<br /> mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium<br /> <br /> không bị phá vỡ, cặn lắng đẹp; 2: vi khuẩn<br /> tươi (mới thu hoạch sau khi nuôi cấy); 3: vi<br /> <br /> acetate, 50 mM potassium acetate, 1 mM<br /> <br /> khuẩn đông lạnh ở - 30°C, 4 vi khuẩn biến nạp<br /> <br /> DTT, 100 µg/ml BSA và 80 µM AdoMet) với 1<br /> <br /> với plasmid tái tổ hợp mang enzim hạn chế<br /> <br /> μg cơ chất ADN (pAdeBsaBI) cho mỗi 50 μl<br /> <br /> bảo quản ở - 30°C, cho thấy hiệu quả phá vỡ<br /> <br /> thể tích phản ứng. Ủ 20 phút ở 37°C. Dừng<br /> <br /> tế bào khác nhau tùy theo tình trạng tế bào.<br /> <br /> phản ứng với đệm Gel Loading Dye, Blue của<br /> <br /> Tế bào vỡ càng nhiều thì thể tích cặn tế bào<br /> càng lớn và màu nước nổi càng đậm.<br /> <br /> New England Biolabs (2,5% Ficoll - 400, 11<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> Hình 1. Sự phá vỡ E. coli với lysozim<br /> 1: Hỗn dịch vi khuẩn chứng<br /> 2: Hỗn dịch vi khuẩn cho thêm lysozim<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> Hình 2. Sự phá vỡ E. coli với lysozim sau ly tâm<br /> 1: E. coli chứng<br /> 2: vi khuẩn tươi<br /> 3: vi khuẩn đông lạnh ở - 30°C<br /> 4: vi khuẩn biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang enzym hạn chế đông lạnh<br /> 2. Ảnh hưởng của nồng độ tế bào<br /> Hình 3: Phá vỡ Escherichia coli bằng cách<br /> sử dụng một tỷ lệ lysozim/số tế bào tương<br /> ứng, 4 nồng độ 1/1, 1/2, 1/4 và 1/8.<br /> <br /> Bảng 1 cho thấy, ở độ pha loãng tế bào<br /> 1/8, sự phá vỡ cao nhất, gần gấp 3 lần tế bào<br /> không pha loãng.<br /> Theo kết quả trên hình 3, có thể cho rằng<br /> <br /> Hiệu quả sự phá vỡ này được phân tích<br /> khi đo nồng độ endonucleasa trong nguyên<br /> <br /> 3µl nguyên sinh chất của nồng độ tế bào 1/1 là<br /> thể tích chứa đựng 1U endonucleasa. Trên cơ<br /> <br /> sinh chất bằng kỹ thuật bán định lượng. Nếu<br /> cho rằng 1U enzym là đơn vị cho phép thủy<br /> <br /> sở đó, có thể suy ra số đơn vị endonucleasa<br /> trong nguyên sinh chất tế bào vỡ ở nồng độ<br /> <br /> phân hoàn toàn lượng ADN chuẩn đang<br /> dùng, thì có thể ước lượng số đơn vị<br /> <br /> tiếp theo.<br /> <br /> endonucleasa có được ở các nồng độ tế bào.<br /> <br /> còn có sự hoạt động của các endonucleasa vi<br /> <br /> 10<br /> <br /> Lưu ý: bên cạnh enzym hạn chế tái tổ hợp<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> khuẩn, vì thế hình vạch ADN hạn chế không được thấy rõ.<br /> Bảng 1. Ước lượng endonucleasa trong nguyên sinh chất<br /> các tế bào vỡ bằng lysozim tùy theo nồng độ tế bào<br /> Nồng độ tế bào<br /> <br /> 1U<br /> <br /> U/ml<br /> <br /> 1/1<br /> <br /> 3 ml<br /> <br /> 333<br /> <br /> 1/2<br /> <br /> 6 ml<br /> <br /> 333<br /> <br /> 1/4<br /> <br /> 12 ml<br /> <br /> 666<br /> <br /> 1/8<br /> <br /> 9 ml<br /> <br /> 888<br /> <br /> Hình 3. Hoạt tính endonucleasa trong 9, 3, 1, 1/3 ml nguyên sinh chất<br /> 1 - 4: nồng độ tế bào 1/1;<br /> 6 - 9: nồng độ tế bào 1/2;<br /> 11 - 14: nồng độ tế bào 1/4;<br /> 16 - 19: nồng độ tế bào 1/8;<br /> 5, 10, 15 và 20: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III.<br /> 3. Quan sát enzym hạn chế tái tổ hợp<br /> Để xem hoạt động enzym hạn chế tái tổ hợp, nguyên sinh chất của hỗn hợp vi khuẩn ở độ<br /> pha loãng 1/1 được đưa qua cột heparine - sepharose. Hình 4: Enzym hạn chế tái tổ hợp nhiều<br /> nhất ở phân đoạn 15 - 16 và mức độ hoạt tính này đã cho phép xác định tính đặc hiệu của enzym.<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> Hình 4. Endonucleasa tái tổ hợp trong các phân đoạn<br /> sau khi qua cột heparin - sepharose<br /> 2 - 7: phân đoạn 3, 5, 7, 9, 10, 11;<br /> 9 - 16: phân đoạn 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19;<br /> 18 - 24: phân đoạn 20, 21, 23, 25, 27, 29, 31;<br /> 1, 8, 17 và 25: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Sự phá vỡ Escherichia coli với lysozim sau<br /> <br /> (ống nghiệm số 4) thì hiệu quả phá vỡ cao<br /> <br /> ly tâm được quan sát rõ ở hình 2. Ống nghiệm<br /> <br /> nhất. Thật ra, sự biểu hiện của enzym hạn chế<br /> tái tổ hợp đã gây hiện tượng hủy hoại vật chủ<br /> <br /> số 1, vi khuẩn không bị phá vỡ, có cặn tủa<br /> gọn gàng ở dưới đáy ống nghiệm với thể tích<br /> <br /> và do vậy tế bào dễ vỡ hơn. Theo lý thuyết,<br /> Escherichia coli là vi khuẩn Gram - có thành<br /> <br /> nhỏ nhất . Ống nghiệm số 2, vi khuẩn bị phá<br /> vỡ sẽ phồng lên và không đủ độ nặng để lắng<br /> <br /> phần murein ít hơn Gram + và có thêm lớp<br /> màng tế bào bao quanh, do đó có thể suy nghĩ<br /> <br /> dưới đáy ống nghiệm nữa mặc dù cùng tốc độ<br /> ly tâm. Thêm nữa, nước nổi có sự thay đổi<br /> <br /> rằng sự phá vỡ vi khuẩn này không hiệu quả.<br /> <br /> màu, càng nhiều tế bào vỡ màu càng đậm. Khi<br /> hỗn dịch Escherichia coli bị đông lạnh ở -30°C<br /> (ống nghiệm số 3), tủa tế bào phồng lên hơn<br /> so với vi khuẩn được thu hoạch tươi chứng tỏ<br /> <br /> Tuy nhiên, kết quả cho thấy có sự phá vỡ tế<br /> bào trong điều kiện thí nghiệm được thiết lập.<br /> Khi kết hợp việc đông lạnh vi khuẩn trước khi<br /> xử lý bằng lysozim, việc phá vỡ tế bào hiệu<br /> quả hơn.<br /> Ở độ pha loãng tế bào 1/8, hiệu quả phá<br /> <br /> vi khuẩn bị phá vỡ nhiều hơn. Điều này được<br /> giải thích như sau: khi đông lạnh (cũng là tác<br /> <br /> vỡ đạt cao nhất, gần gấp 3 lần tế bào không<br /> <br /> động vật lý) gây ra sự phá hủy màng tế bào<br /> bằng cách tách rời các phân tử cấu trúc ra<br /> <br /> pha loãng (bảng 1). Điều này cần lưu ý khi<br /> muốn thu lại nhiều sản phẩm. Nhưng cần phải<br /> <br /> khỏi nhau. Trong khi dùng Escherichia coli đã<br /> biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang gen enzym<br /> <br /> thao tác với thể tích hỗn hợp tối thiểu nhiều<br /> hơn 8 lần so với thể tích ban đầu. Tuy nhiên,<br /> <br /> hạn chế và bị đông lạnh trước khi dùng lysozim<br /> <br /> đối với việc phân tích tính chất enzym, số<br /> <br /> 12<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản