Phá vỡ escherischia coli tái tổ hợp bằng Lysozym để phân tích các enzym được biểu hiện

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> PHÁ VỠ ESCHERISCHIA COLI TÁI TỔ HỢP BẰNG LYSOZYM<br /> ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC ENZYM ĐƯỢC BIỂU HIỆN<br /> Lê Thị Kim Tuyến1, Bạch Khánh Hòa2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Thăng Long, 2Trường Đại học Y Hà Nội<br /> <br /> Việc thu thập protein tái tổ hợp sau khi biến nạp vào Escherichia coli, nhất là những protein có hoạt tính<br /> enzym, đòi hỏi một phương pháp phá vỡ tế bào hợp lý để hoạt tính enzym được bảo toàn. Nghiên cứu nhằm<br /> sử dụng lysozim để phá vỡ Escherichia coli. Phương pháp nghiên cứu: chủng tế bào ER 3081 được biến<br /> nạp với pSAPV6 tái tổ hợp chứa gen enzim hạn chế của chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931.<br /> Lysozim được dùng để phá vỡ tế bào ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau và đồng thời hoạt tính enzym<br /> hạn chế được kiểm tra. Kết quả cho thấy phương pháp sử dụng lysozim để phá vỡ vi khuẩn cho phép thu<br /> thập enzim hạn chế tái tổ hợp giữ hoạt tính cao.<br /> Từ khóa: Phá vỡ tế bào - Escherichia coli, protein tái tổ hợp, nguyên sinh chất, lysozim<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> không quá 40°C hoặc một số hóa chất thích<br /> <br /> được sử dụng khi nghiên cứu các thành phần<br /> <br /> hợp. Những phương pháp thường được dùng<br /> như siêu âm, nghiền nát, áp lực cao đã được<br /> <br /> của sinh tổng hợp tế bào. Gần đây, với sự phát<br /> triển ngành sinh học phân tử, vi khuẩn này còn<br /> <br /> nhiều tác giả nghiên cứu so sánh với nhau [1].<br /> Việc dùng máy móc thường tạo ra hiệu lực rất<br /> <br /> được dùng làm tế bào chủ cho các plasmit tái<br /> tổ hợp trong phương pháp clon gen. Phương<br /> <br /> cao để vỡ màng tế bào nhưng cũng ảnh<br /> <br /> Trong lịch sử, Escherichia coli thường<br /> <br /> pháp này rất cần thiết cho việc sản xuất các<br /> loại protein ứng dụng trong nghiên cứu và<br /> <br /> hưởng không ít đến sự nguyên vẹn của các<br /> protein được giải phóng. Mặt khác, các vách<br /> <br /> nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội [2]. Việc<br /> <br /> tế bào vi khuẩn chứa một lớp peptidoglycan<br /> và lysozim là một enzim có chức năng phân<br /> <br /> nghiên cứu các protein trong nguyên sinh chất<br /> của Escherichia coli đòi hỏi trải qua giai đoạn<br /> <br /> hủy đặc hiệu peptidoglycan, do vậy nó có vai<br /> trò làm phá vỡ các vi khuẩn. Tuy nhiên, pepti-<br /> <br /> phá vỡ tế bào vi khuẩn. Có rất nhiều phương<br /> pháp vật lý đã được dùng như nghiền nát,<br /> <br /> doglycan là thành phần chính của vách tế bào<br /> <br /> siêu âm hoặc nhiệt độ cao để làm vỡ cả màng<br /> <br /> ở vi khuẩn Gram + trong khi ở vi khuẩn Gram trong đó có Escherichia coli, lớp peptidoglycan<br /> <br /> và vách tế bào. Có phương pháp sử dụng<br /> chất hóa học như dùng hóa chất kiềm. Vấn đề<br /> <br /> mỏng và còn bị bao phủ bằng một lớp màng<br /> bên ngoài [3]. Sử dụng phương pháp enzym<br /> <br /> đặt ra là lựa chọn một phương pháp phù hợp<br /> nhằm bảo vệ được hoạt tính cao của những<br /> <br /> để phá vỡ vi khuẩn là tốt nhất để giữ nguyên<br /> vẹn các protein trong nguyên sinh chất, thêm<br /> <br /> protein dễ bị thoái hóa. Điều đó có nghĩa là<br /> phương pháp này chỉ sử dụng với nhiệt độ<br /> <br /> nữa không đòi hỏi máy móc.<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Bạch Khánh Hòa, bộ môn Huyết học Truyền máu, trường Đại học Y Hà Nội,<br /> Email: hoa17med@gmail.com<br /> Ngày nhận: 08/01/2013<br /> Ngày được chấp thuận: 20/6/2013<br /> <br /> 8<br /> <br /> Đã có một quy trình sử dụng lyzozim<br /> ở nhiệt độ cao 100ºC để phá vi khuẩn<br /> Escherichia coli trong quá trình tách chiết ADN<br /> [4]. Tuy nhiên, quy trình này không áp dụng<br /> được cho việc nghiên cứu protein vì nhiệt độ<br /> cao làm thoái hóa và mất hoạt tính protein. Vì<br /> lý do đó, chúng tôi nghiên cứu sử dụng<br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> lysozim để phá vỡ vi khuẩn Escherichia coli ở<br /> <br /> mM EDTA, 3,3mM Tris HCl pH8, 0,017% SDS<br /> <br /> nhiệt độ ≤ 40°C nhằm bảo vệ được hoạt tính<br /> protein. Quy trình này áp dụng cho việc phân<br /> <br /> và 0,015% bromophenol blue). Sản phẩm<br /> phản ứng được phân tích trên gel 1% agarose<br /> <br /> tích các enzym tái tổ hợp được biểu hiện<br /> trong nguyên sinh chất.<br /> <br /> cùng với các thang ADN chuẩn lambda - Hind<br /> III và PhiX174 - HaeIII hoặc lambda - BstEII và<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> pBR322 - MspI [5]. Các gel được chụp với<br /> máy ảnh Canon 50D theo phương pháp của<br /> <br /> 1.<br /> <br /> Chủng vi khuẩn<br /> <br /> Sử dụng chủng tế bào ER 3081 (F-λ- fhuA2<br /> lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal attB::(pCD13lysY, lacIq) sulA11 R(mcr-73::miniTn10-TetS)2<br /> [dcm] R(zgb- 210::Tn10 –TetS) endA1 D<br /> <br /> Porch T. và Erpelding J.E [6].<br /> 4. Tinh chế enzim trên cột HeparineSepharose 6B (Pharmacia)<br /> Nguyên sinh chất được tinh chế qua 1ml<br /> cột Heparine-Sepharose 6B đã cân bằng với<br /> <br /> (mcrC-mrr)114::IS10). Chủng này được biến<br /> nạp với pSAPV6 [6] tái tổ hợp chứa gen<br /> <br /> dung dịch đệm phá tế bào có thêm 0,05 M<br /> <br /> enzym hạn chế của chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931.<br /> <br /> đệm phá tế bào chứa 0,05 M NaCl trước khi<br /> <br /> NaCl. Cột được rửa 5 lần với 1ml dung dịch<br /> tiến hành loại enzim bằng 10 ml gradient NaCl<br /> <br /> 2. Phá tế bào<br /> <br /> 0,1 - 0,9M trong đệm phá tế bào. Thể tích mỗi<br /> <br /> 30 ml huyền dịch tế bào nuôi cấy trong môi<br /> <br /> phân đoạn thu được là 0,3 ml.<br /> <br /> trường LB + Amp ở 37°C qua đêm được ly<br /> tâm trong tuyp Falcon 5', với tốc độ 8000 rpm.<br /> Cặn tế bào được hòa tan trong 1,5ml dung<br /> dịch đệm phá tế bào (20 mM Tris, 1mM DTT,<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Quán sát sự phá vỡ E. coli<br /> Hình<br /> <br /> 1<br /> <br /> cho<br /> <br /> thấy hỗn<br /> <br /> dịch<br /> <br /> tế<br /> <br /> bào<br /> <br /> 0,1 mM EDTA). Nhiều nồng độ tế bào được<br /> hòa loãng từ 1/1, 1/2, 1/4 và 1/8. Thêm tuần<br /> <br /> Escherichia coli trong dần sau khi được xử lý<br /> <br /> tự vào các ống 20, 10, 5 và 2,5 µl dung dịch<br /> lysozim 10 mg/ml (Sigma) để có một tỷ lệ<br /> <br /> của tế bào bị phân hủy dẫn đến tế bào vi khuẩn<br /> <br /> tương đương giữa tế bào/lysozim. Ủ 1 giờ ở<br /> 4°C. Ly tâm 5' ở 12.000v/p ở 4°C.<br /> 3. Phản ứng cắt ADN hạn chế<br /> Hoạt tính của enzim hạn chế được thử ở<br /> nhiều độ pha loãng của nước nổi bậc 3 (9, 3,<br /> <br /> bằng lysozim. Điều này chứng tỏ peptidoglycan<br /> bị phá vỡ, làm giảm độ đục của hỗn dịch.<br /> Cũng có thể quan sát tế bào Escherichia<br /> coli bị phá vỡ bằng lysozim sau khi ly tâm ở<br /> hình 2.<br /> 1: Escherichia coli chứng cho thấy vi khuẩn<br /> <br /> 1, 1/3 µl) trong đệm phản ứng (NEBuffer 4: 20<br /> mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium<br /> <br /> không bị phá vỡ, cặn lắng đẹp; 2: vi khuẩn<br /> tươi (mới thu hoạch sau khi nuôi cấy); 3: vi<br /> <br /> acetate, 50 mM potassium acetate, 1 mM<br /> <br /> khuẩn đông lạnh ở - 30°C, 4 vi khuẩn biến nạp<br /> <br /> DTT, 100 µg/ml BSA và 80 µM AdoMet) với 1<br /> <br /> với plasmid tái tổ hợp mang enzim hạn chế<br /> <br /> μg cơ chất ADN (pAdeBsaBI) cho mỗi 50 μl<br /> <br /> bảo quản ở - 30°C, cho thấy hiệu quả phá vỡ<br /> <br /> thể tích phản ứng. Ủ 20 phút ở 37°C. Dừng<br /> <br /> tế bào khác nhau tùy theo tình trạng tế bào.<br /> <br /> phản ứng với đệm Gel Loading Dye, Blue của<br /> <br /> Tế bào vỡ càng nhiều thì thể tích cặn tế bào<br /> càng lớn và màu nước nổi càng đậm.<br /> <br /> New England Biolabs (2,5% Ficoll - 400, 11<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> Hình 1. Sự phá vỡ E. coli với lysozim<br /> 1: Hỗn dịch vi khuẩn chứng<br /> 2: Hỗn dịch vi khuẩn cho thêm lysozim<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> Hình 2. Sự phá vỡ E. coli với lysozim sau ly tâm<br /> 1: E. coli chứng<br /> 2: vi khuẩn tươi<br /> 3: vi khuẩn đông lạnh ở - 30°C<br /> 4: vi khuẩn biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang enzym hạn chế đông lạnh<br /> 2. Ảnh hưởng của nồng độ tế bào<br /> Hình 3: Phá vỡ Escherichia coli bằng cách<br /> sử dụng một tỷ lệ lysozim/số tế bào tương<br /> ứng, 4 nồng độ 1/1, 1/2, 1/4 và 1/8.<br /> <br /> Bảng 1 cho thấy, ở độ pha loãng tế bào<br /> 1/8, sự phá vỡ cao nhất, gần gấp 3 lần tế bào<br /> không pha loãng.<br /> Theo kết quả trên hình 3, có thể cho rằng<br /> <br /> Hiệu quả sự phá vỡ này được phân tích<br /> khi đo nồng độ endonucleasa trong nguyên<br /> <br /> 3µl nguyên sinh chất của nồng độ tế bào 1/1 là<br /> thể tích chứa đựng 1U endonucleasa. Trên cơ<br /> <br /> sinh chất bằng kỹ thuật bán định lượng. Nếu<br /> cho rằng 1U enzym là đơn vị cho phép thủy<br /> <br /> sở đó, có thể suy ra số đơn vị endonucleasa<br /> trong nguyên sinh chất tế bào vỡ ở nồng độ<br /> <br /> phân hoàn toàn lượng ADN chuẩn đang<br /> dùng, thì có thể ước lượng số đơn vị<br /> <br /> tiếp theo.<br /> <br /> endonucleasa có được ở các nồng độ tế bào.<br /> <br /> còn có sự hoạt động của các endonucleasa vi<br /> <br /> 10<br /> <br /> Lưu ý: bên cạnh enzym hạn chế tái tổ hợp<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> khuẩn, vì thế hình vạch ADN hạn chế không được thấy rõ.<br /> Bảng 1. Ước lượng endonucleasa trong nguyên sinh chất<br /> các tế bào vỡ bằng lysozim tùy theo nồng độ tế bào<br /> Nồng độ tế bào<br /> <br /> 1U<br /> <br /> U/ml<br /> <br /> 1/1<br /> <br /> 3 ml<br /> <br /> 333<br /> <br /> 1/2<br /> <br /> 6 ml<br /> <br /> 333<br /> <br /> 1/4<br /> <br /> 12 ml<br /> <br /> 666<br /> <br /> 1/8<br /> <br /> 9 ml<br /> <br /> 888<br /> <br /> Hình 3. Hoạt tính endonucleasa trong 9, 3, 1, 1/3 ml nguyên sinh chất<br /> 1 - 4: nồng độ tế bào 1/1;<br /> 6 - 9: nồng độ tế bào 1/2;<br /> 11 - 14: nồng độ tế bào 1/4;<br /> 16 - 19: nồng độ tế bào 1/8;<br /> 5, 10, 15 và 20: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III.<br /> 3. Quan sát enzym hạn chế tái tổ hợp<br /> Để xem hoạt động enzym hạn chế tái tổ hợp, nguyên sinh chất của hỗn hợp vi khuẩn ở độ<br /> pha loãng 1/1 được đưa qua cột heparine - sepharose. Hình 4: Enzym hạn chế tái tổ hợp nhiều<br /> nhất ở phân đoạn 15 - 16 và mức độ hoạt tính này đã cho phép xác định tính đặc hiệu của enzym.<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> Hình 4. Endonucleasa tái tổ hợp trong các phân đoạn<br /> sau khi qua cột heparin - sepharose<br /> 2 - 7: phân đoạn 3, 5, 7, 9, 10, 11;<br /> 9 - 16: phân đoạn 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19;<br /> 18 - 24: phân đoạn 20, 21, 23, 25, 27, 29, 31;<br /> 1, 8, 17 và 25: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Sự phá vỡ Escherichia coli với lysozim sau<br /> <br /> (ống nghiệm số 4) thì hiệu quả phá vỡ cao<br /> <br /> ly tâm được quan sát rõ ở hình 2. Ống nghiệm<br /> <br /> nhất. Thật ra, sự biểu hiện của enzym hạn chế<br /> tái tổ hợp đã gây hiện tượng hủy hoại vật chủ<br /> <br /> số 1, vi khuẩn không bị phá vỡ, có cặn tủa<br /> gọn gàng ở dưới đáy ống nghiệm với thể tích<br /> <br /> và do vậy tế bào dễ vỡ hơn. Theo lý thuyết,<br /> Escherichia coli là vi khuẩn Gram - có thành<br /> <br /> nhỏ nhất . Ống nghiệm số 2, vi khuẩn bị phá<br /> vỡ sẽ phồng lên và không đủ độ nặng để lắng<br /> <br /> phần murein ít hơn Gram + và có thêm lớp<br /> màng tế bào bao quanh, do đó có thể suy nghĩ<br /> <br /> dưới đáy ống nghiệm nữa mặc dù cùng tốc độ<br /> ly tâm. Thêm nữa, nước nổi có sự thay đổi<br /> <br /> rằng sự phá vỡ vi khuẩn này không hiệu quả.<br /> <br /> màu, càng nhiều tế bào vỡ màu càng đậm. Khi<br /> hỗn dịch Escherichia coli bị đông lạnh ở -30°C<br /> (ống nghiệm số 3), tủa tế bào phồng lên hơn<br /> so với vi khuẩn được thu hoạch tươi chứng tỏ<br /> <br /> Tuy nhiên, kết quả cho thấy có sự phá vỡ tế<br /> bào trong điều kiện thí nghiệm được thiết lập.<br /> Khi kết hợp việc đông lạnh vi khuẩn trước khi<br /> xử lý bằng lysozim, việc phá vỡ tế bào hiệu<br /> quả hơn.<br /> Ở độ pha loãng tế bào 1/8, hiệu quả phá<br /> <br /> vi khuẩn bị phá vỡ nhiều hơn. Điều này được<br /> giải thích như sau: khi đông lạnh (cũng là tác<br /> <br /> vỡ đạt cao nhất, gần gấp 3 lần tế bào không<br /> <br /> động vật lý) gây ra sự phá hủy màng tế bào<br /> bằng cách tách rời các phân tử cấu trúc ra<br /> <br /> pha loãng (bảng 1). Điều này cần lưu ý khi<br /> muốn thu lại nhiều sản phẩm. Nhưng cần phải<br /> <br /> khỏi nhau. Trong khi dùng Escherichia coli đã<br /> biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang gen enzym<br /> <br /> thao tác với thể tích hỗn hợp tối thiểu nhiều<br /> hơn 8 lần so với thể tích ban đầu. Tuy nhiên,<br /> <br /> hạn chế và bị đông lạnh trước khi dùng lysozim<br /> <br /> đối với việc phân tích tính chất enzym, số<br /> <br /> 12<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br />