PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:70

Thêm vào BST

Báo xấu

129
lượt xem 32
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vấn đề chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm trong đó có các sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến đã và đang là mối quan tâm của xã hội. Thịt chế biến thƣờng có nguồn gốc từ một loại hay nhiều loại thịt khác nhau. Do sự đa dạng về chất lƣợng, giá cả của các loại thịt đã gây ra vấn đề gian lận trong thƣơng mại (đối với cả thịt tƣơi và thịt chế biến). Đã có rất nhiều sản phẩm thịt trên thị trƣờng ghi thành phần trong công thức lệch với thực tế để...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ THANH HUYỀN Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007
LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Cô PGS.TS Trần Thị Dân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. KS. Lƣơng Quý Phƣơng, Trung tâm Phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm Đã tận tình hƣớng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. - Ban giám đốc, thầy cô và các cán bộ công chức Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . - Thầy Đinh Xuân Phát đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện khóa luận. Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 29 - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM đã luôn bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận. Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời, để con đƣợc nhƣ ngày hôm nay. iii
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2007. Sinh viên: Trịnh Thị Thanh Huyền. TÓM TẮT KHÓA LUẬN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN, thực hiện khóa luận “Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR”. Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân KS. Lƣơng Quý Phƣơng Thời gian thực hiện từ tháng 2/2007 đến tháng 8/2007, tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Để tạo tiền đề trong việc giải quyết vấn đề gian lận thƣơng mại đối với sản phẩm thịt tƣơi và thịt chế biến, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành thiết lập quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt đã xử lý nhiệt ở nhiệt độ: 800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ với tỷ số OD trung bình là 2,0 (thịt tƣơi), 1,9 (thịt xử lý nhiệt)- tinh sạch, đạt tiêu chuẩn. 2) Sau khi tiến hành tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR bằng việc thử nghiệm nhiều quy trình (gồm quy trình của Matsunaga và ctv (1998) và các thử nghiệm điều chỉnh về thành phần hóa chất, nhiệt độ và thời gian của chu trình nhiệt, nồng độ mồi trong phản ứng), chúng tôi đã xác định đƣợc quy trình thích hợp, trong đó nồng độ MgCl2 2mM, lƣợng FSIM: RP: RB: RS lần lƣợt là 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, nhiệt độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính (940C/1phút), bắt cặp (540C/45giây), kéo dài (720C/1phút). 3) Sử dụng quy trình nultiplex PCR vừa tìm đƣợc đối với các hỗn hợp DNA của cả ba loài trong đó nồng độ DNA bò, cừu giảm dần và đã xác định đƣợc nồng độ của thịt cừu, bò mà quy trình này còn phát hiện đƣợc là 1ng/ l. 4) Chúng tôi tiếp tục thực hiện quy trình trên đối với các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau và rút ra kết luận là ở các nhiêt độ biến tính 800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ vẫn còn phân biệt đƣợc ba loài trên.
5) Thực hiện quy trình trên với bột thịt của 3 hãng CE, A, VY, kết quả bột thịt của các hãng này có nguồn gốc lần lƣợt là: heo, bò, bò. SUMMARY TRINH THI THANH HUYEN in subject “Identifying meat of three meat species: pig, bovine, sheep by multiplex PCR” Suspervisors : PhD. Nguyen Ngọc Tuan BCs. Luong Quy Phuong To primarily resolve economic faudulent at meat products, we establish protocol to identify meat of three species (pig, bovine, sheep) by multiplex PCR. The results: 1) Extraction DNA from raw meats and heated meats (at temperatures: 800C/15 min, 1200C/15 min, 1200C/30 min, 1300C/15 min), average ratio of OD were 2,0 (raw meat) and 1,9 ( heated meat) were pure, standard quality. 2) After optimizing procedures including protocol of Matsunaga et al.(1998) and changing volume of reaction, element of chemical, temperature and time of thermal cycle, concentration of primer), we established the suitable multiplex PCR protocol. This protocol was MgCl2 2 mM; concentration of primers FSIM: RP: RB: RS were 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, temperature and thermal cycle (denature 940C/1 min, anealing 540C/45 sec, elongation 720C/1 min). 3) Aplying the multiplex PCR protocol to analyse mix DNA from three meat with descending concentration on bovine DNA and sheep DNA, the limits of DNA sample detected were 1ng/ l for bovine and sheep. 4) Using the protocol for mix heated meats to reach the conlusion that at processing temperatures: 800C/15 min, 1200C/15min, 1200C/30 min, 1300C/15min the meats of pig, bovine, sheep were still identified. Meat and bone meal from three companies (CE, A, VY) were examined by the established protocol, the products of those company were meat from pig, bovine and bovine, respectively.
MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa ............................................................................................................................. i Trang tựa .................................................................................................................. ii Lời cảm tạ ................................................................................................................ iii Tóm tắt khóa luận .................................................................................................... iv Summary ..................................................................................................................v Mục lục .................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .........................................................................................x Danh sách các bảng ................................................................................................. xi Danh sách các hình và biểu đồ.......................................................................................... xii Chƣơng 1 MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề ..........................................................................................................1 1.2 Mục đích ............................................................................................................2 1.3 Yêu cầu ..............................................................................................................2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................3 2.1 Sơ lƣợc về thịt chế biến .....................................................................................3 2.1.1 Giới thiệu về thịt .........................................................................................3 2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến...........................................................................4 2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến ................................................4 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trƣờng thịt tƣơi và thịt chế biến của thế giới ..........................................................................................................4
2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ động vật ở Việt Nam ....................................................................................5 2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật.................................................................6 2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR ...7 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt ...........................................................8 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học ...................................8 2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) ............................................................8 2.4.3 Protein array................................................................................................9 2.4.4 Điện di 2 chiều ............................................................................................9 2.4.5. Giới thiệu chung về phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) .....10 2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR .......................................................................16 2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR .................................................................................16 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................18 3.1 Nội dung thực hiện ..........................................................................................18 3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành ......................................................................18 3.3 Vật liệu ............................................................................................................19 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA .....................................................................19 3.3.2 Đoạn mồi...................................................................................................19 3.3.3 Hóa chất ....................................................................................................19 3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA .............................................19 3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di ...........................................................19 3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR ...............................................20 3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ .........................................................................20 3.4 Phƣơng pháp tiến hành ....................................................................................20 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu ................................................................................20 3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt ..........................20 3.4.3 Tách chiết DNA ........................................................................................21
3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR .......................................................................22 3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR ....................................................................24 3.4.5.1 Thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) ...............................................................................................24 3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng .................................24 3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt ...........................................24 3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng ..................25 3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các nồng độ DNA khác nhau ...................................................................................26 3.4.7 Thực hiện phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu ..................27 3.4.8 S-PCR đối với DNA của thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút ..........................27 3.4.9 M-PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau ....................................................................................28 3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt ...........................................................................28 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................29 4.1 Kết quả tách chiết ............................................................................................29 4.2 Kết quả s-PCR đối với thịt tƣơi thuần loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) ..........................................................................................................31 4.3 Kết quả phản ứng m-PCR 3 loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998)...............................................................................................................32 4.4 Kết quả quá trình thiết lập và tối ƣu hóa phản ứng m- PCR ...........................33 4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng ....................................................................33 4.4.2 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg2+ ..........................................33 4.4.3 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt .........................................34 4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi ............................................36 4.4.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình .............................................38 4.5 Kết quả m-PCR đối với 2 loài .........................................................................39
4.6 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của DNA bò, cừu ...................................................................................................................40 4.7 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt ..................................................................40 4.8 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ......................................43 4.9 Kết quả m-PCR đối với bột thịt .......................................................................45 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................................47 5.1 Kết luận ...........................................................................................................47 5.2 Đề nghị ............................................................................................................47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................48 PHỤ LỤC ..................................................................................................................51
DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2. 1. Tỉ lệ của các mô trong các loại thịt (%tính theo khối lƣợng thịt xẻ) ........3 Bảng 3. 1 Tỷ lệ các loại thịt trong các hỗn hợp thịt ..................................................21 Bảng 3. 2 Thành phần hóa chất PCR ........................................................................23 Bảng 3. 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR ............................23 Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng....................................................................23 Bảng 3. 5 Thành phần hóa chất PCR ........................................................................24 Bảng 3. 6 Chu trình nhiệt của phản ứng trƣớc và sau khi điều chỉnh .......................25 Bảng 3. 7 Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm) ..........................................................25 Bảng 3. 8 Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng) ...........................................................26 Bảng 3. 9 Phối hợp DNA của heo và bò ở các nồng độ khác nhau ..........................26 Bảng 3. 10 Phối hợp DNA của heo và cừu ở các nồng độ khác nhau ......................27 Bảng 3. 11 Thành phần các hỗn hợp DNA heo, bò, cừu ..........................................27 Bảng 3. 12 Hỗn hợp thịt ở các nhiệt độ xử lý khác nhau ..........................................28 Bảng 4. 1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA của thịt bò, heo, cừu ................................29 Bảng 4. 2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tách chiết từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt.......30
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 4.1 Sản phẩm s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1999) ............... 32 Hình 4.2 Sản phẩm m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) .............. 33 Hình 4.3 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh thể tích phản ứng ................................ 34 Hình 4.4 Sản phẩm m-PCR sau khi tăng nồng độ Mg2+ ......................................... 35 Hình 4.5 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp: 560C và 540C .......... 35 Hình 4.6 Sản phẩm m-PCR sau khi điều chỉnh chu trình nhiệt .............................. 36 Hình 4.7 Kết quả m-PCR khi giảm RS ................................................................... 38 Hình 4.8 Kết quả m-PCR khi tăng RP .................................................................... 38 Hình 4.9 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình ............................................ 39 Hình 4.10 Sản phẩm m-PCR đối với heo, bò .................................................................... 40 Hình 4.11 Sản phẩm m-PCR đối với DNA heo, cừu .............................................. 40 Hình 4.12 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp DNA ................................................. 41 Hình 4.13 Kết quả s – PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 800C/15 phút ................................. 42 Hình 4.14 Kết quả phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1200C/15 phút ....... 42 Hình 4.15 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1200C/30 phút ............................ 43 Hình 4.16 Sản phẩm s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút .......................... 43 Hình 4.17 Kết quả m-PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý ở nhiệt độ 800C/15 phút ..... 44 Hình 4.18 Kết quả m – PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở1200C/15 phút ...... 45 Hình 4.19 Kết quả m-PCR đối với hỗn hỗn hợp xử lý nhiệt 1200C/30 phút .......... 46 Hình 4.20 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút ....... 46 Hình 4.21 Kết quả m-PCR của bột thịt ................................................................... 47 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4. 1 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt heo, bò, cừu ..................290 Biểu đồ 4. 2 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt .. 301
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: base pair BSE :Bovine spongiform encephalopathy ctv: cộng tác viên DNA: deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: ethylene diamine tetra acetate ELISA: enzyme link imuno assay Lad: Ladder MBM: Meat and bone meal mtDNA : mitochondrial cytochrome b DNA m – PCR : multiplex PCR NST: nhiễm sắc thể OD: optical density PCR: polymerase chain reaction SDS: sodium dodecyl sulfate RNA: ribonucleic acid Taq: Taq polymerase TBE: Tris borate EDTA TE: Tris EDTA t. bò: thịt bò t. cừu: thịt cừu t. heo: thịt heo TN: Thí nghiệm Tỷ số OD: tỷ số OD260 nm/OD280 nm UI: unit UV: ultra violet
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vấn đề chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm trong đó có các sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến đã và đang là mối quan tâm của xã hội. Thịt chế biến thƣờng có nguồn gốc từ một loại hay nhiều loại thịt khác nhau. Do sự đa dạng về chất lƣợng, giá cả của các loại thịt đã gây ra vấn đề gian lận trong thƣơng mại (đối với cả thịt tƣơi và thịt chế biến). Đã có rất nhiều sản phẩm thịt trên thị trƣờng ghi thành phần trong công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản phẩm. Thịt chế biến thƣờng đƣợc xử lý ở nhiệt độ cao trên 1000C (khoảng 1200C đối với thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…). Đặc biệt bột xƣơng thịt làm thức ăn gia súc (Meat and bone meal - MBM) tuy đƣợc xử lý ở nhiệt độ khoảng 1300C nhƣng lại đƣợc sản xuất từ những phụ phế phẩm trong công nghiệp giết mổ nên một số mầm bệnh nguy hiểm vẫn còn tồn tại và có khả năng gây bệnh. Ví dụ BSE (Bovine spongiform encephalopathy: bệnh bò điên) có khả năng lây sang ngƣời, protein prion gây bệnh này chỉ mất khả năng gây bệnh ở nhiệt độ 1800C. Hiện nay, các phƣơng pháp xử lý nhiệt thông thƣờng không thể loại bỏ đƣợc nguy cơ mầm bệnh BSE. Vì lý do này, các nƣớc trên thế giới trong đó có Việt Nam không cho phép nhập bột xƣơng thịt có nguồn gốc từ thịt bò, cừu, dê của các nƣớc Châu Âu, Châu Mỹ, Nhật Bản vì sợ bệnh BSE. Việc gian lận thƣơng mại sẽ gây ra vấn đề không thể kiểm soát nguồn gốc các thực phẩm nhập khẩu. Ngày nay, khi tình hình gian lận trong sản xuất và tiêu thụ sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến vẫn diễn ra cùng với các dịch bệnh nguy hiểm liên tiếp hoành hành thì việc đảm bảo tính trung thực và an toàn của các sản phẩm này là rất cấp thiết. Điều này đặt ra cho các nhà quản lý và các nhà nghiên cứu phải tìm ra phƣơng pháp phát hiện, phân biệt nhanh chóng, chính xác các loại thịt trong sản 1
phẩm thịt tƣơi cũng nhƣ thịt chế biến để ngăn chặn kịp thời những gian lận nhằm mục đích bảo vệ lợi ích chính đáng và sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng. Có nhiều cách để xác định nguồn gốc thịt: dùng kính hiển vi quang học, ELISA, điện di 2 chiều, protein array, multiplex PCR... Bốn phƣơng pháp đầu hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý ở nhiệt độ cao. Còn phƣơng pháp multiplex PCR là một phƣơng pháp nhanh, đặc hiệu, đơn giản, thích hợp để phân biệt các loại thịt đã xử lý nhiệt. Vì vậy để tạo tiền đề cho việc giải quyết vấn đề trên, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR. 1.2 Mục đích Bƣớc đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện và phân biệt thịt heo, bò, cừu. Ứng dụng quy trình để phát hiện và phân biệt các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt và bột thịt. 1.3 Yêu cầu Nắm vững qui trình tách chiết DNA. Tối ƣu hóa quy trình multiplex PCR và ứng dụng quy trình này vào việc phát hiện các loại bột thịt làm thức ăn gia súc. 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về thịt chế biến 2.1.1 Giới thiệu về thịt Thịt là một khái niệm dùng để chỉ một số mô có giá trị sử dụng làm thực phẩm có nguồn gốc từ động vật. Trong thƣơng phẩm học thành phần của thịt gồm: mô cơ, mô mỡ, mô liên kết, mô xƣơng sụn và mô máu. Thành phần hóa học của thịt bao gồm: nƣớc, protein, lipit, glucit, các chất trích ly chứa nitơ và không chứa nitơ, khoáng, vitamin và enzym. Các thành phần này phụ thuộc vào loài thú, tuổi, giới tính, mục tiêu sử dụng, khẩu phần nuôi dƣỡng, mức độ và giai đoạn vỗ béo, bộ phận súc thịt và cơ thể học (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004). Bảng 2. 1. Tỉ lệ của các mô trong các loại thịt (%tính theo khối lƣợng thịt xẻ) Loại mô Thịt bò Thịt heo Thịt cừu Mô cơ 57-62 % 40-62 % 49-58 % Mô mỡ 3-16 % 15-40 % 4-18 % Mô liên kết 9-12 % 6-8 % 7-11 % Mô xƣơng - sụn 17-29 % 8-18 % 18-38 % Mô máu 0,8-1 % 0,6-0,8 % 0,8-1 % (Theo Xmolxki, 1975) Tính chất của các mô và thành phần cấu tạo của các mô đều khác nhau. Do đó tùy theo đặc tính và tỉ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết định tính chất của thịt. Ngƣời ta thừa nhận mô mỡ và mô cơ có giá trị sử dụng cao nhất. Vì con ngƣời sử dụng thịt làm thực phẩm là để thỏa mãn nhu cầu về protein và lipit. 3
Ngoài ra theo khái niệm hiện nay, giá trị của thịt phụ thuộc vào sự đầy đủ và cân bằng về thành phần các axit amin thiết yếu. 2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến Thịt có giá trị sử dụng cao thì phải đƣợc chế biến thành nhiều dạng sản phẩm khác nhau tùy theo mục đích sử dụng khác nhau của giới tiêu dùng. Việc chế biến làm tăng sự ngon miệng, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dƣỡng, hạn chế sự hƣ hỏng do vi sinh vật, tăng thời gian bảo quản do đó tăng giá trị sử dụng của thịt (Romans và ctv, 1999). Thịt chế biến có hai nhóm chính: thịt chế biến làm thức ăn cho con ngƣời, thịt chế biến làm thức ăn cho gia súc. Thịt chế biến làm thức ăn cho con ngƣời đƣợc chế biến từ mô cơ, mô mỡ, mô liên kết. Riêng thịt chế biến dùng làm thức ăn gia súc (thƣờng là bột thịt) còn đƣợc chế biến từ các nguồn vật liệu giàu protein khác nhƣ: da, lông, móng, máu, hệ xƣơng và các nội quan (các phụ phế phẩm lò mổ). Có nhiều phƣơng pháp chế biến: phơi khô, muối, ƣớp đƣờng, lên men, xử lý nhiệt (nấu, hấp, sấy). Trong đó phƣơng pháp chế biến ở nhiệt độ cao là phổ biến nhất. Tùy theo loại sản phẩm và mục đích sử dụng mà ngƣời ta xử lý ở các nhiệt độ khác nhau. Hiện nay, hầu hết các sản phẩm chế biến nhƣ xúc xích, lạp xƣởng... đƣợc xử lý ở 800C; xúc xích tiệt trùng, thịt hộp các loại... thƣờng xử lý 1200C trở lên; đối với bột thịt sử dụng cho gia súc đƣợc xử lý ở 1300C (Hồ Thị Nguyệt Thu, 2003). 2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trƣờng thịt tƣơi và thịt chế biến của thế giới Cơ quan tiêu chuẩn về thực phẩm (FSA – Food standard Agency) đã tổ chức nhiều cuộc điều tra trên đối tƣợng thịt và các sản phẩm thịt chế biến, kết quả cho thấy có rất nhiều sai lệch giữa thành phần thực tế với nhãn hiệu hàng hóa của sản phẩm. Nhất là sản phẩm thịt chế biến gồm nhiều loại thịt khác nhau, các nhà sản xuất thƣờng ghi trên nhãn sản phẩm những loại thịt có giá trị cao và tránh ghi những loại thịt có giá trị thấp đƣợc trộn vào trong sản phẩm. Một số trƣờng hợp lại ghi sai tỷ lệ 4
giữa các loại thịt. Trong khi đó, khả năng kiểm soát thành phần, độ an toàn và chất lƣợng sản phẩm thịt chế biến trên thị trƣờng của các tổ chức ban ngành có liên quan vẫn còn ít. (Nguồn:http://archive.food.gov.uk/maff/archive/food/insheet/1999/N0167/176meat. htm.) Một cuộc điều tra khác của bộ môn Kỹ thuật thực phẩm và vệ sinh thực phẩm, trƣờng Thú y, ĐH Ankara (Mỹ) (2006) về các loại thịt đƣợc trộn vào trong thịt và thịt chế biến. Trên 100 mẫu điều tra, kết quả là: 39,2% xúc xích lên men, 35,7 % xúc xích Ý, 27.2% xúc xích Đức, 22,2% thịt tƣơi, 6,2% thịt viên có chứa thịt của những loài động vật không công bố trên nhãn sản phẩm. Cụ thể là xúc xích lên men, xúc xích Ý, xúc xích Đức đƣợc công bố là chỉ chứa thịt bò nhƣng kết quả kiểm tra lại phát hiện có lẫn thịt gia cầm; các mẫu thịt bò tƣơi kết quả kiểm nghiệm lại cho dƣơng tính với thịt hƣơu và thịt ngựa; thịt bò viên lại có chứa thịt gia cầm. (Nguồn: www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1745-4573.2006.00046.x) 2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ động vật ở Việt Nam Ở Việt Nam, tình hình gian lận thƣơng mại trong sản xuất, tiêu thụ thịt và sản phẩm chế biến từ thịt là vấn đề nhức nhối đối với các nhà quản lý. Ngay cả thịt tƣơi bán ở chợ hay ở các cửa hàng cũng bị gian lận nhƣ: thịt trâu giả bò, thịt ngựa giả bò, heo giả thịt dê... Đối với thịt chế biến nhƣ xúc xích tôm, xúc xích bò, chả giò, thịt hộp… trên thị trƣờng có nhiều sản phẩm nghi ngờ không đúng thành phần nhƣ nhãn hiệu hàng hóa đã đăng kí, đặc biệt các thức ăn chế biến nhập khẩu. Chúng ta chƣa có các kỹ thuật để xác minh thành phần thịt trong sản phẩm. Những năm gần đây, Việt Nam nổi lên vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm. Các bệnh dịch lớn đã và đang diễn ra. Tình trạng vận chuyển lậu động vật và các sản phẩm động vật vẫn thƣờng xảy ra. Cục Thú y đã phối hợp với Vụ Pháp chế – Bộ Nông nghiệp và PTNT, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm – Bộ Y tế, Cục Quản lý Thị trƣờng – Bộ Thƣơng mại thƣờng xuyên tổ chức thanh tra, kiểm tra công tác 5
kiểm dịch nhập khẩu động vật, sản phẩm động vật, đặc biệt là hoạt động chống nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới. Kết quả thanh tra, kiểm tra cho thấy tình hình nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới diễn biến hết sức phức tạp, chính quyền địa phƣơng chƣa thực sự quan tâm chỉ đạo công tác ngăn chặn và xử lý nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới, sự phối hợp giữa các cơ quan, ban ngành tại địa phƣơng chƣa thống nhất và thiếu chặt chẽ. (nguồn: www.business.gov.vn/LicenseDetail.aspx?id=883 - 37k). Thêm vào đó công tác kiểm dịch đối với các mặt hàng xuất nhập khẩu có nguồn gốc động vật vẫn còn nhiều vấn đề bất cập: Các nhà xuất nhập khẩu đều có thể đáp ứng đƣợc các yêu cầu tiêu chuẩn kỹ thuật và quy định của Việt Nam. Tuy nhiên, do thiếu trang thiết bị và cán bộ, nên việc kiểm tra chất lƣợng, kiểm dịch và các thủ tục phê duyệt thƣờng kéo dài. Trong khi đó, các nƣớc nhập khẩu yêu cầu về đăng ký công bố chất lƣợng, kiểm dịch, kiểm soát giết mổ của các nƣớc nhập khẩu thƣờng rất chặt chẽ. Các yêu cầu, tiêu chuẩn về vệ sinh và an toàn thực phẩm của các nƣớc này cũng rất cao. Các nhà nhập khẩu nƣớc ngoài còn yêu cầu thịt và sản phẩm của thịt phải đƣợc lấy từ vùng an toàn đối với bệnh lở mồm long móng, dịch tả lợn, newcastle, BSE và những vùng này phải đƣợc tổ chức dịch tễ quốc tế (OIE) công nhận. Yêu cầu, tiêu chuẩn của Việt Nam thƣờng không chặt chẽ bằng các yêu cầu tiêu chuẩn của các nƣớc nhập khẩu (Bùi Thị Cúc, 2006) (Nguồn: http:// www.cucthuy.gov.vn). 2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật Tế bào động vật thuộc dạng tế bào eukaryote, đƣợc bao quanh bởi màng tế bào, bên trong chứa nhân và các bào quan khác. Khác với các tế bào eukaryote khác nhƣ thực vật và nấm, tế bào động vật không có vách tế bào (cell wall) (nguồn: www.Micro.Magnet.fsu.edu/cells/animalcell.html - 40k). 6
Chính vì tế bào động vật không có vách vững chắc nên khi tách chiết DNA từ tế bào động vật không cần giai đoạn phá vỡ vách tế bào. Cũng do không có vách tế bào, tế bào động vật phát triển rất đa dạng về hình dạng. Đặc biệt là tế bào thần kinh và tế bào cơ (Davidson, 2005). Các tế bào động vật đƣợc nối với nhau bằng một loại protein cấu trúc xoắn bậc ba gọi là collagen. Còn ở thực vật và nấm các tế bào đƣợc nối với nhau bằng loại protein khác chẳng hạn nhƣ pectin. (Nguồn: www.Micro.Magnet.fsu.edu/cells/animals/animalmodel.html - 8k) Nguyên sinh chất của tế bào động vật chứa khoảng 85 % nƣớc và 15 % protein và các RNA, DNA, enzym, axit amin, các sản phẩm trung gian của sự trao đổi chất, muối khoáng…Mỗi tế bào thƣờng có một nhân, thƣờng có hình tròn hay hình bầu dục. Nhân thƣờng nằm ở giữa tế bào, nhƣng cũng có thể nằm lệch sát màng tế bào nhƣ ở tế bào cơ vân (Nguyễn Đình Trung, Nguyễn Minh Tâm, 2005). 2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR Phƣơng pháp PCR thực chất là một phƣơng pháp tạo dòng trong ống nghiệm, nhằm mục đích thu nhận một lƣợng lớn bản sao của một trình tự xác định. Chính vì vậy, đoạn DNA mục tiêu đƣợc nhân lên rất nhiều lần và có thể đƣợc quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di DNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002). Năm 1997, Sawyer đã khẳng định trên gen cytochrom b ở ty thể (mtDNA) có vùng bảo tồn cho các loài gia súc, gia cầm. Dựa vào đó tác giả thiết kế mồi xuôi cho việc khuếch đại một đoạn DNA của các loài gia súc, gia cầm này. Và dựa vào trình tự chuyên biệt cho từng loài trên mtDNA mà thiết kế mồi xuôi cho từng loài. Theo Matsugana và ctv (1998), việc sử dụng 7 đoạn mồi (1 mồi xuôi, 6 mồi ngƣợc) với tỉ lệ thích hợp để phát hiện một đoạn DNA chuyên biệt cho các loài bò, heo, gà, cừu, dê, ngựa. Các đoạn DNA chuyên biệt này của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lƣợt có khích thƣớc: 157, 227, 274, 331, 398, 439 bp. Kết quả PCR đƣợc quan sát bằng điện di. Sự hiện diện hoặc vắng mặt sản phẩm PCR cho phép xác định có hay không thịt loài gia súc đó trong sản phẩm. 7
Nhằm xác định nồng độ nhỏ nhất để có thể phát hiện đƣợc loài từ thịt chế biến, năm 2004, Myers và ctv cũng đã sử dụng phƣơng pháp multiplex PCR để khuếch đại vùng gen trên mtDNA. Tác giả thực hiện phản ứng PCR với nhiều nồng độ DNA khác nhau. Sau đó dựa sự có hay không các sản phẩm PCR qua điện di để xác định nồng độ tối thiểu của DNA để phản ứng PCR còn phát hiện đƣợc. 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học Để phân biệt các loài trong bột xƣơng thịt ngƣời ta lập ra một thƣ viện hình ảnh về các mẫu xƣơng. Theo đó các mẫu bột xƣơng thịt đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi và đối chiếu với thƣ viện này để xác định các loài có trong mẫu xét nghiệm. Phƣơng pháp này đòi hỏi ngƣời xét nghiệm phải có kinh nghiệm và tay nghề cao. Ngoài ra, phƣơng pháp này có độ chính xác không cao vì còn phụ thuộc vào kinh nghiệm của nhân viên xét nghiệm. (Nguồn: http://www.europa.eu.int/comm/food/fs/bse/index-in.html). 2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) Năm 1972 – 1973, ELISA đƣợc sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đoán virut. Đến năm 1977, Clark và Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virut hại thực vật tại Scottlen. Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên tắc bánh kẹp (sandwich), tạo liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Sự liên kết đó cho phép định lƣợng sự hiện diện của kháng thể hoặc kháng nguyên. Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể đƣợc xác định khi đƣợc nhận biết đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng hợp với hệ biotin – streptavidin – enzym sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất phù hợp. Đây là kỹ thuật khá nhạy và tƣơng đối đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml), rẻ tiền, an toàn và độ chính xác cao (Phạm Văn Ty, 2001). Tuy nhiên bản thân kỹ thuật ELISA nói chung cũng còn có một số nhƣợc điểm. Đối chứng âm vẫn có thể cho kết quả dƣơng tính do bị nhiễm chéo từ chất tạo 8