Phân lập, tuyển chọn nấm men từ trái cây địa phương thử nghiệm lên men dịch xoài

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2017<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỪ TRÁI CÂY ĐỊA PHƯƠNG<br /> VÀ THỬ NGHIỆM LÊN MEN DỊCH XOÀI<br /> ISOLATION, SELECTION OF YEASTS ASSOCIATED WITH LOCAL FRUITS<br /> AND FERMENTATION OF MANGO JUICE<br /> Nguyễn Thị Thanh Hải1, Đỗ Thị Ánh Hòa2<br /> Ngày nhận bài: 19/7/2016; Ngày phản biện thông qua: 15/8/2017; Ngày duyệt đăng: 25/9/2017<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Sản phẩm nước trái cây lên men đang phát triển mạnh trên thị trường Việt Nam. Việc sử dụng chủng nấm<br /> men phù hợp trong quá trình lên men nước trái cây là vấn đề cần quan tâm. Mục tiêu của nghiên cứu này là<br /> phân lập, tuyển chọn nấm men từ các loại trái cây địa phương và thử nghiệm lên men dịch xoài. 16 chủng nấm<br /> men đã được phân lập từ các mẫu trái cây lên men tự nhiên, trong đó nghiên cứu tuyển chọn được hai chủng<br /> N11 và N23 có khả năng chịu được nồng độ đường 25%w/v, nồng độ cồn 8%v/v và có khả năng kết lắng tốt.<br /> Hai chủng này được tiến hành thử nghiệm lên men dịch xoài và cho dịch lên men có nồng độ cồn tương ứng<br /> 4,7%v/v và 4,57%v/v. Kết qủa định danh bằng giải trình tự gen 28S rRNA cho thấy cả 2 chủng tuyển chọn đều<br /> là Saccharomyces cerevisiae với độ tương đồng 99%. Chủng nấm men tuyển chọn góp phần nâng cao giá trị<br /> và ổn định chất lượng sản phẩm, thúc đẩy ngành sản xuất đồ uống trái cây lên men có độ cồn thấp phát triển.<br /> Từ khóa: 28S rRNA, dịch xoài lên men, nấm men, Saccharomyces cerevisiae<br /> ABSTRACT<br /> Fermented fruit juice products are growing strongly in Vietnam market. The proper use of yeast strains<br /> during fermentation of juice should be considered. Isolation, selection of yeasts associated with local fruits<br /> and fermentation on mango juice have been investigated. There were 16 strains of yeast isolated from natural<br /> fermented fruit samples and two selected strains are N11 and N23. They can tolerate with glucose concentration<br /> of 25% w/v, alcohol content of 8% v/v and can form aggregates. These two strains were used to ferment mango<br /> juice, which produced fermented liquids with alcohol contents of 4,7% v/v and 4,57% v/v, respectively. The<br /> results from the sequencing of the 28S rRNA gene showed that both selected strains were Saccharomyces<br /> cerevisiae species with an identity of 99%. The selected yeasts contribute to enhance the value of products,<br /> to stabilize the quality and to promote the development of the fermented fruit drinks industry with low<br /> alcohol content.<br /> Keywords: 28S rRNA, fermented mango juice, Saccharomyces cerevisiae, yeast<br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hệ vi sinh vật tham gia trong quá trình<br /> lên men trái cây tự nhiên rất phức tạp nên<br /> thường cho độ cồn không cao, dễ bị nhiễm tạp,<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> <br /> chất lượng rượu ít được đảm bảo. Công<br /> nghiệp lên men hiện đại xây dựng dựa trên<br /> việc sử dụng chủng nấm men tuyển chọn có<br /> độ tin cậy về an toàn, khả năng lên men tốt,<br /> <br /> Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang<br /> Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 9<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> góp phần ổn định chất lượng của sản phẩm<br /> tạo ra [1], [6], [7]. Do đó, các chủng nấm men<br /> thuần đang được sử dụng phổ biến trong công<br /> nghiệp nước quả lên men trên thế giới [9], [13].<br /> Các loài và chủng nấm men với các đặc tính<br /> khác nhau sẽ tạo thành các chất dễ bay hơi có<br /> thành phần và tỷ lệ khác nhau trong sản phẩm<br /> lên men [14]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các<br /> chủng Saccharomyces cerevisiae có tính chất<br /> sinh hóa đặc trưng đã được tuyển chọn dùng<br /> để sản xuất rượu vang từ trái cây có sẵn tại địa<br /> phương với công nghệ thích ứng có thể thực<br /> hiện đơn giản, rẻ tiền [1], [4], [9].<br /> Xoài là đối tượng sản xuất rượu vang với<br /> chất lượng tương tự rượu vang nho [6], [11].<br /> Tuy nhiên, có rất ít thông tin về sản xuất rượu<br /> vang xoài, đặc biệt là sản xuất rượu vang phù<br /> hợp giống xoài địa phương với chủng nấm<br /> men thuần [12]. Ở Việt Nam đã có nghiên<br /> cứu sử dụng chủng nấm men bánh mỳ<br /> Saccharomyces cerevisiae (Pháp) trong quá<br /> trình lên men rượu vang xoài [2].<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Thu thập mẫu trái cây<br /> Mẫu trái cây (dâu, nho, xoài, vải, nhãn)<br /> không có các chất kích thích và chất phòng<br /> trừ sâu bệnh được thu nhận tại các nhà vườn<br /> thuộc các tỉnh Ninh Thuận, Khánh Hòa và Lâm<br /> Đồng. Các mẫu trái cây sau thu nhận được<br /> làm dập trong túi nilon vô trùng, ủ lên men tự<br /> nhiên và giữ làm nguồn phân lập nấm men.<br /> Trái cây có vỏ cứng được loại bỏ vỏ vô trùng,<br /> tránh tạp nhiễm sau đó đem làm dập. Mẫu sau<br /> 1 tuần lên men được bảo quản ở 40C để tiến<br /> hành phân lập.<br /> 2. Phân lập và làm thuần chủng nấm men<br /> Chủng nấm men được phân lập trên môi<br /> trường YPG (YPG: yeast extract peptone<br /> glucose medium) và YPG có bổ sung 6 g/L<br /> tartaric acid, 30 mg/mL chloramphenicol. Các<br /> môi trường sử dụng trong thí nghiệm đều là<br /> môi trường của Merck (Đức).<br /> <br /> 10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Số 3/2017<br /> Lấy 1g mẫu trái cây lên men pha loãng,<br /> và cấy trang trên môi trường YPG, ủ ở 300C<br /> trong 24 - 48 giờ. Sau khi ủ, chọn các khuẩn<br /> lạc điển hình cấy ria sang môi trường YPG có<br /> bổ sung chloramphenicol 30 mg/l môi trường<br /> và ủ cùng điều kiện. Khi khuẩn lạc thuần phát<br /> triển tốt, cấy chuyển ống thạch nghiêng YPG<br /> và bảo quản ở 40C chuẩn bị cho nghiên cứu<br /> tiếp theo [8], [9].<br /> 3. Tuyển chọn chủng nấm men<br /> 3.1. Thí nghiệm kiểm tra khả năng chịu nồng<br /> độ đường của chủng phân lập<br /> Chủng phân lập được thử nghiệm bằng<br /> cách nuôi cấy cùng mật độ trong các bình nuôi<br /> cấy chứa canh YPG bổ sung glucose lần lượt<br /> với các nồng độ 15%, 20%, 25%, 30% (w/v) ở<br /> 300C trong 48 giờ, đo mật độ quang OD540nm<br /> và so sánh khả năng chịu nồng độ đường thử<br /> nghiệm của chủng phân lập. Việc tăng mật độ<br /> quang học trong mỗi bình nuôi cấy được ghi<br /> nhận như bằng chứng của sự phát triển. Nồng<br /> độ của đường mà tại đó sự tăng trưởng của<br /> nấm men bị ức chế được đánh giá là khả năng<br /> chịu đựng đường của nấm men [13].<br /> 3.2. Thí nghiệm kiểm tra khả năng chịu nồng<br /> độ cồn<br /> Chủng phân lập được thử nghiệm bằng<br /> cách nuôi cấy cùng mật độ trong các bình nuôi<br /> cấy chứa canh YPG bổ sung ethanol tinh khiết<br /> với các nồng độ tương ứng 0%, 4%, 6%, 8%,<br /> 10% (v/v) ở 300C trong 48 giờ và tương tự<br /> xác định OD540nm. Nồng độ rượu tại đó sự sinh<br /> trưởng của nấm men bị ức chế được đánh giá<br /> là khả năng chịu đựng ethanol của nấm men<br /> [5], [13].<br /> 3.3. Thí nghiệm kiểm tra khả năng kết lắng của<br /> chủng lên men<br /> Nấm men được nuôi cấy trong ống nghiệm<br /> chứa 10ml canh YPG và ủ ở 300C trong<br /> 48 - 72 giờ. Sau khi ủ, lấy ống nghiệm ra lắc<br /> đều, đo chiều cao đoạn lắng trong ở các ống<br /> nghiệm. Nếu nấm men có khả năng lắng tốt thì 7<br /> ngày sau khi lên men, chiều cao đoạn dịch trong<br /> >75 % chiều cao của khối môi trường lên men.<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2017<br /> 4. Xử lý số liệu<br /> Các thí nghiệm trên được lặp lại 3 lần và số<br /> liệu được xử lý trên phần mềm Exel, phân tích<br /> thống kê ANOVA (p0,05) nên được tuyển chọn cho<br /> nghiên cứu tiếp theo.<br /> 2.2. Kết quả thí nghiệm kiểm tra khả năng chịu<br /> nồng độ cồn của chủng phân lập<br /> Khảo sát trên 7 chủng tuyển chọn cho thấy,<br /> khi nuôi cấy trong môi trường chứa nồng độ<br /> cồn 4% có 6 chủng, ở nồng độ cồn 6% có 5<br /> chủng, ở nồng độ cồn 8% chỉ có 3 chủng có<br /> độ OD540nm không khác biệt có ý nghĩa với mẫu<br /> đối chứng (p>0,05). Kết quả thí nghiệm kiểm<br /> tra khả năng chịu nồng độ cồn của 3 chủng<br /> phân lập chịu nồng độ cồn 8% được thể hiện<br /> trong Bảng 3.<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2017<br /> <br /> Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến sinh trưởng của 3 chủng chịu nồng độ cồn 8% (v/v)<br /> Nồng độ cồn % (v/v)<br /> <br /> Chủng<br /> tuyển chọn<br /> <br /> Đối chứng<br /> <br /> 4%<br /> <br /> 6%<br /> <br /> 8%<br /> <br /> 10%<br /> <br /> N11<br /> <br /> 1,79 ± 0,09a<br /> <br /> 1,75 ± 0,14a<br /> <br /> 1,71 ± 0,06a<br /> <br /> 1,05 ± 0,05ab<br /> <br /> 0,27± 0,05b<br /> <br /> N23<br /> <br /> 1,75 ± 0,03a<br /> <br /> 1,73 ± 0,07a<br /> <br /> 1,60 ± 0,15a<br /> <br /> 1,20 ± 0,07ab<br /> <br /> 0,7 ± 0,64b<br /> <br /> V11<br /> <br /> 1,78 ± 0,07a<br /> <br /> 1,75 ± 0,14a<br /> <br /> 1,74 ± 0,03a<br /> <br /> 1,03 ±0,6ab<br /> <br /> 0,53 ± 0,23b<br /> <br /> Các giá trị a, b thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các số liệu (p 75 %<br /> <br /> N23<br /> <br /> dạng bột<br /> <br /> > 75 %<br /> <br /> V11<br /> <br /> dạng bột<br /> <br /> 50 % - 75 %<br /> <br /> Kết quả khảo sát cho thấy 2 chủng N11 và<br /> N23 có khả năng kết lắng tốt, dịch lên men<br /> trong độ cao lớn 75% chiều cao của dịch lên<br /> men sau 7 ngày lên men. Kết lắng dạng bột<br /> bám chắc đáy ống lên men, thuận tiện quá<br /> trình tách cặn sau lên men. Khả năng kết lắng<br /> là một đặc tính rất tốt dùng để sản xuất rượu<br /> vang, vì nấm men kết lắng tốt thuộc nhóm nấm<br /> men lên men chìm, nhóm nấm men lên men<br /> chậm, nên khả năng giữ mùi hương cao, kết<br /> lắng tốt làm cho rượu trong, quá trình lắng sẽ<br /> không tốn các phụ gia cũng như thiết bị lọc.<br /> <br /> Mặt khác nếu nấm men thuộc nhóm nấm men<br /> lên men bề mặt, hoạt lực lên men mạnh, CO2<br /> sinh ra nhiều sẽ mang theo các chất thơm, làm<br /> mất mùi thơm của rượu, cho nên trong sản<br /> xuất rượu vang người ta ít sử dụng nấm men<br /> thuộc nhóm lên men bề mặt [8], [14].<br /> 2.4. Kết quả thí nghiệm kiểm tra khả năng lên men<br /> rượu của chủng tuyển chọn trong dịch ép xoài<br /> Kết quả xác định hàm lượng chất rắn hòa<br /> tan còn lại (TSS) và hàm lượng cồn tạo thành<br /> sau lên men dịch xoài với chủng tuyển chọn<br /> được thể hiện trên Bảng 5.<br /> <br /> Bảng 5. Khả năng lên men rượu của chủng tuyển chọn trong dịch ép xoài<br /> Chủng tuyển chọn<br /> <br /> Hàm lượng TSS ban đầu<br /> (oBrix)<br /> <br /> Hàm lượng TSS còn lại<br /> (oBrix)<br /> <br /> Hàm lượng cồn tạo thành<br /> (% v/v)<br /> <br /> N11<br /> <br /> 16,2<br /> <br /> 7,10± 0,36a<br /> <br /> 4,70 ± 0,1bb<br /> <br /> N23<br /> <br /> 16,2<br /> <br /> 7,57 ± 0,51a<br /> <br /> 4,57 ± 0,21b<br /> <br /> Các giá trị a, b thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các số liệu (p