zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Nông - Lâm - Ngư

» Nông nghiệp

Nghiên cứu tuyển chọn nấm ký sinh côn trùng Cordyceps spp. giàu hoạt chất sinh học từ Vườn Quốc gia Hoàng Liên, Lào Cai

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Báo xấu

10
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Nghiên cứu tuyển chọn nấm ký sinh côn trùng Cordyceps spp. giàu hoạt chất sinh học từ Vườn Quốc gia Hoàng Liên, Lào Cai trình bày việc phân lập nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp. A9; Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa ITS1-5.8S-ITS2; Lựa chọn môi trường lỏng hoạt hóa giống; Lựa chọn môi trường dinh dưỡng lỏng trong lên men bề mặt.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tuyển chọn nấm ký sinh côn trùng Cordyceps spp. giàu hoạt chất sinh học từ Vườn Quốc gia Hoàng Liên, Lào Cai

Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(62)/2016 NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG Cordyceps spp. GIÀU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ VƯỜN QUỐC GIA HOÀNG LIÊN, LÀO CAI Đỗ Tiến Mạnh1, Đinh ị Ngọc úy1, Nguyễn Hữu Đức2, Nguyễn ị anh Lan1, Nguyễn ị anh Bình1 TÓM TẮT Chủng nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp. A9 được phân lập từ mẫu thể quả của nấm thu thập từ Vườn quốc gia Hoàng Liên, Lào Cai. Chủng A9 được hoạt hóa tốt nhất trong môi trường lỏng HHL1 với mật độ bào tử đạt 5 x 106 tế bào/ml sau 7 ngày nuôi cấy. Sau khi tiến hành lên men bề mặt trong điều kiện phù hợp, kết quả khối lượng thể quả đạt 16,6 g tươi/lọ và hàm lượng beauvericin đạt 1,68 mg/g, adenosine 0,76 mg/g khô, sau 45 ngày nuôi. Kết quả phân tích trình tự đoạn gen ITS của chủng Cordyceps A9 có độ tương đồng 99% với gen tương ứng của chủng Cordyceps takaomontana. Với hàm lượng hoạt chất adenosine và beauvericin cao, chủng C.takaomontana A9 được coi là tiềm năng để phát triển làm thực phẩm chức năng và dược liệu. Từ khóa: Adenosin, Beauvericin, Cordyceps takaomontana, dược liệu, nấm ký sinh côn trùng. I. ĐẶT VẤN ĐỀ thư Cisplatin từ 4 đến 6,6 lần (Nam et al., 2001). Nấm ký sinh côn trùng Cordyceps spp. hay Beauvericin gây độc nhiều dòng tế bào ung thư, Đông trùng hạ thảo được biết đến như loại kháng 10 loại vi khuẩn gram dương và 9 loại vi dược liệu quý sử dụng trong y học cổ truyền, khuẩn gram âm (Qinggui Wang et al., 2012). chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao như Ở Việt Nam, Phạm Quang u và cộng sự adenosine, cordycepin, cordyceptic acid, (2010) đã phát hiện C.takaomona ở Vườn Quốc D manitol, beauvericin...với nhiều tác dụng gia Tam Đảo. Ở Vườn Quốc gia Pù Mát (Nghệ An), như tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn, hỗ trợ Trần Ngọc Lân và cộng sự (2008) đã xác định được điều trị tim mạch, ung thư… trong hơn 200 mẫu có chi nấm Cordyceps gồm 15 Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đang lưu loài, đặc biệt chi C.takaomontana có tới 11 loài. hành một số sản phẩm Đông trùng hạ thảo: Những kết quả đã công bố cho thấy, nguồn Cordyceps sinensis (Berk.), Cordyceps militaris gen C.takaomontana ở Việt Nam rất phong phú, (L. ex Fr) Link , Cordyceps takaomontana Yukuiji nên có thể chủ động được nguồn giống. Hơn et Kumazawa có xuất xứ Trung Quốc, Hàn Quốc, nữa, kỹ thuật nhân nuôi tạo thể quả không đòi ái Lan, Nhật Bản, nhưng chủ yếu từ Trung hỏi điều kiện quá khắt khe và nguồn nguyên liệu Quốc. Cordyceps sinensis (Berk.) phân bố đặc thù cho sản xuất như gạo, nhộng tằm… ở Việt Nam ở Tây Tạng, việc nghiên cứu nhân nuôi nhân tạo dễ kiếm và giá thành thấp. Do đó, việc nghiên cứu cho đến nay chưa hiệu quả, nguồn sản phẩm chủ yếu khai thác, phát triển nguồn gen nấm C.takaomontana vẫn khai thác từ tự nhiên nên giá thành rất cao. tạo quả thể giàu hoạt chất sinh học, sử dụng làm Cordyceps militaris (L. ex Fr) Link đã được nghiên cứu nguyên liệu cho ngành dược có ý nghĩa khoa học nuôi nhân tạo trên quy mô lớn ở một số nước và mang tính ứng dụng cao, góp phần nâng cao như Trung Quốc, Nhật Bản, ái Lan, Hàn Quốc sức khỏe cộng đồng và đặt cơ sở cho sự phát triển (Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008). một số ngành nghề mới đầy tiềm năng. Trong khi đó, một số nghiên cứu đã cho thấy, II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU C.takaomontana có đầy đủ các hợp chất sinh học quý, giống như trong C. militaris và C. sinensis 2.1. Vật liệu nghiên cứu tuy hàm lượng thấp hơn. Đặc biệt, dẫn xuất nhóm - Mẫu vật: Mẫu thể quả nấm ký sinh côn trùng acetoxyscirpenol chỉ tìm thấy trong C. takaomontana được thu thập từ Vườn Quốc gia Hoàng Liên, có tác dụng diệt nhiều loại tế bào ung thư với giá trị Lào Cai năm 2014. IC50 ở mức ng/ml (Yahagi et al., 1985; Kikuchi - Môi trường phân lập: Sử dụng môi trường PDA: et al., 2004) và mạnh hơn so với thuốc chữa ung khoai tây 200g/l, đường glucoza 20g/l, agar 20g/l. 1 Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2 Học viện Nông nghiệp Việt Nam 19
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(62)/2016 2.2. Phương pháp nghiên cứu HPLC (High-performance liquid chromatography). 2.2.1. Phân lập iết lập đường chuẩn định lượng của beauvericin, Chủng Cordyceps sp. được phân lập theo adenosin (Sigma). phương pháp bào tử đơn (Choi và cộng sự, 1999), 2.2.5. Phân tích trình tự ITS của gen mã hóa có một số cải tiến để phù hợp với điều kiện Việt DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp Nam. Nuôi 25°C trong 5 ngày ở điều kiện tối. của Gardes và cộng sự (1993), sử dụng cặp mồi 2.2.2. Lựa chọn môi trường tối ưu ITS1 (5’- GTT CCG TAG GTG AAC CTG C- 3’) Khuẩn lạc trên môi trường thạch được cấy và ITS2 (5’- ATA TGC TTA AGT TCA GCG GGT - 3’) vào bình tam giác 250ml chứa 100 ml môi trường cho phản ứng PCR. Phản ứng được thực hiện lỏng HHL1 (glucose 25g/l, cao nấm men 5 g/l, trong 20 μl với thành phần bao gồm đệm PCR 10x, pepton 10g/l, KH 2PO 4 1g/l, MgSO 4 0,5 g/l); MgCl2 2mM, dNTP 2mM, primer 2,5mM, HHL2 (glucose 15g/l, pepton 2 g/l, KH2PO4 2 Taq 0,5u (5 u/1μl), ADN 20 ng, nước. Sản phẩm g/l, MgSO4 1,5 g/l, Amoni Citrate 1,5g/l); HHL3 PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (glucose 60g/l, pepton 5g/l, KH2PO4 2g/l, MgSO4 sau đó được tinh sạch và đọc trình tự trên máy 50 g/l, Amoni Citrate 1,5g/l, CaCl2 1g/l), nuôi lắc ABI PRISM 3100 – Avant Data Collection v1.0 150 vòng/phút ở 25°C trong 7 ngày. Kiểm tra mật tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen độ bào tử vào các ngày nuôi 3, 5, 7 và lựa chọn ở Viện Công nghệ sinh học, kết quả được phân môi trường sinh bào tử có nồng độ cao. tích bằng phần mềm CLUSTALX (1.81) và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen bằng Môi trường cho lên men bề mặt bao gồm gạo chương trình BLAST. (Chen et al., 2004) lứt và chất dinh dưỡng có glucoza, pepton, một số nguyên tố đa vi lượng. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.2.3. Xác định tốc độ sinh trưởng 3.1. Phân lập nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp. A9 Tốc độ sinh trưởng của chủng C. takaomontana Chủng A9 được phân lập từ mẫu nấm ký sinh A9 được đánh giá theo nồng độ bào tử bằng côn trùng thu thập ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên, phương pháp dùng buồng đếm Burker-Turk. Lào Cai. Trên môi trường PDA khuẩn lạc của Xác định trọng lượng tươi của thể quả tại các chủng B6 (Hình 1: A và B) có màu trắng tinh, thời điểm thu hoạch. hệ sợi xốp mịn, mọc tỏa tròn. Khi quan sát dưới 2.2.4. Định lượng adenosine và beauvericin kính hiển vi quang học, các tế bào có hình ovan, Định lượng hoạt chất adenosine và beauvericin xếp sát nhau (Hình 1: C). Sau khi phân lập, trong thể quả nấm bằng sắc khí lỏng cao áp chủng A9 lưu giữ lạnh. A B C Hình 1. Hình ảnh khuẩn lạc và bào tử của chủng A9 A: Khuẩn lạc ria; B: Khuẩn lạc chấm điểm; C: Bào tử của chủng A9 dưới kính hiển vi quang học x40 3.2. Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa ITS1-5.8S-ITS2 AND của mẫu nấm A9 được dùng làm khuôn để nhân đoạn gen ITS bằng cặp mồi ITS1 và ITS2. Kết quả PCR thể hiện trên hình 2 cho thấy sản phẩm gọn, có kích thước khoảng 560 bp, phù hợp với tính toán theo lý thuyết. 20
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(62)/2016 560 bp Codyceps takaomontana - SeqA9 Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR M. Maker của Fementas Hình 3. Sơ đồ cây phân loại 1. Sản phẩm PCR của mẫu A9 Sản phẩm PCR được tinh sạch và được xác (Kikichi H. và cộng sự, 2004), Phạm Quang u định trình tự trên máy ABI PRISM 3100 - Avant và cộng sự, 2010). Vì vậy, có thể kết luận chủng Data Collection v1.0. Kết quả nhận được một A9 là Cordyceps takaomontana. phân đoạn gen có kích thước 591 bp, được phân 3.2. Lựa chọn môi trường lỏng hoạt hóa giống tích bằng phần mềm CLUSTALX (1.81) và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen bằng Môi trường hoạt hóa giống là nhân tố then chương trình BLAST, xây dựng cây phân loại chốt ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát (Hình 3). eo đó với độ tương đồng 99% có triển và sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học của 5 trình tự Cordyceps takaomontana, 34 trình tự vi sinh vật nói chung và của nấm ký sinh côn Isaria tenuipes, 9 trình tự Paecilomyces tenuipes, trùng nói riêng. Quá trình hoạt hóa giống được 2 trình tự Isaria japonica. Nhiều nghiên cứu và tiến hành trên 3 môi trường HHL1, HHL2, HHL3 phân tích trình tự DNA đã khẳng định Isaria (Hình 4). Khả năng sinh trưởng của chủng được tenuipes, Paecilomyces tenuipes, Isaria japonica đánh giá qua chỉ tiêu về nồng độ bào tử sau 3, 5, đều là thể vô tính của Cordyceps takaomontana 7, 9, 11 ngày nuôi (Bảng 1). Bảng 1. Khả năng sinh bào tử của chủng A9 trên các môi trường khác nhau Mật độ bào tử theo ngày Ngày nuôi Ngày nuôi Ngày nuôi Ngày nuôi Ngày nuôi thứ 3 thứ 5 thứ 7 thứ 9 thứ 11 Môi trường HHL1 3,70±0,3 x 103 6,30±0,3 x 104 5,00±0.1 x 106 6,70±0,3 x 108 4,00±0.3 x 1010 HHL2 1,70±0,3 x 103 4,70±0,3 x 104 4,00±0,1 x 106 5,00±0,2 x 107 3,30±0,6 x 108 HHL3 1,00±0,2 x 102 3,00±0,5 x 103 4,30±0,3 x 104 4,00±0,5 x 105 2,70±0,3 x 106 Số liệu xử lý trên Anova one way có P< 0,05. Kết quả ở bảng 1 cho thấy, vào ngày thứ 3, mật trường HHL3 vẫn có giá trị nhỏ nhất là 4,30 x 104 độ bào tử trên môi trường HHL3 là ít nhất, đạt bào tử/ml, đạt giá trị lớn nhất trên môi trường 102 bào tử/ml. Trong khi đó, mật độ bào tử trên môi HHL1 là 5,00 x 106 bào tử/ml. Tại ngày nuôi thứ trường HHL1 là 3,70 x 103 bào tử/ml và trên môi 5 và thứ 7, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 trường HHL2 là 1,70 x 103 bào tử/ml. Đến ngày và HHL2 có giá trị gần nhau, tương ứng với 104 nuôi thứ 5, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 bào tử/ml và 106 bào tử/ml. Giá trị này của môi đạt giá trị là 6,30 x 104 bào tử/ ml, theo sau là môi trường HHL1 và HHL2 gấp 10 và 100 lần so với trường HHL2 với mật độ bào tử đạt 4,70 x 104 bào môi trường HHL3 (tương ứng là 103 bào tử/ml và tử/ml, và môi trường HHL3 với 3,00 x 103 bào tử/ml. 104 bào tử/ml). Đến ngày nuôi thứ 9, mật độ bào Tại ngày nuôi thứ 7, mật độ bào tử trên môi tử trên môi trường HHL1 đạt 6,70 x 108 bào tử/ml, 21
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(62)/2016 trong khi môi trường HHL2 đạt 5,00 x 107 bào độ bào tử thấp. Hai môi trường HHL1 và HHL2 tử/ml và môi trường HHL3 đạt 4,00 x 105 bào tử/ có nồng độ các chất gần giồng như nhau, nhưng ml. Tại ngày thứ 11, mật độ bào tử vẫn đạt giá HHL1 giàu nguồn N hữu cơ hơn so với HHL2, trị lớn nhất trên môi trường HHL1 là 4,00 x 1010 do đó nồng độ bào tử trong môi trường HHL1 bào tử/ml, có giá trị nhỏ nhất trên môi trường cao hơn so với môi trường HHL2. Như vậy, môi HHL3 là 2,70 x 106 bào tử/ml. Môi trường HHL3 trường hoạt hóa lỏng HHL1 là thích hợp cho quá có lượng muối và đường cao nên gây ức chế trình sinh bào tử của C. takaomontana A9 nên khả năng sinh bào tử của chủng A9, nên nồng được lựa chọn cho hoạt hóa giống. Hình 4. Hoạt hóa giống Hình 5. ể quả 3.3. Lựa chọn môi trường dinh dưỡng lỏng DD3, đạt 1,02 mg/g và thấp nhất là môi trường trong lên men bề mặt DD1, chỉ đạt 0,81 mg/g. ể quả (Hình 5) sau khi thu hoạch, được làm Từ thể quả, hàm lượng beauvericin của chủng khô bằng thiết bị đông khô, sau đó được định lượng C. takaomontana A9 đạt trung bình khoảng adenosine và beauvericine. Kết quả trình bày ở bảng 2. 1,17 mg/g, cao hơn so với chủng có nguồn gốc Bảng 2. Hàm lượng adenosine và beauvericine ái Lan (0,915 mg/g) khi các tác giả trong công trong sinh khối lên men rắn bố, cũng lên men trên môi trường rắn. Còn, ở chủng tự nhiên ái Lan hàm lượng beauvericine Môi trường DD1 DD2 DD3 dao động từ 0,0056 đến 0,038 mg/g (Sumalee Chỉ tiêu Supothina và cộng sự, 2011). Như vậy, hàm lượng Khối lượng thể 12,63±1,64 16,60±0,54 14,60±0,73 beauvericine từ C. takaomontana A9 Việt Nam quả tươi/lọ (g) cao hơn so với chủng C. takaomontana có nguồn Adenosine 0,32±0.001 0,76±0.002 0,59±0.002 gốc ái Lan khi lên men trên môi trường rắn. (mg/g) Beauvericine IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 0,81±0.015 1,68±0.034 1,02±0.023 (mg/g) 4.1. Kết luận Số liệu xử lý trên Anova one way có P< 0,05 1. Phân lập thành công và nuôi trồng ổn Kết quả bảng 2 cho thấy, khối lượng thể quả định chủng nấm ký sinh côn trùng A9 thuộc chi trên môi trường DD2 đạt cao nhất là 16,60 g/lọ, Cordyceps spp. từ Vườn Quốc gia Hoàng Liên, sau đó đến môi trường DD3 đạt 14,60 g/lọ, thấp Lào Cai. nhất là môi trường DD1 12,63 g/lọ. Hàm lượng 2. Chủng A9 được hoạt hóa tốt nhất trong môi adenosine của sinh khối thu từ môi trường DD1 trường lỏng HHL1 (glucose 25g/l, cao nấm men có giá trị thấp nhất, chỉ 0,32 mg/g, còn ở môi 5 g/l, pepton 10g/l, KH 2PO4 1g/l, MgSO4 0,5 g/l). trường DD3, hàm lượng adenosine gấp 1,8 lần, 3. Khi nuôi trên môi trường rắn ở điều kiện đạt 0,59 mg/g. Môi trường DD2 cho hàm lượng phù hợp, khối lượng thể quả đạt 16,60 g tươi/lọ, adenosine cao nhất, đạt 0,76 mg/g. hàm lượng adenosine 0,76 mg/g và beauvericine Từ bảng 2 cũng thấy, hàm lượng beauvericine 1,68 mg/g khô sau 45 ngày nuôi. thu được từ sinh khối trên môi trường DD2 là 4. Dựa vào kết quả phân tích trình tự nucleotide cao nhất, đạt 1,68 mg/g. Tiếp đến là môi trường của đoạn gen mã hóa ITS1-5.8S-ITS2 đã xác định 22
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(62)/2016 được tên khoa học của chủng Cordyceps sp. A9 là Gardes M, Bruns TD, 1993. ITS - primers with Cordyceps takaomontana. enhanced speci city for basidiomycetes - application to the identi cation of mycorrhizae and rusts. 4.2. Đề nghị Mol Ecol. 2 (2): 113-8. Tiếp tục phân tích các hoạt chất sinh học có Kikuchi H. Miyagawa Y, Nakamura K, Sahashi Y, giá trị khác. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán Inatomi S, Oshima Y, 2004. A novel carbon skeletal trường diễn của sản phẩm thể quả. trichothecane, tenuipesine A, isolated from an entomopathogenic fungus, Paecilomyces tenuipes. LỜI CẢM ƠN Org Lett. 25; 6 (24): 4531-3. Công trình hoàn thành với kinh phí của đề tài Nam KS, Jo YS, Kim YH, Hyun JW, Kim HW, 2001. “Khai thác và phát triển nguồn gen nấm Cordyceps Cytotoxic activities of acetoxyscirpenediol and takaomontana Yakush Kumaz làm dược liệu” ergosterol peroxide from Paecilomyces tenuipes. thuộc NVQG 2014-2017. Life Sci. 1; 69 (2) : 229-3. TÀI LIỆU THAM KHẢO Qinggui Wang và Lijian Xu, 2012. Beauvericin, a bioactive compound produced by fungi: a short Trần Ngọc Lân, 2008. Đa dạng sinh học nấm ký sinh review. Molecules. 24; 17 (3): 2367-77. côn trùng ở vuồn Quốc Gia Pù Mát và đánh giá khả năng ký sinh của một số loài nấm đối với loài Supthina S., Srisamoh U., Nithithanaslip S., sâu hại cây trồng. Đề tài cấp bộ Giáo dục và đào tạo. Tasanathai K., Luangsa-Ard JJ., Chu-Ruli, Isak.M, Mã số: B2007-27-25. 2011. Beauvericin production by the Lepidoptera pathogenic fungus Isaria tenuipes: Analysis of Phạm Quang u, Nguyễn Mạnh Hà, 2010. Phát hiện natural specimens, synnemata from cultivation, nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps takaomontana and mycelia from liquid-media fermentation, Takushui và Kummazawa ở Việt Nam. Tạp chí Nat. Prod. Bioprospect., 1, 112–115. Nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 6, 126-130. Yahagi S, 1985. An experimental study on cartilage Chen N, 2004. Using RepeatMasker to identify repetitive and the morphogenesis induced by implanted elements in genomic sequences, Curr Protoc demineralized dentin matrix, Shikwa Gakuho. Bioinformatics, Chapter 4. Unit 4.10. 85 (2): 135-65. Choi, Y.W, Hyde, K.D, and Ho, W.H, 1999. Singe spore isolation of fungi. Fungal Diversity 3: 29-38. Isolation of insect parasitic fungi Corrdyceps spp. rich bioactive substances from Hoang Lien National Park, Lao Cai Do Tien Manh, Nguyen i anh Lan, Đinh i Ngoc uy, Nguyen Huu Duc, Nguyen ị anh Bình Abstract Insect parasitic fungi Cordyceps sp. A9 was isolated from 15 samples of fungi on insect hosts pupae of Lepidoptera from Hoang Lien National Park, Lao Cai. A9 strain was best activated in HHL1 liquid medium; spore density reached 5.00 x 106 cells /ml a er 7 days of culture. A er fermentation the surface in optimum conditions, the weight of fresh synema per jar was 16.6 g and adenosine reached 0.76 mg/g, beauvericine contents reached 1.68 mg/g dried a er 45 days of cultivation. ITS sequencing data of A9 strain was achieved 99% homology with the corresponding genes of the species Cordyceps takaomontana. With high concentration of beauvericin, Cordyceps takaomontana A9 strain was considered to be a prospective for the development of functional food and medicine. Keywords: Adenosine, Beauvericin, Cordyceps takaomontana, insect parasitic mushroom, pharmacy material Ngày nhận bài: 3/12/2015 Ngày phản biện: 20/12/2015 Người phản biện: PGS.TS. Phạm Xuân Hội Ngày duyệt đăng: 10/1/2016 23
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(62)/2016 VI KHUẨN TRONG LÊN MEN HẠT CACAO BẰNG THÙNG GỖ TẠI ĐĂKLĂK Phan anh Bình1, Nguyễn Văn Phương1, Nguyễn ị oa1, Phạm Văn ao1, Trần ị ắm Hà 1, Võ Văn ắng1 TÓM TẮT Vi khuẩn là một trong những nhóm vi sinh vật có vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình lên men hạt cacao, trong đó nhóm vi khuẩn chính Acetobater tham gia vào quá trình oxy hóa rượu etylic, được tạo ra bởi hoạt động của nấm men, để tạo thành acid acetic. Trong quá trình lên men hạt cacao acid acetic kết hợp với nhiệt độ cao được tạo thành do các phản ứng chuyển hóa các hợp chất sinh học sẽ làm chết mầm hạt và phá vỡ các cấu trúc của tế bào để các hợp chất hóa học tác dụng với nhau làm chuyển hóa màu sắc và tạo nên chất lượng của hạt cacao cuối cùng. Phương pháp phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA đối với một số dạng vi khuẩn được sử dụng để xác định các loài vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm cho thấy số lượng tế bào vi khuẩn biến thiên từ 1,8 x 104 đến 7,2 x 107CFU/g. Đã phân lập được 11 dạng khuẩn lạc có hình thái khác nhau thuộc 7 loài, bao gồm: 3 loài có tác dụng chuyển hóa etanol, manitol thành a xít acetic và có thể xúc tác thủy phân và ô xy hóa tới CO2 và H2O là Acetobacter tropicalis, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter indonesiensis, 1 loài ít gặp trong quá trình lên men hạt cacao là Acinetobacter. Đặc biệt có 3 loài chưa có nghiên cứu nào trong lên men hạt cacao đề cập tới là Microbacterium oxydans, Sphingomonas melonis và Serratia marcescens. Từ khóa: Acetobacter, cacao, cơm nhầy, lên men, vi khuẩn. I. ĐẶT VẤN ĐỀ II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trong quá trình lên men hạt cacao có 4 nhóm 2.1. Vật liệu nghiên cứu vi sinh vật chính tham gia là nấm men, vi khuẩn - Vật liệu: Quả cacao thuộc giống Forastero và sinh acid lactic, vi khuẩn sinh acid acetic và Bacillus Trinitario được lấy từ công ty Eakmat, Buôn Ma (Ardhana và Fleet, 2003). Nấm men và vi khuẩn uột, Đắk Lắk, niên vụ 2011 – 2012. sinh acid lactic chiếm ưu thế trong giai đoạn đầu - Môi trường phân lập vi khuẩn (Drysdale và của quá trình lên men (từ 0 – 48h), nấm men Fleet, 1988; Ardhana và Fleet, 2003). tham gia vào quá trình chuyển hóa đường trong lớp cơm nhầy thành rượu etylic và quá trình - YGC Agar: glucose 50g/l (Merk), yeast phân cắt các pectine làm cho lớp cơm nhầy tan extract 10g/l (Merk), CaCO3 30g/l (Merk), agar ra (Cleenwerck và cs, 2007). Vi khuẩn acetic và 20g/l, 0.1% cycloheximide, 50mg/l penicillin Bacillus có ưu thế trong giai đoạn sau 48 giờ và (Sigma), pH = 5,6. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ chủ yếu chuyển hóa rượu thành acid acetic, tạo 250C trong thời gian từ 5 – 8 ngày. hương vị và màu sắc cho hạt. - Môi trường quan sát hình thái tế bào và Một số vi khuẩn chính như nhóm Acetobacter khả năng di động (Nielsen, 2007). có loài pasteuriansis là loài vi khuẩn tự phát - Môi trường lỏng YG ở nhiệt độ 250C trong chính tham gia vào trong quá trình lên men hạt thời gian từ 3 – 4 ngày. cacao; chúng có khả năng thích nghi với acid và - Nhuộm gram: Bằng phương pháp nhuộm nhiệt độ cao, có khả năng chiếm ưu thế khi trong kép theo phương pháp Christian Gram. khối ủ có chứa acid lactic và manitol (Camu và cs, 2008). Nhóm vi khuẩn sản sinh acid acetic 2.2. Phương pháp nghiên cứu có mật độ cao như: A. syzygii, A. Pasteurianus 2.2.1. Phân lập vi khuẩn từ khối ủ cacao và A. tropicalis luôn hiện diện trong suốt quá Tiến hành đập quả lấy hạt, ủ trong thùng gỗ, trình lên men (Nielsen và cộng sự). trong nghiên thời gian ủ 6 ngày, 2 ngày đảo hạt 1 lần và lấy mẫu cứu này chúng tôi đã phân lập và xác định bằng theo từng ngày, mỗi lần lấy khoảng 200 g mẫu biện pháp sinh học phân tử một số loài vi khuẩn hạt tại 5 vị trí theo đường chéo và ở độ sâu 10cm chính, tham gia vào quá trình lên men hạt cacao trong khối ủ. Tách phần cơm nhầy, nghiền mịn tại Đaklak để làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu và trộn đều, pha loãng nuôi cấy 2 - 8 ngày ở nhiệt hơn về qui trình lên men và sự tạo thành chất độ 250C, đếm và xác định mật độ vi khuẩn sinh lượng hạt cacao tại Việt Nam. acid acetic (VA). 1 Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên 24

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.