zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Nông - Lâm - Ngư

» Nông nghiệp

Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Lasiodiplodia theobromae gây bệnh chết khô cành trên nho tại Hà Nội và Hưng Yên

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Báo xấu

7
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xác định tác nhân, đặc điểm sinh học của loài nấm gây bệnh dieback trên nho tại Hà Nội và Hưng Yên, làm cơ sở để xây dựng biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả và bền vững.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Lasiodiplodia theobromae gây bệnh chết khô cành trên nho tại Hà Nội và Hưng Yên

Vietnam J. Agri. Sci. 2024, Vol. 22, No. 1: 58-69 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2024, 22(1): 58-69 www.vnua.edu.vn PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Lasiodiplodia theobromae GÂY BỆNH CHẾT KHÔ CÀNH TRÊN NHO TẠI HÀ NỘI VÀ HƯNG YÊN Đặng Thị Thanh Tâm, Đỗ Thúy Hiền, Nguyễn Thanh Huyền* Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: thanhhuyen@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 30.08.2023 Ngày chấp nhận đăng: 25.12.2023 TÓM TẮT Bệnh chết khô cành (dieback) là một trong những bệnh gây hại phổ biến trên nho. Bệnh do nấm thuộc họ Botryosphaeriaceae gây ra, trong số đó, Lasiodiplodia theobromae là loài nấm có độc lực cao nhất. Hiện nay, biện pháp xử lý bệnh này còn gặp nhiều khó khăn và chưa thực sự hiệu quả. Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xác định tác nhân, đặc điểm sinh học của loài nấm gây bệnh dieback trên nho tại Hà Nội và Hưng Yên, làm cơ sở để xây dựng biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả và bền vững. Từ các mẫu nho có biểu hiện triệu chứng của bệnh dieback thu thập tại Hà Nội và Hưng Yên, 3 chủng nấm bệnh đã được phân lập và được sử dụng để lây nhiễm nhân tạo trên lá và thân cây nho. Kết quả cho thấy, chủng CK1 và DN1 có đặc điểm hình thái hệ sợi nấm, cũng như khả năng gây bệnh giống nhau, do đó chủng CK1 được tuyển chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Qua phương pháp định danh phân tử với cặp mồi ITS1/ITS4, chủng CK1 được xác định thuộc loài Lasiodiplodia theobromae và được đặt tên là L. theobromae CK1. Chủng L. theobromae CK1 thể hiện khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường PDA, ở điều kiện nhiệt độ 35C và pH 6-8. Ngoài ra, chủng nấm này còn có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase, xylanase và pectinase. Từ khóa: Bệnh dieback, Lasiodiplodia theobromae, nho. Isolation and Characterization of Lasiodiplodia theobromae Strain Causing Dieback Disease on Grape in Ha Noi and Hung Yen ABSTRACT Dieback is one of the most common diseases on grape that is caused by fungi belonging to the Botryosphaeriaceae family. Among these fungi, Lasiodiplodia theobromae has been identified as the most virulent species. Unfortunately, the current treatments for this disease are still challenging and not truly effective. This study was conducted to determine the causative agent and biological characteristics of the grape dieback-causing fungus in Hanoi and Hung Yen as a basis for guiding effective measures in the prevention and treatment of dieback. From grape samples showing dieback disease collected in Hanoi and Hung Yen, three fungal strains were isolated through culture on the PDA medium and these strains were subsequently re-infected onto leaves and stems of grapes. Among them, CK1 and DN1 strains showed similar mycelial characteristics and pathogenicity. Therefore, the CK1 strain was selected for further experiments. Through the molecular identification method with the ITS1/ITS4 primer pair, the CK1 strain was confirmed asLasiodiplodia theobromae and was named L. theobromae CK1. L. theobromae CK1 exhibited good growth on the PDA medium, and the optimal conditions for the strain were 35C and a pH in the range of 6-8. In addition, during its growth, this fungal strain was also capable of producing cellulase, xylanase, and pectinase. Keywords: Dieback, grape, Lasiodiplodia theobromae. Theo Tổ chĀc LþĄng thăc và Nông nghiệp Liên 1. ĐẶT VẤN ĐỀ hĉp quốc (FAO), sân lþĉng nho trên toàn thế giĆi Nho (Vitis sp., Vitaceae) là một trong nhĂng đät khoâng 75 triệu tçn mỗi nëm. Trong đò, 71% loäi cåy ën quâ quan trọng có giá trð dinh dþĈng nho đþĉc dùng làm nguyên liệu sân xuçt rþĉu cao và đþĉc trồng ć nhiều quốc gia trên thế giĆi. vang, 27% dùng tþĄi và 2% sçy khô (Khan & cs., 58
Đặng Thị Thanh Tâm, Đỗ Thúy Hiền, Nguyễn Thanh Huyền 2020). Trung Quốc, Pháp, Hoa KĊ, Nam Phi, Ý, Bệnh dieback là một loäi bệnh xây ra khá Chile, Iran, Thổ Nhï KĊ, Tây Ban Nha và phổ biến trên nho đã ânh hþćng đến nghề trồng Argentina là mþąi quốc gia có diện tích trồng nho nho trên toàn thế giĆi, làm giâm sút đáng kể lĆn nhçt trên thế giĆi (Khan & cs., 2020). Gæn nëng suçt nho (Wine-Australia, 2018). Cý thể, ć đåy, diện tích và sân lþĉng nho đþĉc trồng ć châu Tây Ban Nha, tỷ lệ míc bệnh dieback ć các vþąn Á đang tëng dæn lên. Trung Quốc, Ấn Độ, Nhêt nho tëng tÿ 1,8% (2003) lên 10,5% (2007) (Rubio Bân, Hàn Quốc, Pakistan, Thái Lan và Việt Nam & Garzón, 2011); Ở Pháp, thiệt häi do bệnh là nhĂng quốc gia có sân lþĉng nho đáng kể ć dieback gây ra khoâng 1 tỷ euro mỗi nëm khu văc châu Á (FAO, 2021). (Fontaine & cs., 2016). Loài nçm Lasiodiplodia Ở Việt Nam, có nhiều vùng trồng nho, trong theobromae đþĉc xác đðnh là một tác nhân gây đò Ninh Thuên là tînh có diện tích trồng nhiều bệnh dieback vĆi độc lăc cao trên nho. Ban đæu nhçt (Le Quang Quyen & Long, 1999) vĆi tổng nçm xâm nhêp vào hệ thống mäch cûa nho chû sân lþĉng thu đþĉc hàng nëm đät khoâng yếu qua vết thþĄng và gåy ra vết loét và hoäi tā, 26.000-28.000 tçn nho tþĄi (Vietnamplus, tÿ đò khiến cây nho chêm phát triển và chết 2023). Theo ghi nhên cûa Sć NN&PTNT tînh (Rangel & cs., 2021). Cây nho khi bð nhiễm nçm Ninh Thuên, nëm 2023 giá trð sân xuçt hàng L. theobromae có các triệu chĀng điển hình nhþ: nëm cûa cây nho đät 19-20% tổng giá trð sân hóng chồi, lá héo úa, cành và thân bð hoäi tā xuçt trong ngành trồng trọt (Vietnamplus, hoặc chết khô (Larignon, 2001; Rodríguez- 2023). Gæn đåy, nhiều hộ gia đình ć một số tînh Gálvez & cs., 2015). Hiện nay, có nhiều biện miền Bíc trong đò cò Hà Nội và Hþng Yên cüng pháp phòng trÿ bệnh häi trên cåy nho nhþng đã nhên ra giá trð cûa quâ nho và bít đæu trồng biện pháp sā dýng thuốc hóa học đþĉc áp dýng thā nghiệm loäi cây này. Mặc dù chþa cò thống rộng rãi do có tác dýng nhanh (Wine-Australia, kê chi tiết về diện tích và sân lþĉng nho cûa các 2018). Tuy nhiên, việc sā dýng thuốc hóa học hộ gia đình ć hai đða phþĄng này, nhþng nhiều lâu dài gây ra nhĂng hêu quâ nghiêm trọng cho vþąn nho nhþ Chimi Farm 4 (Đông Anh, Hà sĀc khóe. HĄn nĂa, các nghiên cĀu về bệnh Nội), vþąn nho cûa ông Nguyễn HĂu KĊ (Đan dieback do nçm L. theobromae gây ra trên nho Phþĉng, Hà Nội), vþąn nho sĂa Hàn Quốc và còn khá hän chế. Do đò, nghiên cĀu này đþĉc nho móng tay cûa anh Nguyễn Vën Duy (Khoái thăc hiện nhìm đánh giá các đặc tính cûa chûng Chåu, Hþng Yên), vþąn nho Hä đen cûa anh nçm L. theobromae gây bệnh chết khô cành Nguyễn Vën Đôn (Yên Mỹ, Hþng Yên) (Minh (dieback) và cung cçp thông tin hĂu ích để tìm SĄn, 2021; Hồng Ngọc, 2022; Hồng Ngọc & Đào ra giâi pháp khíc phýc mĀc độ ânh hþćng cûa HþĄng, 2022; PhþĄng Thâo, 2023) đã đþĉc ghi bệnh, cüng nhþ duy trì giá trð dinh dþĈng cûa nhên là nhĂng vþąn nho cho hiệu quâ kinh tế nho và không làm ânh hþćng đến sĀc khóe cûa cao. Có thể thçy rìng nho có giá trð kinh tế lĆn, ngþąi tiêu dùng. nhþng nëng suçt và chçt lþĉng cûa cây nho ć nhiều nþĆc đang bð giâm sút do một số bệnh häi nhþ sþĄng mai, thán thþ, đốm lá, phçn tríng và 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU dieback (Goldammer, 2018; Sanghavi & cs., 2.1. Vật liệu 2021). Ở Việt Nam, việc trồng nho cüng bð ânh hþćng nặng nề bći các bệnh dðch. Cý thể, Ninh Méu lá và cành cûa cây nho bð bệnh đþĉc Thuên là đða phþĄng trồng nho lĆn nhçt câ nþĆc thu thêp tÿ khu văc trồng nho thuộc tînh Hþng vĆi 2.000ha vào nëm 1995, nhþng do tình hình Yên và Hà Nội vĆi các triệu chĀng điển hình phát triển cûa sâu bệnh häi và một số nguyên cûa bệnh dieback nhþ lá héo úa và xuçt hiện nhân khác khiến cho diện tích trồng nho cûa các đốm màu nâu, cây phát triển còi cọc, chồi Ninh Thuên giâm sút và hiện nay Ninh Thuên non và cành bên chết khô, thân hoặc cành bên đang phçn đçu đến nëm 2030 diện tích này tëng bð thối mýc (Larignon, 2001; Rodríguez-Gálvez lên 1.700ha (CĄ Nguyên, 2023). & cs., 2015). 59
Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Lasiodiplodia theobromae gây bệnh chết khô cành trên nho tại Hà Nội và Hưng Yên 2.2. Phương pháp nghiên cứu cûa bệnh dieback đþĉc sā dýng để phân lêp nhìm tìm ra tác nhân gây bệnh. Sau đò, so sánh 2.2.1. Thu nhập mẫu nho bệnh và phân các đặc điểm cûa tác nhân gây bệnh này vĆi các lập nấm chûng nçm sā dýng trþĆc khi lây nhiễm nhân Méu nho bệnh có biểu hiện cûa bệnh dieback täo, tÿ đò cò thể khîng đðnh chính xác chûng đþĉc thu thêp và chuyển về phòng thí nghiệm Bộ nçm gây bệnh dieback trên nho. môn Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam để thăc 2.2.3. Xác định các đặc điểm hình thái nấm hiện thí nghiệm phân lêp nçm gây bệnh. Đặc điểm hình thái cûa chûng nçm đþĉc Méu bệnh đþĉc rāa säch bìng nþĆc nþĆc xác đðnh theo phþĄng pháp cûa (Oyeleke & máy, khā trùng bề mặt bìng dung dðch NaOCl Manga, 2008). Khối thäch nçm cò đþąng kính 2,5% trong 2 phút và rāa läi bìng nþĆc cçt vô 5mm lçy tÿ tân nçm sau khi nuôi cçy 5 ngày trùng 3 læn, sau đò đặt trên giçy thçm đã hçp đþĉc đặt vào giĂa đïa petri chĀa môi trþąng khā trùng để làm khô các méu bệnh. Tiếp theo, PDA và û ć 30C trong 20 ngày. Hình thái sĉi méu bệnh đþĉc đặt trên môi trþąng PDA, û ć nçm và bào tā nçm sau đò đþĉc quan sát dþĆi 30C trong 3 ngày. Quan sát să xuçt hiện tân kính hiển vi quang học. nçm và cçy chuyển hệ sĉi nhiều læn trên môi 2.2.4. Định danh chủng nấm gây bệnh trþąng PDA mĆi để làm thuæn (Rodríguez- Gálvez & cs., 2015). Các chûng nçm sau đò đþĉc Chûng nçm đþĉc nuôi trên môi trþąng PDB bâo quân ć điều kiện 4C để thăc hiện các ć 30C trong 3 ngày, rồi thu sinh khối để tách nghiên cĀu tiếp theo. chiết DNA tổng số theo mô tâ cûa (Masoomi- Aladizgeh & cs., 2016). Sân phèm DNA đþĉc 2.2.2. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo khuếch đäi bìng phân Āng PCR sā dýng cặp Các chûng nçm phân lêp đþĉc đþĉc lây mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) nhiễm nhân täo trên lá và cành nho nhìm kiểm và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTTAT TGATATGC-3’) tra khâ nëng gåy bệnh dieback cûa chúng theo (White & cs., 1990). Sân phèm PCR đþĉc gāi phþĄng pháp cûa (Suwannarach & cs., 2013). Lá đến công ty First BASE (Singapore) để đọc trình và cành nho khóe mänh đþĉc rāa säch bìng tă. Trình tă nucleotide mã hóa vùng ITS1/ITS4 nþĆc máy, khā trùng bìng dung dðch NaOCl cûa chûng nçm nghiên cĀu đþĉc kiểm tra mĀc 2,5% trong 2 phút và rāa läi bìng nþĆc cçt vô độ tþĄng đồng vĆi trình tă nucleotide mã hóa trùng 3 læn. Sau đò, täo vết thþĄng trên các vùng ITS1/ITS4 cûa các chûng nçm khác đã méu nho khóe mänh và đặt khối thäch nçm có đþĉc công bố trên ngân hàng cĄ sć dĂ liệu đþąng kính 5mm lên. Đối vĆi méu đối chĀng, thí Genbank-NCBI bìng công cý BLAST. Sau đò, nghiệm đþĉc thăc hiện tþĄng tă, tuy nhiên chî cåy phát sinh loài đþĉc xây dăng dăa trên mối đặt môi trþąng PDA không chĀa nçm lên vð trí quan hệ di truyền cûa chûng nghiên cĀu sā đã đþĉc täo vết thþĄng cĄ giĆi. Các méu sau khi dýng phæn mềm MEGA X. thăc hiện lây nhiễm đþĉc đặt trong hộp có chĀa giçy lọc vô trùng đã làm èm, û ć 30C trong 5-7 2.2.5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy ngày. Quan sát lá và cành nho tÿng ngày để đến sự sinh trưởng của nấm đánh giá khâ nëng gåy bệnh cûa các chûng Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy: Chûng nçm. Nếu thçy xuçt hiện hiện tþĉng lá bð héo nçm tuyển chọn đþĉc nuôi cçy trên các môi úa, đồng thąi täi các vð trí thăc hiện tái lây trþąng khác nhau (PDA, SDA, MEA và WA) và nhiễm cüng nhþ các mäch thân bð hoäi tā và û ć 30C. Quan sát và xác đðnh đþąng kính tân xuçt hiện hệ sĉi nçm thì có thể kết luên chûng nçm, mêt độ hệ sĉi trên các môi trþąng nghiên nçm nghiên cĀu gây ra bệnh dieback. cĀu khác nhau nhìm tìm ra môi trþąng nuôi cçy Các méu lá và cành nho sau khi thăc hiện thích hĉp cho să sinh trþćng cûa chûng nçm lây nhiễm nhân täo có các biểu hiện đặc trþng nghiên cĀu (Wesley, 2020). 60
Đặng Thị Thanh Tâm, Đỗ Thúy Hiền, Nguyễn Thanh Huyền Ảnh hþćng cûa pH và nhiệt độ nuôi cçy: nghiệm bìng dung dðch lugol 1%. Vùng cĄ chçt Chûng nçm tuyển chọn đþĉc nuôi cçy trên môi bð phân giâi sẽ täo vòng sáng trong suốt xung trþąng thích hĉp vĆi các giá trð pH môi trþąng quanh giếng thäch (Kasana & cs., 2008). Đối khác nhau là 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10 (Latha & cs., vĆi thí nghiệm đối chĀng, nþĆc cçt đþĉc sā 2013), û ć các điều kiện nhiệt độ khác nhau dýng để nhó vào các giếng thäch thay vì dðch (10C, 15C, 20C, 25C, 30C, 35C, 40C) nuôi cçy nçm. (Lumînare & cs., 2021). Quan sát và xác đðnh đþąng kính tân nçm, mêt độ hệ sĉi nhìm tìm ra 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN pH và nhiệt độ nuôi cçy thích hĉp cho să sinh trþćng cûa chûng nçm nghiên cĀu. 3.1. Phân lập nấm gây bệnh dieback trên nho 2.2.6. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào Tÿ nhĂng méu nho có triệu chĀng bệnh dieback đþĉc thu thêp ć Hà Nội và Hþng Yên Chûng nçm đþĉc đánh giá khâ nëng sinh (Hình 1), 03 chûng nçm (CK1, DN1 và DN2) enzyme ngoäi bào bìng phþĄng pháp khuếch tán đïa thäch vĆi các cĄ chçt tþĄng Āng (CMC- đþĉc phân lêp (Bâng 1). Trong đò, chûng nçm cellulase, xylan-xylanase và pectin-pectinase). CK1, DN1 có hệ sĉi dày, khuèn läc bông xốp Chûng nçm đþĉc nuôi lóng trong môi trþąng màu tríng sau đò chuyển dæn sang màu xám và PDB vĆi tốc độ líc 200 vòng/phút ć 30C trong cuối cùng chuyển sang màu nåu đen; Chûng 5 ngày. Sau đò, dðch nuôi cçy đþĉc thu nhên và nçm DN2 cüng cò hệ dày nhþng khuèn läc ć ly tâm vĆi tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 däng bông mðn màu tríng sau đò chî chuyển phút ć 4C. Nhó 100µl dðch sau ly tâm vào các dæn sang xám (Hình 2). Câ ba chûng nçm có tân giếng thäch trên đïa môi trþąng có chĀa cĄ chçt nçm hình trñn và đþąng kính tân nçm tëng dæn và û ć 30C trong 24 gią. Nhuộm các đïa thí theo tÿng ngày. Ghi chú: A: Mẫu bệnh tại Hà Nội; B: Mẫu bệnh tại Hưng Yên. Hình 1. Hình ânh mẫu lá nho nhiễm bệnh dieback thu thập được Bâng 1. Bâng kết quâ phân lập nấm từ các mẫu nho nhiễm bệnh dieback Địa điểm thu thập mẫu Chủng Hà Nội DN1, DN2 Hưng Yên CK1 61
Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Lasiodiplodia theobromae gây bệnh chết khô cành trên nho tại Hà Nội và Hưng Yên Hình 2. Hình ânh tân nấm CK1, DN1 và DN2 trên môi trường PDA sau 20 ngày nuôi cấy Chûng nçm CK1, DN1 và DN2 đþĉc kiểm triển nhanh, bao phû toàn bộ bề mặt môi tra khâ nëng gåy bệnh dieback trên lá và cành trþąng. Hệ sĉi phân nhánh, có vách ngën đþĉc nho khóe mänh thông qua việc lây nhiễm nhân hình thành sau 1 ngày nuôi cçy (Hình 4D), hệ täo. Quan sát kết quâ lây nhiễm qua tÿng ngày sĉi mọc phû kín đïa petri cò đþąng kính 90mm có thể thçy rìng, chûng CK1 và DN1 gây ra sau 3 ngày nuôi cçy. Sĉi nçm ban đæu có màu nhĂng triệu chĀng cûa bệnh dieback trên câ lá tríng, rồi chuyển sang màu xám và sau đò và cành nho. Sau 5 ngày lây nhiễm nhân täo, chuyển thành màu nåu đen (Hình 4A - C). Hình sĉi nçm bít đæu phát triển trên cành, còn lá có ânh bào tā đþĉc quan sát và ghi nhên bìng kính biểu hiện bð héo và ć vð trí đặt nçm chuyển sang hiển vi quang học ć độ phòng đäi 100x sau màu nâu. Vết bệnh lan rộng theo thąi gian và ć 16-18 ngày nuôi cçy (Hình 4E, F). Bào tā có ngày thĀ 7, nçm mọc trên toàn bộ cành nho, sĉi hình elip, ban đæu bào tā có thành màu tríng, nçm bông xốp cò màu nåu đen, lá cò biểu hiện vách móng, sau đò khi bào tā trþćng thành có úa và bít đæu bð thối ć khu văc gân lá. Trong màu nâu sém đến đen, vách ngën dày ć chính khi đò, chûng nçm DN2 không gây ra các triệu giĂa. Kết quâ này tþĄng đồng vĆi kết quâ chĀng cûa bệnh dieback trong 7 ngày thăc hiện nghiên cĀu cûa (Alsaadoon & cs., 2012; Yan & tái lây nhiễm. Các méu nho ć thí nghiệm đối cs., 2013), nçm L. theobromae gây bệnh dieback chĀng không xây ra bçt kĊ triệu chĀng nào trên nho cò đặc điểm hệ sĉi cüng nhþ bào tā trong suốt thąi gian thăc hiện thí nghiệm (Hình giống vĆi chûng CK1. Gnanesh & cs. (2022) 3). Trong thí nghiệm tþĄng tă cûa các tác giâ cüng khîng đðnh, L. theobromae cò đặc điểm hệ Alsaadoon & cs. (2012); Rodríguez-Gálvez & cs. sĉi giống vĆi chûng CK1 và sau 15-20 ngày có (2015) cüng khîng đðnh nçm L. theobromae gây thể quan sát thçy hình thái bào tā hình elip có bệnh dieback có däng sĉi bông, hệ sĉi dày và vách móng và màu nâu sém (Gnanesh & cs., khuèn läc có màu tríng sau đò chuyển sang 2022). Nhþ vêy, bþĆc đæu có thể xác đðnh đþĉc, màu xám, cuối cùng chuyển thành màu nâu chûng nçm CK1 thuộc loài L. theobromae. đen. Khi bð nhiễm nçm, cây nho xuçt hiện hiện tþĉng rýng chồi, úa lá, và các mäch thân bð hoäi 3.3. Định danh chủng nấm CK1 tā. Nhþ vêy, chûng nçm CK1 và DN1 cò các đặc Chûng CK1 đþĉc nuôi cçy trên môi trþąng điểm hình thái và khâ nëng gåy bệnh dieback PDA ć 30C, thu sinh khối, tách chiết DNA và giống nhau, do đò chûng CK1 đþĉc lăa chọn để khuếch đäi trình tă nucleotide sā dýng cặp mồi thăc hiện các thí nghiệm tiếp theo. ITS1/ITS4. Sau khi so sánh vĆi các trình tă nucleotide cûa các chûng nçm đã đþĉc công bố 3.2. Đặc điểm hình thái của chủng nấm trên ngån hàng cĄ sć dĂ liệu Genbank-NCBI và phân lập được xây dăng cây phân loäi dăa trên mối quan hệ di Chûng nçm CK1 đþĉc nuôi cçy trên môi truyền này có thể thçy rìng, chûng CK1 nìm trþąng PDA ć 30C trong 20 ngày, sĉi nçm phát cùng nhánh vĆi chûng Lasiodiplodia 62
Đặng Thị Thanh Tâm, Đỗ Thúy Hiền, Nguyễn Thanh Huyền theobromae strain MG54-1 vĆi giá trð tin cêy 2012; Rodríguez-Gálvez & cs., 2015) cüng đã bootstrap là 100% và có mĀc độ tþĄng đồng xác đðnh đþĉc, chûng nçm L. theobromae là tác 99,80% vĆi trình tă vùng ITS rDNA gene cûa nhân gây bệnh dieback trên nho. Nhþ vêy, chûng L. theobromae strain MG54-1 (Hình 5). chûng nçm CK1 thuộc loài L. theobromae và Trong nghiên cĀu tþĄng tă, (Alsaadoon & cs., đþĉc đặt tên là L. theobromae CK1. Ghi chú: ĐC: Đối chứng. Hình 3. Hình ânh tái lây nhiễm của các chủng nấm phân lập được sau 7 ngày 63
Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Lasiodiplodia theobromae gây bệnh chết khô cành trên nho tại Hà Nội và Hưng Yên Ghi chú: A, B, C: Hình ảnh tản nấm (3, 7, 20 ngày nuôi cấy), B: Hệ sợi nấm (1 ngày nuôi cấy), C: Bào tử chưa trưởng thành (16 ngày nuôi cấy), D: Bào tử trưởng thành (18 ngày nuôi cấy). Hình 4. Đặc điểm hình thái của chủng nấm CK1 Hình 5. Cây phát sinh loài của chủng nấm CK1 3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự 3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy sinh trưởng của chủng L. theobromae CK1 đến sự sinh trưởng của chủng Môi trþąng, nhiệt độ và pH nuôi cçy có ânh L. theobromae CK1 hþćng rçt lĆn đến să sinh trþćng cûa nçm. Do Chûng nçm L. theobromae CK1 đþĉc nuôi đò, trong nghiên cĀu này, việc xác đðnh điều trên 4 môi trþąng khác nhau ć 30C. Kết quâ kiện nuôi cçy thích hĉp cûa chûng cho thçy, chûng L. theobromae CK1 đều có khâ L. theobromae CK1 có thể cung cçp nhĂng nëng phát triển trên câ 4 môi trþąng khâo sát. thông tin hĂu ích cho các nghiên cĀu tiếp theo Trên môi trþąng PDA, chûng nçm CK1 phát nhìm tìm ra biện pháp phñng và điều trð các triển tốt nhçt, hệ sĉi nçm mọc phû kín đïa petri bệnh thăc vêt hiệu quâ. vĆi đþąng kính 90 mm sau 3 ngày nuôi cçy. Mêt 64
Đặng Thị Thanh Tâm, Đỗ Thúy Hiền, Nguyễn Thanh Huyền độ hệ sĉi dày, däng bông xốp và phát triển 3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến mänh. Trên môi trþąng SDA và MEA, chûng phát triển của chủng L. theobromae CK1 nçm L. theobromae CK1 phát triển chêm hĄn vĆi Chûng nçm L. theobromae CK1 đþĉc nuôi đþąng kính tân nçm læn lþĉt là 86,87 ± 1,51mm trên môi trþąng PDA và û ć các nhiệt độ khác và 83,83 ± 1,23mm sau 3 ngày nuôi cçy. Mêt độ nhau (10, 15, 20, 25, 30, 35 và 40C). Sau 3 ngày hệ sĉi thþa hĄn và kém bông xốp hĄn trên môi nuôi cçy, quan sát thçy tốc độ phát triển cûa trþąng PDA. Trên môi trþąng WA, chûng nçm chûng nçm là khác nhau. Cý thể, chûng nçm nghiên cĀu phát triển kém nhçt vĆi đþąng kính CK1 có khâ nëng phát triển trong khoâng nhiệt tân nçm là 15,33 ± 1,46mm. Mêt độ hệ sĉi rçt độ tÿ 15-35C vĆi đþąng kính tân nçm læn lþĉt thþa thĆt và khò quan sát đþĉc (Hình 6A-B). là 15,7 ± 2,36mm (15C) 87,73 ± 1,46mm (20C), NhĂng nghiên cĀu trþĆc đåy đã chĀng minh môi 89,3 ± 0,61mm (ć 25C), 90mm (30-35C) (Hình trþąng nuôi cçy có ânh hþćng tĆi tốc độ phát 7B). Tuy nhiên, hệ sĉi nçm phát triển nhanh và triển và hình thái khuèn läc cûa các chûng nçm. mänh nhçt ć điều kiện 30-35C, sĉi nçm bít Cý thể, trong nghiên cĀu cûa Saha & cs. (2008) và Latha & cs. (2013) đã cho thçy, nçm đæu hình thành sau 1 ngày, sau 3 ngày chûng L. theobromae gây bệnh dieback trên nho cüng nçm này mọc kín đïa, mêt độ hệ sĉi dày và cò đặc điểm sinh trþćng khác nhau trên các môi khuèn läc có däng bông tríng (Hình 7A). Trong trþąng khác nhau, nçm phát triển tốt nhçt trên đò, mêt độ hệ sĉi khi nuôi cçy chûng CK1 ć điều môi trþąng PDA. Trong nghiên cĀu cûa kiện 35C dày hĄn ć điều kiện 30C. Ở 10C và Alsaadoon & cs. (2012); Rodríguez-Gálvez & cs. 40C, chûng nçm này phát triển kém và thêm (2015) cüng sā dýng môi trþąng PDA để thăc chí không phát triển (Hình 7A). TþĄng tă nhþ hiện các nghiên cĀu liên quan đến nçm vêy Félix & cs. (2018) khîng đðnh, nçm L. theobromae. Môi trþąng WA chî bao gồm L. theobromae phát triển tốt trong khoâng nhiệt nþĆc cçt và agar nên có thể là lý do chûng nçm độ tÿ 25-37C và nhiệt độ tối þu cho să sinh CK1 mọc rçt yếu (Latha & cs., 2013). Nhþ vêy, trþćng cûa nçm L. theobromae là 30C. Trong dăa trên nhĂng đánh giá về tốc độ phát triển và nghiên cĀu cûa mình, Saha & cs. (2008) läi cho mêt độ hệ sĉi nçm, có thể thçy chûng nçm rìng, nçm L. theobromae sinh trþćng tốt nhçt ć L. theobromae CK1 phát triển tốt nhçt trên môi 28C và ć 40C nçm không phát triển. Đồng trþąng PDA và môi trþąng PDA đþĉc sā dýng thąi, theo Alves & cs. (2008), ć 10C nçm cho các nghiên cĀu tiếp theo. L. theobromae cüng không phát triển. Ghi chú: A: Hình ảnh hệ sợi của chủng CK1; B: Đường kính tản nấm CK1. Hình 6. Sự phát triển của chủng CK1 trên các môi trường khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy 65
Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Lasiodiplodia theobromae gây bệnh chết khô cành trên nho tại Hà Nội và Hưng Yên Ghi chú: A: Hình ảnh hệ sợi của chủng CK1; B: Đường kính tản nấm CK1. Hình 7. Sự phát triển của chủng CK1 ở các nhiệt độ khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy Hình 8. Sự phát triển của chủng CK1 ở các điều kiện pH khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy 66
Đặng Thị Thanh Tâm, Đỗ Thúy Hiền, Nguyễn Thanh Huyền Ghi chú: Ở mỗi đĩa petri - Giếng bên trái chứa dịch nuôi cấy chủng nấm CK1; Giếng bên phải chứa môi trường PDB (Đối chứng). Hình 9. Khâ năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm L. theobromae CK1 3.4.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi ra các enzyme có chĀc nëng phån hûy thành tế cấy đến sự sinh trưởng của chủng bào. NhĂng enzyme này đặc biệt quan trọng đối vĆi các nçm gây bệnh không có cçu trúc xâm L. theobromae CK1 nhêp chuyên biệt. Do đò, việc nghiên cĀu và xác Chûng nçm L. theobromae CK1 đþĉc nuôi đðnh khâ nëng phân giâi enzyme cûa chûng trên môi trþąng PDA vĆi các điều kiện pH khác nçm L. theobromae CK1 có thể cung cçp nhĂng nhau (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) ć 35C. Sau 3 ngày thông tin liên quan đến cĄ chế gây bệnh để tÿ đò nuôi cçy, tốc độ sinh trþćng cûa chûng nçm là xây dăng đþĉc biện pháp phñng và điều trð bệnh không khác nhau quá nhiều và hệ sĉi đều mọc dieback do nçm L. theobromae gåy ra. TþĄng tă kín đïa (90mm). Cý thể, chûng nçm đều có khâ nhþ vêy, Félix & cs. (2018) đã thăc hiện nghiên nëng phát triển trong khoâng pH tÿ 4-10; ć pH cĀu và cüng khîng đðnh rìng, nçm 6, 7 và 8, chûng nçm phát triển nhanh và mêt L. theobromae có khâ nëng sinh tổng hĉp nhiều độ hệ sĉi dæy; chûng nçm L. theobromae CK1 loäi enzyme ngoäi bào nhþ amylase, gelatinase, phát triển kém hĄn trong môi trþąng vĆi pH 9 cellulase, lipase, xylanase và pectinase. và 10 (Hình 8). TþĄng tă, nghiên cĀu cûa Latha & cs. (2013) đã khîng đðnh, nçm L. theobromae phát triển tốt trong khoâng pH tÿ 5-9 và ć pH 7 4. KẾT LUẬN chûng nçm phát triển tốt nhçt. Saha & cs. Trong nghiên cĀu này, tÿ các méu nho có (2008) cüng cho rìng, nçm L. theobromae phát biểu hiện bệnh dieback thu thêp täi Hà Nội và triển đþĉc trong khoâng pH tÿ 3-8, ć pH 6 Hþng Yên, 03 chûng nçm đã đþĉc phân lêp, chûng nçm phát triển tốt nhçt. trong đò chûng nçm CK1 và DN1 cò đặc điểm hình thái giống nhau và giống vĆi nçm 3.5. Khâ năng sinh enzyme ngoại bào của L. theobromae, đồng thąi chúng cüng cò khâ chủng nấm L. theobromae CK1 nëng gåy ra các triệu chĀng cûa bệnh dieback Trong nghiên cĀu này, chûng nçm thông qua thí nghiệm lây nhiễm nhân täo khá L. theobromae CK1 đþĉc xác đðnh là có khâ giống nhau. Do đò, chûng CK1 đþĉc tuyển chọn nëng sinh tổng hĉp một số loäi enzyme nhþ cho các thí nghiệm tiếp theo. Chûng CK1 đþĉc cellulase, xylanase và pectinase thông qua việc xác đðnh nìm cùng nhánh vĆi chûng quan sát vòng phân giâi trên các cĄ chçt đặc Lasiodiplodia theobromae strain MG54-1 vĆi trþng cho tÿng loäi enzyme (Hình 9). Theo giá trð tin cêy bootstrap là 100% và mĀc độ Gibson & cs. (2011), để có thể xâm nhêp vào vêt tþĄng đồng 99,80% vĆi trình tă vùng ITS rDNA chû và gây bệnh trên đối tþĉng vêt chû đò, các gene cûa chûng L. theobromae strain MG54-1. chûng nçm gây bệnh thăc vêt thþąng sân xuçt Dò đo, chûng CK1 đþĉc đặt tên là 67
Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Lasiodiplodia theobromae gây bệnh chết khô cành trên nho tại Hà Nội và Hưng Yên L. theobromae CK1. Chûng L. theobromae CK1 Hồng Ngọc & Đào Hương (2022) Thành công bước đầu trồng nho Hạ đen. Truy cập từ sinh trþćng tốt trên môi trþąng PDA ć 35C, pH https://baohungyen.vn/thanh-cong-buoc-dau-trong- 6-8. Ngoài ra, chûng nçm này cüng thể hiện nho-ha-den-4330.html ngày 30/8/2023. khâ nëng sinh enzyme cellulase, pectinase Kasana R.C., Salwan R., Dhar H., Dutt S. & Gulati A. và xylanase. (2008). A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using gram's iodine. Current Microbiology. 57(5): 503-7. TÀI LIỆU THAM KHẢO Khan N.A., Fahad S., Naushad M. & Faisal S. (2020). Alsaadoon A., Khalaf M., A.Hameed M., Al-Badran A. Grape Production Critical Review in the World. & Ali Z. (2012). First report of grapevine dieback Social Science Research Network. caused by Lasiodiplodia theobromae and Larignon P. (2001). The villainy of Black Dead Arm. Neoscytalidium dimidiatum in Basrah, Southern Wines and vines. 82: 86-89. Iraq. African Journal of Biotechnology. Latha P., Prakasam V., Jonathan E. I., Ramasamy S. & 11(95): 16165-16171. Natarajan C. (2013). Effect of culture media and Alves A., Crous P., Correia A. & Phillips A. (2008). environmental factors on mycelial growth and Morphological and molecular data reveal cryptic pycnidial production of Lasiodiplodia theobromae species in Lasiodiplodia theobromae. Fungal in physic nut (Jatropha curcas). Journal of diversity. 28. Environmental Biology. 34: 683-7. Cơ Nguyên (2023). Ninh Thuận: Hội thảo phát triển giá Le Quang Quyen & Long V.X. (1999). Grape trị cây nho và sản phẩm từ nho năm 2023. Truy production in Vietnam. Food and Agriculture cập từ https://khuyennongvn.gov.vn/hoat-dong- Organization of the United Nations, Rome, Italy. khuyen-nong/thong-tin-huan-luyen/ninh-thuan-hoi- thao-phat-trien-gia-tri-cay-nho-va-san-pham-tu- Lumînare C., Cojanu D., Mihaela Monica D. & Fëtu nho-nam-2023-22561.html ngày 25/12/2023. A.C. (2021). In vitro thermal requirements of two FAO (2021). FAOSTAT. Food and Agriculture isolates of Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorok. Organization of the United Nations, Rome, Italy. under constant conditions. Romanian Journal for https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL, truy Plant Protection. 14: 70-74. cập ngày 30/8/2023. Masoomi-Aladizgeh F., Jabbari L., Nekouei R. & Félix C., Libório-Ramos S., Nunes M., Félix R., Duarte Aalami A. (2016). A Simple and Rapid System for A., Alves A. & Esteves A. (2018). Lasiodiplodia DNA and RNA Isolation from Diverse Plants theobromae as a Producer of Biotechnologically Using Handmade Kit. 10.21203/rs.2.1347/v2 Relevant Enzymes. International Journal of Minh Sơn (2021). Nông trại nho trĩu quả ngay giữa Thủ Molecular Sciences. 19. đô thu hút người dân khám phá. Truy cập từ Fontaine F., Gramaje D., Armengol J., Smart R., Nagy https://www.vietnamplus.vn/nong-trai-nho-triu- Z. A., Borgo M., Rego C. & Corio-Costet M.F. qua-ngay-giua-thu-do-thu-hut-nguoi-dan-kham- (2016). Grapevine trunk diseases. A review. pha-post722912.vnp ngày 30/8/2023. OIV publications. Oyeleke S.B. & Manga S.B. (2008). Essentials of Gibson D.M., King B.C., Hayes M.L. & Bergstrom laboratory practicals in microbiology. Tobest G.C. (2011). Plant pathogens as a source of diverse Publishers Minna, Nigeria. pp. 36-75. enzymes for lignocellulose digestion. Current Phương Thảo (2023) Thu hàng trăm triệu đồng mỗi Opinion Microbiology. 14(3): 264-70. năm nhờ trồng nho ở Hà Nội. Truy cập từ Gnanesh B.N., Arunakumar G.S., Tejaswi A., Supriya https://mekongasean.vn/thu-hang-tram-trieu-dong- M., Manojkumar H.B. & Devi S.S. (2022). moi-nam-nho-trong-nho-o-ha-noi-post23404.html, Characterization and Pathogenicity of ngày 30/8/2023. Lasiodiplodia theobromae Causing Black Root Rot and Identification of Novel Sources of Resistance Rangel E., Paolinelli M., Rolshausen P., Valenzuela- in Mulberry Collections. Plant Pathol J. Solano C. & Hernandez R. (2021). 38(4): 272-286. Characterization of Lasiodiplodia species Goldammer T. (2018). Grape Grower's Handbook: associated with grapevines in Mexico. A Guide to Viticulture for Wine Production. Phytopathologia Mediterranea. 60: 237-251. Apex. 482. Rodríguez-Gálvez E., Maldonado E. & Alves A. Hồng Ngọc (2022) Khởi nghiệp từ trồng nho sữa Hàn (2015). Identification and pathogenicity of Quốc. Truy cập từ https://baohungyen.vn/khoi- Lasiodiplodia theobromae causing dieback of table nghiep-tu-trong-nho-sua-han-quoc-3869.html ngày grapes in Peru. European Journal of Plant 30/8/2023. Pathology. 141(3): 477-489. 68
Đặng Thị Thanh Tâm, Đỗ Thúy Hiền, Nguyễn Thanh Huyền Rubio J. & Garzón E. (2011). Las enfermedades de vn/ninh-thuan-province-develops-grape-ecosystem/ madera de vid como amenaza del sector vitícola. 254068.vnp on Aug 30, 2023. Rev. Winetech. 2: 18-21. Wesley D.B. (2020). A comparison of several media Saha A., Mandal P., Dasgupta S. & Saha D. (2008). types and basic techniques used to assess outdoor Influence of culture media and environmental airborne fungi in Melbourne, Australia. bioRxiv. factors on mycelial growth and sporulation of 10.1101/2020.08.27.269704: 2020.08.27.269704. Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon and White T.J., Bruns T., Lee S. & Taylor J. (1990). 38 - Maubl. Journal of environmental biology Academy Amplification and direct sequencing of fungal of Environmental Biology, India. 29: 407-10. ribosomal RNA genes for phylogenetics. Trong: PCR Protocols. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky Sanghavi K., Sanghavi M. & Rajurkar A. M. (2021). J.J. & White T.J. (eds.). Academic Press San Early stage detection of Downey and Powdery Diego. pp. 315-322. Mildew grape disease using atmospheric parameters through sensor nodes. Artificial Mark S. (2018). Best practice management guide: Intelligence in Agriculture. 5: 223-232. Eutypa dieback. South Australian Research and Suwannarach N., Sujarit K., Kumla J., Bussaban B. & Development Institute. Version 1.1. Lumyong S. (2013). First report of leaf spot Yan J., Xie Y., Zhang W., Wang Y., Liu J.-K., Hyde disease on oil palm caused by Pestalotiopsis theae K., Seem R., Zhang G.-Z., Zhong-Yue W., Yao S.- in Thailand. Journal of General Plant Pathology. W., Bai X.-J., Dissanayake A., Peng Y. & Li X.-H. 79: 277-279. (2013). Species of Botryosphaeriaceae involved in Vietnamplus (2023). Ninh Thuan province develops grape grapevine dieback in China. Fungal diversity. eco-system. Retrieved from https://en.vietnamplus. 61: 221-236. 69

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.