Phân lập và thiết kế GRNA chỉnh sửa promter OsSWEET13 liên quan đến bệnh bạc lá trên lúa bắc thơm 7

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, promoter OsSWEET13 đã được phân lập từ DNA tổng số của giống lúa BT7. Kết quả cho thấy trình tự DNA phân lập được dài 640 bp, giống lần lượt 99,38% và 92,3% so với OsSWEET13 của lúa Japonica Nipponbare (AP014968.1) và Indica Shuhui498 (CP018168.1), chứa trình tự bám cho protein độc TAL (transcription activator-like) PthXo2(A) của Xoo. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập và thiết kế GRNA chỉnh sửa promter OsSWEET13 liên quan đến bệnh bạc lá trên lúa bắc thơm 7

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ gRNA CHỈNH SỬA PROMTER OsSWEET13 LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA BẮC THƠM 7 Phùng Thị Thu Hương1, Trần Thị Thanh Huyền2, Phạm Phương Ngọc3, Cao Lệ Quyên1, Phạm Xuân Hội1, Nguyễn Duy Phương1* TÓM TẮT Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra là một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất ở lúa. Giống lúa Bắc thơm 7 (BT7) là giống chủ lực của các tỉnh phía Bắc nhưng lại rất mẫn cảm với bệnh bạc lá. OsSWEET13 thuộc họ gen OsSWEET mã hóa các protein vận chuyển saccrose, có liên quan đến cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn bạc lá ở thực vật. Trong nghiên cứu này, promoter OsSWEET13 đã được phân lập từ DNA tổng số của giống lúa BT7. Kết quả cho thấy trình tự DNA phân lập được dài 640 bp, giống lần lượt 99,38  và 92,3  so với OsSWEET13 của lúa Japonica Nipponbare (AP014968.1) và Indica Shuhui498 (CP018168.1), chứa trình tự bám cho protein độc TAL (transcription activator-like) PthXo2(A) của Xoo. Dựa trên trình tự DNA phân lập được, hai cấu trúc gRNA đã được thiết kế với mục đích chỉnh sửa vị trí bám đặc hiệu của PthXo2(A) trên promoter OsSWEET13 và bất hoạt hoàn toàn gen OsSWEET13 bằng công nghệ CRISPR/CAS9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9), hướng tới mục tiêu tạo giống lúa BT7 năng suất cao có khả năng kháng bệnh bạc lá trong tương lai. Từ khóa: Chỉnh sửa gen, bạc lá, CRISPR/CAS9, OsSWEET13, TAL effector, Xanthomonas oryzae. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 3 phức với ion sắt (siderophore) và protein tiết loại III…, qua đó gây bệnh cho cây chủ [14]. Protein TAL Bạc lá ở lúa là một bệnh hại phổ biến khắp các (transcription activator-like) là một protein tiết loại vùng trồng lúa trên thế giới, gây thiệt hại năng suất III của Xoo, có chức năng hoạt hóa biểu hiện các gen hàng năm trung bình 10 - 20 , thậm chí ở một số “nhiễm” (Succeptible gene) trong hệ gen tế bào chủ vùng thiệt hại lên đến 50 - 70  [17]. Bệnh bạc lá xảy bằng cách liên kết với trình tự đích đặc hiệu trên ra đặc biệt nghiêm trọng ở các quốc gia trồng lúa vùng promoter của gen đích (effector binding khu vực châu Á, trong đó có Việt Nam. Bắc thơm 7 là element - EBE), từ đó thúc đẩy quá trình lây nhiễm một trong những giống chủ lực của Việt Nam, được của Xoo [3]. Ba gen OsSWEET11, OsSWEET13 và canh tác phổ biển ở hầu hết các tỉnh khu vực phía OsSWEET14 thuộc họ OsSWEET mã hóa cho các Bắc. Tuy nhiên, giống Bắc thơm 7 lại rất mẫn cảm protein vận chuyển đường đã được chứng minh là với bệnh bạc lá. Chính vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến những mục tiêu thường xuyên nhất của các protein khả năng kháng bệnh bạc lá cho giống Bắc thơm 7 TAL [2, 5, 6, 11, 26]. Trên vùng promoter của sẽ giúp ổn định sản xuất lúa gạo, đảm bảo an ninh OsSWEET11 và OsSWEET13 có chứa một số EBE lương thực quốc gia. được nhận biết bởi protein TAL PthXo1 và PthXo2 Bệnh bạc lá lúa gây ra bởi vi khuẩn của nhiều chủng Xoo châu Á [26]. Nhiều nghiên cứu Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Xoo tiết ra đã chứng minh đột biến xuất hiện tại vị trí EBE trên một loạt các yếu tố độc lực, bao gồm các hợp chất vùng promoter của các gen “nhiễm” này có thể giúp polyme ngoại bào (extracellular polymeric cây lúa chống lại sự xâm nhiễm của các chủng Xoo substances), enzyme ngoại bào, các hợp chất tạo tương ứng [1, 7, 8, 13, 27]. Nghiên cứu của Zhou (2015) cũng đã cho thấy OsSWEET13 là một đối tượng tiềm năng cho mục đích nghiên cứu chọn tạo 1 giống lúa kháng bệnh bạc lá [27]. Viện Di truyền Nông nghiệp 2 Học viện Nông nghiệp Việt Nam CRISPR/CAS9 (Clustered regularly interspaced 3 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà short palindromic repeats/CRISPR associated Nội protein 9) là công cụ chỉnh sửa gen được sử dụng * Email: phuongnd.bio@gmail.com 20 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ rộng rãi nhất hiện nay. Dựa trên cơ chế hoạt động dụng hai mồi Sw13-Fw (5’- của CRISPR/CAS9 (quá trình sgRNA (single guide CCGTATCAGGATTCAGGAATA-3’) và Sw13-Rv (5’- RNA) điều tiết endonuclease CAS9 cắt đặc hiệu DNA CCAGCCATTTTTGTGTGCTA-3’). Sản phẩm PCR sợi đôi) và cơ chế sửa chữa đứt gãy DNA sợi đôi được tinh sạch bằng bộ kit GenJET-TM Gel (Double-Strand Break-DSB) của tế bào, các nhà Extraction của Hãng Thermo Fisher Scientific. nghiên cứu có thể hoàn toàn chủ động với mục tiêu 2.2.3. Nhân dòng promoter SW13-BT chỉnh sửa gen [4]. Hơn thế nữa, chỉnh sửa gen dựa Promoter SW13-BT nhân bản bằng PCR được cơ chế sửa chữa DSB thông qua con đường ghép nối nhân dòng bằng bộ kit pGEM-T Easy theo quy trình điểm cuối không tương đồng (Non-Homologous End đi kèm của Hãng Promega. Vector tái tổ hợp được Joining-NHEJ) của tế bào sẽ tạo ra sản phẩm cây biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α; thể biến nạp trồng không mang DNA ngoại lai. Vì vậy, công nghệ được sàng lọc bằng phương pháp PCR trực tiếp CRISPR/CAS9 có tiềm năng ứng dụng rất lớn cho khuẩn lạc với cặp mồi T7/SP6. Plasmid được tách các nghiên cứu cải tiến tính trạng cây trồng. chiết từ vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJET-TM Trong nghiên cứu này, đã tiến hành phân lập và Plasmid Miniprep của Thermo Fisher Scientific. Sản phân tích một đoạn trình tự promoter/gen phẩm plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng kỹ thuật OsSWEET13 của lúa Bắc thơm 7 (gọi tắt là SW13- PCR với 2 cặp mồi Sw13-Fw/Sw13-Rv và T7/SP6 và BT) rất mẫn cảm với bệnh bạc lá nhằm thiết kế bằng phản ứng cắt giới hạn với enzyme EcoRI. gRNA cho hệ thống chỉnh sửa promoter/gen SW13- 2.2.4. Phân tích trình tự SW13-BT BT. Kết quả thu được là tiền đề cho nghiên cứu tạo giống lúa Bắc thơm 7 (BT7) có khả năng kháng bệnh Trình tự DNA được xác định bằng thiết bị giải bạc lá bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen trình tự nucleotide tự động ABI3100 theo phương CRISPR/CAS9. pháp của Smith et al. (1986) [25], sử dụng hai mồi T7 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU và SP6 cho phản ứng PCR giải trình tự. Kết quả giải trình tự được xử lí bằng phần mềm BioEdit 4.0. Trình 2.1. Vật liệu tự DNA sau khi xử lí được so sánh với cơ sở dữ liệu Giống lúa BT7 do Tổng công ty Giống cây trồng trên GenBank và phân tích bằng phần mềm Genetyx Thái Bình cung cấp; chủng vi khuẩn E. coli DH5α 4.0. được mua từ Hãng Thermo Fisher Scientific (Mỹ). 2.2.5. Thiết kế trình tự gRNA đặc hiệu cho Các oligonucleotide dùng cho PCR nhân bản SW13-BT SW13-BT được thiết kế dựa trên trình tự đã được Trình tự gRNA đặc hiệu cho chỉnh sửa SW13-BT công bố trên GenBank (AP014968.1) và đặt mua từ được thiết kế bằng phần CRISPR-P v2.0 Hãng Sigma (Mỹ). (http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/). Cấu trúc bậc 2.2. Phương pháp nghiên cứu II của các gRNA được phân tích bằng phầm mềm 2.2.1. Tách chiết DNA từ lúa Mfold 2.3 (http://unafold.rna.albany.edu/). Đoạn DNA tương đồng với các gRNA trong hệ gen lúa DNA tổng số của cây lúa được tách chiết theo được xác định bằng phần mềm CCTop phương pháp của Doyle và Doyle (1990) [9], sử dụng (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de). Trình tự hệ dung dịch CTAB 2 . Mẫu lá lúa (100 mg) được gen lúa được tham chiếu từ cơ sở dữ liệu trên ngân nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn, sau đó được bổ hàng gen Ensembl Plants sung 500 µl dung dịch CTAB 2  (có chứa ARNase 40 (http://plants.ensembl.org/). Đoạn gRNA đặc hiệu mg/ml) và ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút để thu được lựa chọn dựa trên vị trí trên SW13-BT, điểm đặc dịch nổi. 500 µl hỗn hợp phenol : chloroform : hiệu, hàm lượng GC, khả năng hình thành và duy trì isoamyl (25 : 24 : 1) được bổ sung vào dung dịch để cấu trúc bậc II, số lượng và vị trí đoạn DNA tương kết tủa protein. Hỗn hợp sau đó được ly tâm tốc độ đồng xuất hiện trong hệ gen lúa, vị trí và số lượng 13.000 vòng/phút để thu DNA tinh sạch. nucleotide sai khác trên gRNA [16]. 2.2.2. Phân lập promoter SW13-BT 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Promoter của gen SW13-BT được phân lập từ 3.1. Phân lập promoter/gen OsSWEET13 của DNA tổng số của cây lúa bằng kỹ thuật PCR [23], sử lúa BT N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 21
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Vi khuẩn Xoo nhận biết và hoạt hóa sự biểu hiện giống lúa BT7 đã được phân lập bằng PCR từ DNA của gen “nhiễm” trong hệ gen cây chủ thông qua các tổng số để phân tích trình tự nucleotide nhằm dự vị trí EBE trên vùng promoter. Các EBE này thường đoán vai trò của OsSWEET13 đối với tính mẫn cảm nằm gần hộp TATA (TATA box) trên promoter của với bệnh bạc lá của lúa BT7, đồng thời phục vụ gen đích hoặc khu vực cận biên của promoter [1, 10, nghiên cứu chỉnh sửa promoter/gen OsSWEET13 12, 15, 21, 22]. Trong nghiên cứu này, để phân tích sau này. đặc điểm trình tự của promoter SW13-BT phục vụ 3.2. Nhân dòng SW13-BT vào vector pGEM-T mục đích thiết kế gRNA chỉnh sửa EBE và/hoặc bất Sản phẩm PCR nhân bản trình tự SW13-BT từ hoạt gen SW13-BT, đoạn DNA nằm từ vị trí [-632] DNA tổng số được tinh sạch và ghép nối vào vector đến [+8] của OsSWEET13 đã được nhân bản bằng nhân dòng pGEM-T. Vector tái tổ hợp sau đó được phản ứng PCR với khuôn là DNA tổng số tách chiết kiểm tra bằng phương pháp PCR và cắt bằng enzyme từ lá lúa non BT7, sử dụng cặp mồi Sw13-Fw/Sw13- giới hạn (Hình 2 A&B). Rv. Kết quả PCR đã thu được sản phẩm khuếch đại có kích thước xấp xỉ 0,64 kb tương ứng với kích thước lí thuyết của đoạn trình tự SW13-BT cần phân lập (640 bp) (Hình 1, giếng 2). Như vậy, bước đầu có thể kết luận đoạn DNA mong muốn đã được phân lập thành công từ DNA tổng số của lúa BT7. Sản phẩm PCR được tinh sạch và nhân dòng để phục vụ giải trình tự nucleotide và cho các nghiên cứu chức năng của OsSWEET13 sau này. Hình 2. Kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM/SW13-BT. Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1  (A) PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1-2: PCR với cặp mồi Sw13-Fw/Sw13-Rv; giếng 3-4: PCR với cặp mồi T7/SP6; giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/SW13- BT; giếng 2 và 4: đối chứng âm (không có DNA Hình 1. Phân lập SW13-BT từ hệ gen lúa BT7 bằng kĩ khuôn). (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng thuật PCR enzym cắt giới hạn; giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn bằng EcoRI; giếng 2: vector pGEM/SW13-BT Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb (iNtRon); nguyên bản; giếng M: thang chuẩn DNA 100 bp giếng 1: đối chứng âm (không chứa DNA khuôn); (Thermo Scientific). giếng 2: sản phẩm PCR. Kết quả điện di trên gel agarose 1  trên hình 2 Vi khuẩn Xoo gây bệnh trên lúa nhờ nhóm tác cho thấy sản phẩm PCR từ plasmid với cặp mồi Sw13- nhân TAL thuộc hệ thống bài tiết loại III (T3S) hoạt Fw/Sw13-Rv đặc hiệu cho đoạn promoter/gen SW13- động như nhân tố phiên mã hoạt hóa các gen BT cho một băng DNA có kích thước khoảng 0,64 kb “nhiễm” để thúc đẩy môi trường thuận lợi cho vi (Hình 2A, giếng 1). Tương tự, sản phẩm PCR với cặp khuẩn sinh trưởng trong cây chủ. Thực nghiệm đã mồi T7/SP6 (có khoảng cách 186 bp trên pGEM-T) chứng minh các gen thuộc họ gen vận chuyển đường đặc hiệu cho vector pGEM-T cho một băng DNA có SWEET là gen “nhiễm” hỗ trợ quá trình xâm nhiễm kích thước xấp xỉ 0,82 kb (Hình 2A, giếng 3). Các của vi khuẩn bạc lá, trong đó có OsSWEET13. EBE băng DNA này có kích thước phù hợp với kích thước trên vùng promoter của OsSWEET13 là mục tiêu lí thuyết của đoạn DNA cần nhân bản. Bên cạnh đó, chính của nhiều chủng Xoo châu Á mang PthXo2 kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn plasmid tái tổ [26]. Trong nghiên cứu này, một đoạn trình tự hợp bằng EcoRI (đoạn DNA được chèn vào giữa hai promoter và một phần mã hoá trên OsSWEET13 của vị trí nhận biết của EcoRI trên vector pGEM-T) 22 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ (Hình 2HìnhB, giếng 1) cho hai băng DNA có kích trình tự nucleotide trên thiết bị giải trình tự thước lần lượt khoảng 3,0 kb tương ứng với bộ khung nucleotide tự động và phân tích bằng phần mềm vector pGEM-T và 0,66 kb tương ứng với đoạn DNA BioEdit. Kết quả phân tích cho thấy đoạn DNA phân chèn SW13-BT đúng như tính toán lí thuyết (Hình lập được từ giống lúa BT7 có chiều dài 640 2B, giếng 1). Các kết quả thu được này cho phép nucleotide, giống lần lượt 99,38  và 92,3  so với trình khẳng định chắc chắn hơn việc nhân dòng thành tự tương ứng của giống lúa Japonica Nipponbare công trình tự SW13-BT vào vector pGEM-T. (AP014968.1) và giống lúa Indica Shuhui498 Nhiều nghiên cứu về promoter trước đây cũng (CP018168.1) đã được công bố trên GenBank (Hình thực hiện phân lập và nhân dòng đoạn DNA quan 3). Trình tự phân lập được bao gồm vùng promoter tâm vào vector nhân dòng trước khi đưa vào vector dài 441 bp và một đoạn dài 199 bp mang trình tự biểu hiện nhằm phục vụ việc nghiên cứu chức năng Exon I của OsSWEET13. Đoạn SW13-BT phân lập [8, 18]. Trong nghiên cứu này, đoạn DNA nằm từ vị được chứa trình tự hộp TATA đặc trưng và đặc biệt trí [-632] đến [+8] của OsSWEET13 đã được nhân có chứa trình tự DNA (yếu tố điều hòa cis) tương bản từ DNA tổng số của giống lúa BT7 và dòng hóa đồng với trình tự EBE được nhận biết bởi protein vào vector pGEM-T. Sản phẩm nhân dòng là nguồn TAL PthXo2 của nhiều chủng vi khuẩn Xoo châu Á nguyên liệu cho toàn bộ các thí nghiệm nghiên cứu [20, 26]. Tuy nhiên có sự sai khác giữa trình tự EBE đặc điểm chức năng của OsSWEET13 sau này. này của lúa BT7 so với hai giống lúa tham chiếu (24 3.3. Phân tích trình tự SW13-BT Nu so với 25 Nu, thiếu một Adenine ở vị trí thứ 8) Đoạn promoter/gen SW13-BT được xác định (Bảng 1). Hình 3. Phân tích trình tự SW13–BT7 Hộp TATA (TATA box) và mã mở đầu (ATG) được đóng khung. Vị trí PthXo2(A)-EBE và Exon I được đánh dấu bằng mũi tên. Vị trí cắt trên PthXo2(A)-EBE và Exon I được đánh số từ 1-5. Nghiên cứu gần đây của Oliva (2019) đã chỉ ra Trong khi đó, hai biến thể PthXo2B và PthXo2C rằng họ protein TAL PthXo2 bên cạnh thành viên được dự đoán liên kết với cùng một EBE được phát hiện đầu tiên, còn có nhiều biến thể khác (TATAAAGCACCACAACTCCCTTC) trên promoter như PthXo2(A), PthXo2B và PthXo2C. Theo đó, OsSWEET13 của lúa Nipponbare, Kitaake [20]. Kết PthXo2(A) liên kết với 2 trình tự EBE quả phân tích trình tự cho thấy trên SW13-BT có ATAAAAGCACCACAACTCCCTT (lúa IR24) và chứa EBE liên kết với biến thể PthXo2(A) (gọi tắt là ATATAAGCACCACAACTCCCTT (Zhengshan 97). PthXo2(A)-EBE) (Bảng 1). N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 23
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Bảng 1. Trình tự EBE trên promoter của Bắc thơm 7 và một số giống lúa Giống lúa Vùng trình tự EBE TAL Bắc Thơm 7 TATATAA GCACCACAACTCCCTTC PthXo2(A) Nipponbare TATATAAA GCACCACAACTCCCTTC PthXo2B, PthXo2C Shuhui498 TATATAAA GCACCACAACACCCTTC PthXo2B, PthXo2C IR24 TATATAAAAGCACCACAACTCCCTTC PthXo2(A) Zhengshan 97 TATATAA GCACCACAACTCCCTTC PthXo2(A) Kitaake TATATAAA GCACCACAACTCCCTTC PthXo2B, PthXo2C Ghi chú: Hộp TATA được bôi đậm, SNP được gạch chân [20]. Như vậy, OsSWEET13 có thể là một trong trình tự dài ~20 nucleotide (gRNA) trên phân tử những mục tiêu quan trọng trong quá trình xâm sgRNA [4]. Để gây đột biến chỉnh sửa SW13-BT nhiễm vào tế bào lúa BT7 của các chủng vi khuẩn bằng hệ thống CRISPR/Cas9, các trình tự gRNA Xoo mang protein tiết PthXo2(A). Dựa trên dữ liệu được thiết kế bằng phần mềm CRISPR-P v2.0. Trình đầy đủ về trình tự nucleotide của promoter gen mục tự đích được xác định nằm xung quanh vị trí PthXo2- tiêu trên BT7, việc sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 EBE và gần mã mở đầu (ATG) của Exon I (Hình 3, gây đột biến tại vị trí PthXo2(A)-EBE có thể ngăn bảng 2). chặn/giảm độc tính của vi khuẩn Xoo trên giống lúa Điều kiện cần đối với một trình tự gRNA nhất BT7. Ngoài ra, việc gây đột biến trên vùng Exon I để định bao gồm (i) đầu 3’ phải nối tiếp với trình tự bảo bất hoạt (knock-out) hoàn toàn OsSWEET13 cũng là thủ PAM (NGG), (ii) có độ dài 19 – 22 Nu và (iii) vị một hướng nghiên cứu để tạo ra giống lúa BT7 trí cắt DNA nằm trên trình tự đích. Bằng phần mềm kháng bạc lá. CRISPR-P v2.0, các trình tự gRNA chỉnh sửa các 3.4. Thiết kế cấu trúc gRNA chỉnh sửa SW13-BT trình tự đích liên quan tới cơ chế gây bệnh của vi bằng công nghệ CRISPR/CAS9 khuẩn Xoo trên vùng promoter OsSWEET13 của lúa BT7 đã được thiết kế. Kết quả thu được cho thấy 18 Hai thành phần cơ bản của hệ thống trình tự gRNA đã được xác định đáp ứng đầy đủ 3 CRISPR/Cas9 bao gồm (1) protein Cas9 có hoạt tính tiêu chuẩn. Trong đó, 11 trình tự gRNA có điểm cắt endonuclease và (2) phân tử sgRNA (single guide tại vị trí PthXo2(A)-EBE, 7 trình tự gRNA có điểm cắt RNA) có vai trò điều hướng phức hệ protein-RNA tác động đến Exon I (Bảng 2). CRISPR/Cas9 tới vị trí DNA cần cắt. Tính đặc hiệu của phức hệ CRISPR/Cas9 được quyết định bởi đoạn Bảng 2. Trình tự gRNA chỉnh sửa SW13-BT Kích   On Đích tác Tên Trình tự gRNA-PAM (5'-3’) TBP CBP IBP DSL thước GC score động* 1 gRNA-1 PthXo2(A)- AGAGGAATGAAGGGAGTTG-TGG 19 12 7 0 - 45 0,3391 EBE 3 gRNA-2 PthXo2(A)- AACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 19 6 3 0 - 40 0,0963 EBE 2 gRNA-3 PthXo2(A)- ACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 19 5 3 0 - 45 0,0812 EBE 3 gRNA-4 PthXo2(A)- AAACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 20 6 3 0 - 40 0,0963 EBE 2 gRNA-5 PthXo2(A)- AACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 20 6 3 0 - 40 0,0812 EBE 1 gRNA-6 PthXo2(A)- GGAGAGGAATGAAGGGAGTTG-TGG 21 9 3 0 - 50 0,3391 EBE 3 gRNA-7 PthXo2(A)- AAAACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 21 6 3 0 - 40 0,0963 EBE 2 gRNA-8 PthXo2(A)- AAACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 21 6 3 0 - 40 0,0812 EBE 24 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 1 gRNA-9 PthXo2(A)- TGGAGAGGAATGAAGGGAGTTG-TGG 22 12 3 0 SL1 50 0,3391 EBE 3 gRNA-10 PthXo2(A)- GAAAACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 22 11 3 0 - 40 0,0963 EBE 2 gRNA-11 PthXo2(A)- AAAACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 22 6 3 0 - 40 0,0812 EBE 5 gRNA-12 TTTAGCACACAAAAATGGC-TGG 19 5 5 0 - 35 0,2999 Exon I 4 gRNA-13 CCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG 19 7 7 0 - 35 0,1298 Exon I 4 gRNA-14 CCCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG 20 7 7 0 - 40 0,1933 Exon I 5 gRNA-15 CTTTTAGCACACAAAAATGGC-TGG 21 7 7 0 - 35 0,3765 Exon I 4 gRNA-16 CCCCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG 21 7 7 0 - 45 0,1539 Exon I 5 gRNA-17 CCTTTTAGCACACAAAAATGGC-TGG 22 7 7 0 - 35 0,3004 Exon I 4 gRNA-18 CCCCCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG 22 7 7 0 - 50 0,1539 Exon I Ghi chú: (  GC) tỉ lệ phần trăm GC; (TBP) tổng số cặp bazơ; (CBP) số cặp bazơ liên tục; (IBP) số cặp bazơ trong cấu trúc của gRNA; (DSL) vòng loop bị phá vỡ cấu trúc; (SL1) Stem loop 1; (-) không ảnh hưởng đến cấu trúc vòng loop; (PthXo2) EBE trên promoter SW13-BT; (On score) Điểm dự đoán khả năng nhận biết đúng vị trí đích (từ 0,00 – 1,00); (*) các gRNA cùng chỉ số có cùng một vị trí cắt trên PthXo2(A)-EBE hoặc Exon I. Trình tự PAM được in đậm. (IBP-internal base pairs) < 7 [16]. Kết quả phân tích bằng phần mềm CRISPR-P v2.0 và Mfold 2.3 cho thấy có 15/18 gRNA đảm bảo việc hình thành phức hệ CRISPR/CAS9 ổn định có hoạt tính trong nhân tế bào thực vật (Bảng 2, Hình 4); trong đó 6 gRNA có điểm On-score (điểm đánh giá khả năng hoạt động) ở mức cao (0,2 - 0,5) và 12 gRNA có điểm On-score ở mức thấp (< 0,2). Đối với đích tác động là PthXo2(A)- EBE, ba trình tự gRNA-1, gRNA-6 và gRNA-9 có điểm On-score (0,3391) và có cùng một vị trí cắt (1 PthXo2(A)-EBE) (Bảng 2). Tuy nhiên, chỉ gRNA-6 có Guanine ở đầu 5’- là yếu tố giúp các cấu trúc biểu hiện RNA điều khiển bởi promoter U6 hoạt động hiệu quả hơn. Đối với đích tác động là vùng mã mở đầu trên Exon I, trình tự gRNA-14 và gRNA-15 có điểm On-score cao nhất (0,1933 và 0,3765) tương ứng với mỗi vị trí cắt (4Exon I và 5Exon I) (Bảng 2) được Hình 4. Cấu trúc bậc II của gRNA-6 lựa chọn để tiếp tục phân tích. Mô hình cấu trúc bậc II được dự đoán bằng phần Hạn chế lớn nhất của hệ thống chỉnh sửa gen mềm Mfold 2.3 mang vùng gRNA (CRISPR RNA) và CRISPR/CAS9 so với các hệ thống chỉnh sửa gen các cấu trúc vòng loop: Stem loop RAR (repeat and khác (TALEN, ZFN...) đó là tính đặc hiệu của gRNA, anti-repeat region), Stem loop 2 và Stem loop 3. do gRNA chỉ nhận biết ~20 nucleotide và Cas9 vẫn có thể hoạt động dù trình tự DNA đích có một vài Để đảm bảo khả năng duy trì hoạt tính và tính đặc hiệu của phức hệ CRISPR/CAS9 trong nhân tế nucleotide sai khác so với gRNA [4]. Nhằm giảm thiểu khả năng nhận biết sai vị trí (off-target) của bào, gRNA phải có hàm lượng GC trong trình tự gRNA từ 30-80 , có khả năng hình thành cấu trúc phức hệ CAS9-gRNA, trình tự của các gRNA tiếp tục bậc II ổn định (duy trì cầu trúc vòng loop RAR - được phân tích bằng phần mềm CCTop repeat and anti-repeat, SL2 - stem loop 2 và SL3 - (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de) để tìm ra các stem loop 3), tổng số cặp bazơ (TBP - total base đoạn DNA tương đồng với các gRNA có trong hệ gen lúa (http://plants.ensembl.org/). Kết quả phân tích pairs) < 13, số cặp bazơ liên tục (CBP - consecutive base pairs) < 8, số cặp bazơ bên trong cấu trúc gRNA cho thấy gRNA-6, gRNA-14 và gRNA-15 đều có một N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 25
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ số trình tự DNA tương đồng trong hệ gen lúa (Bảng một trình tự tương đồng nằm trên Exon của một gen 3. Các trình tự DNA tương đồng với gRNA trong hệ mã hóa protein nên có khả năng gây ảnh hưởng đến gen lúa. Trong khi tất cả các trình tự tương đồng với hoạt động chức năng của tế bào nếu xảy ra đột biến gRNA-6 và gRNA-15 đều nằm cách xa vùng mã hóa sai vị trí mong muốn (off-target). (Exon) của gen chức năng (Bảng 3); gRNA-14 có Bảng 3. Các trình tự DNA tương đồng với gRNA trong hệ gen lúa Vị Khoảng cách đến Tên Trình tự DNA tương đồng Mã số gen đích trí Exon gần nhất gRNA-6 AGGGAGGAA[TGAAGGGATTTG] I 492 ENSORLG00000002227 GGAGGGGAA[TGGAGGGACTTG] I 68716 ENSORLG00000025158 GAAGAGGAA[AGAAGGGAGGTG] - 67958 ENSORLG00000016115 gRNA- ATTCTTTT[AGCAAACAAAAA] - 1902 EPlOSAG00000044882 14 TGCCATTT[AGCAAACAAAAA] E 0 Os07g0239600 CCTGTTTT[AGCACACAAAAG] I 118 Os12g0636000 CTTCTTAT[AGCACACAAAAT] - 4839 Os03g0248600 gRNA- CTTTTTTCA[ATCAAAAATGGC] - 15608 Os06g0260250 15 CATTTTGCA[AACAAAAACGGC] - 1350 EPlOSAG00000035043 TTTTTAATA[CACAAAAATGGT] - 232 Os03g0264075 Ghi chú: Chữ trong ngoặc [] thể hiện trình tự tương đồng với vùng lõi (12 nu) của gRNA; chữ in đậm thể hiện vị trí sai khác so với vị trí Nu tương ứng trên gRNA. Như vậy, tổng hợp các kết quả phân tích dự đoán dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 trong cấu trúc và tính đặc hiệu có thể xác định các gRNA chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá” (2017-2020), có thể sử dụng cho nghiên cứu gây đột biến chỉnh thuộc Chương trình Công nghệ sinh học Nông sửa SW13-BT theo cơ chế ghép nối điểm cuối không nghiệp - Thủy sản của Bộ Nông nghiệp và PTNT. tương đồng (Non-homologous end joining) [19, 24] Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn. bằng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 [4], bao TÀI LIỆU THAM KHẢO gồm gRNA-6 chỉnh sửa PthXo2(A)-EBE và gRNA-15 1. Antony G., Zhou J., Huang S., Li T., Liu B., gây đột biến bất hoạt hoàn toàn OsSWEET13 của White F., Yang B. (2010). Rice xa13 recessive BT7. Kết quả của nghiên cứu này là cơ sở cho nghiên resistance to bacterial blight is defeated by induction cứu chức năng của OsSWEET13 sau này, đồng thời of the disease susceptibility gene Os11N3. Plant Cell, phục vụ mục tiêu tạo ra dòng lúa BT7 kháng bệnh 22(11):3864-76. bạc lá bằng công nghệ chỉnh sửa gen. 2. Blanvillain-Baufumé S., Reschke M., Solé M., 4. KẾT LUẬN Auguy F., Doucoure H., Szurek B., Meynard D., Promoter/gen SW13-BT liên quan đến quá trình Portefaix M., Cunnac S., Guiderdoni E., Boch J., xâm nhiễm của vi khuẩn bạc lá Xoo trên giống lúa Koebnik R. (2017). Targeted promoter editing for BT7 đã được phân lập và giải trình tự đầy đủ. Vùng rice resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae trình tự đã phân lập chứa PthXo2(A)-EBE và một reveals differential activities for SWEET14-inducing phần Exon I đã được chọn để thiết kế 2 cấu trúc TAL effectors. Plant Biotechnol. J., 15(3):306-317. gRNA phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa promoter/gen 3. Boch J., Bonas U. (2010). Xanthomonas SW13-BT bằng công nghệ CRISPR/CAS9. Kết quả AvrBs3 family-type III effectors: discovery and của nghiên cứu góp phần làm phong phú dữ liệu function. Annu. Rev. Phytopathol., 48:419-36. ngân hàng gen lúa Việt Nam đồng thời đặt nền móng 4. Bortesi L., Fischer R. (2015). The cho định hướng tăng cường khả năng kháng bệnh CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and bạc lá của giống lúa chủ lực BT7 bằng công nghệ beyond. Biotechnol. Adv., 33(1):41-52. chỉnh sửa hệ gen. LỜI CẢM ƠN 5. Chen L. Q., Hou B. H., Lalonde S., Takanaga H., Hartung M., Qu X. Q., Guo W. J., Kim J. G., Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí từ đề tài “Ứng Underwood W., Chaudhuri B., Chermak D., Antony 26 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ G., White F., Somerville S., Mudgett M. B. and Virulence on Rice. Molecular plant-microbe Frommer W. (2010). Sugar transporters for interactions: MPMI, 20: 31-40. intercellular exchange and nutrition of pathogens. 15. Kay S., Hahn S., Marois E., Wieduwild R., Nature, 468: 527-532. Bonas U. (2009). Detailed analysis of the DNA 6. Chen L. Q., Qu X. Q., Hou B. H., Sosso D., recognition motifs of the Xanthomonas type III Osorio S., Fernie A. R., Frommer W. B. (2012). effectors AvrBs3 and AvrBs3Deltarep16. Plant J., Sucrose efflux mediated by SWEET proteins as a key 59(6):859–871. step for phloem transport. Science, 335(6065):207-11. 16. Liang G., Zhang H., Lou D., Yu D. (2016). 7. Cheng Q., Mao W., Xie W., Liu Q., Cao J., Selection of highly efficient scrRNAs for Yuan M., Zhang Q., Li X. and Wang S. (2017). CRISPR/Cas9-based plant genome editing. Sci. Rep., Characterization of a disease susceptibility locus for 6:21451. exploring an efficient way to improve rice resistance 17. Mew T. W. (1987). Current Status and against bacterial blight. Sci China Life Sci., 60(3): Future Prospects of Research on Bacterial Blight of 298-306. Rice. Annual Review of Phytopathology, 25(1): 359- 8. Chu Z., Yuan M., Yao J., Ge X., Yuan B., Xu 382. C., Li X., Fu B., Li Z., Bennetzen J. L., Zhang Q., 18. Nakashima K., Jan A., Todaka D., Maruyama Wang S. (2006). Promoter mutations of an essential K., Goto S., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. gene for pollen development result in disease (2014). Comparative functional analysis of six resistance in rice. Genes Dev., 20(10):1250-5. drought responsive promoters in transgenic rice. 9. Doyle J. J. and Doyle J. L. (1990). Planta, 239(1):47-60. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 19. Nekrasov V., Staskawicz B., Weigel D., Jones 13-15. J.D., Kamoun S. (2013). Targeted mutagenesis in the 10. Grau J., Wolf A., Reschke M., Bonas U., model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA- Posch S., Boch J. (2013). Computational predictions guided endonuclease. Nat. Biotechnol., 31(8):691- provide insights into the biology of TAL effector 693. target sites. PLoS Comput. Biol., 9(3):e1002962. 20. Oliva R., Ji C., Atienza-Grande G., Huguet- 11. Huang S., Antony G., Li T., Liu B., Obasa K., Tapia J. C. And Perez-Quintero A. (2019). Broad- Yang B., White F. F. (2016). The broadly effective spectrum resistance to bacterial blight in rice using recessive resistance gene xa5 of rice is a virulence genome editing. 37(11): 1344-1350. effector-dependent quantitative trait for bacterial 21. Römer P., Recht S., Lahaye T. (2009). A blight. Plant J., 86(2):186-94. single plant resistance gene promoter engineered to 12. Hummel AW., Doyle EL., Bogdanove AJ. recognize multiple TAL effectors from disparate (2012). Addition of transcription activator-like pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., effector binding sites to a pathogen strain-specific 106(48):20526–20531. rice bacterial blight resistance gene makes it 22. Römer P., Strauss T., Hahn S., Scholze H., effective against additional strains and against Morbitzer R., Grau J., Bonas U., Lahaye T. ( 2009). bacterial leaf streak. New Phytol., 195(4):883–893. Recognition of AvrBs3-like proteins is mediated by 13. Hutin M., Sabot F., Ghesquière A., Koebnik specific binding to promoters of matching pepper R., Szurek B. (2015). A knowledge-based molecular Bs3 alleles. Plant Physiol. 150(4):1697–1712. screen uncovers a broad spectrum OsSWEET13 23. Sambrook J., Russel D. W. (2001). Molecular resistance allele to bacterial blight from wild rice. Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Plant J., 84(4):694-703. Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY. 14. Jha G., Ramanan R. and Sonti R. (2007). 24. Shen B., Zhang W., Zhang J., Zhou J., Wang Functional Interplay Between Two Xanthomonas J., Chen L., Wang L., Hodgkins A., Iyer V., Huang X., oryzae pv. oryzae Secretion Systems in Modulating Skarnes W. C. (2014). Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 27
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ effects. Nat. Methods, 11(4):399-402. mediated susceptibility to Xanthomonas oryzae pv. 25. Smith L. M., Sanders J. Z., Kaiser R. J., oryzae. New Phytol., 200:808-81. Hughes P., Dodd C., Connell C. R., Heiner C., Kent 27. Zhou J., Peng Z., Long J., Sosso D., Liu B., S. B., Hood L. E. (1986). Fluorescence detection in Eom J.-S., Huang S., Liu S., Cruz C., Frommer W., automated DNA sequence analysis. Nature, White F. and Yang B. (2015). Gene targeting by the 321(6071):674-679. TAL effector PthXo2 reveals cryptic resistance gene 26. Streubel J., Pesce C., Hutin M., Koebnik R., for bacterial blight of rice. The Plant journal : for cell Boch J., Szurek B. (2013). Five phylogenetically and molecular biology 82. close rice SWEET genes confer TAL effector- DESIGNING gRNA FOR EDITING PROMOTER OsSWEET13 RELATED TO BACTERIAL LEAF BLIGHT DISEASE IN BT7 RICE VARIETY Phung Thi Thu Huong, Tran Thi Thanh Huyen, Pham Phuong Ngoc, Cao Le Quyen, Pham Xuan Hoi, Nguyen Duy Phuong* Summary Bacteria leaf blight (BLB) caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is one of the most serious diseases in rice. Bac thom 7 (BT7) rice variety is a major rice cultivars in the Northern region of Vietnam, but it is susceptible to BLB. OsSWEET13 is a member of the OsSWEET family - which encodes the saccrose transport protein, it is involved in the infection mechanism of BLB in plants. In this study, the OsSWEET13 promoter was isolated from the total DNA of BT7 rice variety. The results showed that the isolated DNA sequence has size of 640 bp, with the similarity of 99.38  and 92.3  for the published sequence of OsSWEET13 (AP014968.1) and (CP018168.1) respectively, contains a effector binding element (EBE) that reconized by PthXo2 - the type III secretory transcription activator-like (TAL) proteins of the Xoo. Based on the isolated DNA sequence, two gRNAs (guide RNA) was designed to edit the EBE sequence on the OsSWEET13 promoter and knockouting the OsSWEET14 gene using CRISPR/CAS9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) system aims to generate high-yielding rice varieties resistant to BLB in future. Keywords: Bacterial leaf blight, CRISPR/CAS9, OsSWEET13, TAL effector, Xanthomonas oryzae, Gene editing. Người phản biện: PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa Ngày nhận bài: 16/6/2020 Ngày thông qua phản biện: 16/7/2020 Ngày duyệt đăng: 23/7/2020 28 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020