Phân lập và xác định các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá chùm ngây (moringa oleifera lam., moringaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH<br /> CHỐNG OXY HÓA TRONG LÁ CHÙM NGÂY<br /> (MORINGA OLEIFERA LAM., MORINGACEAE)<br /> Trần Công Luận*, Trần Thị Thúy Quỳnh**, Salihah**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) là loài cây hiện đang rất được quan tâm về hoạt tính chống<br /> oxy hóa. Để tìm hiểu sâu hơn về khả năng chống oxy của Chùm ngây, nhằm sử dụng loài cây này hiệu quả hơn,<br /> góp phần cho mục đích phát triển Chùm ngây như một loại thuốc hay thực phẩm chức năng chống oxy hóa,<br /> chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và xác định các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá Chùm ngây<br /> (Moringa oleifera Lam., Moringaceae)”.<br /> Đối tượng và phương pháp: Lá Chùm ngây thu tại Tri Tôn, An Giang. Xác định độ tinh khiết của nguyên<br /> liệu. Phân lập và xác định cấu trúc các chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh trong lá Chùm ngây. Đánh giá hoạt<br /> tính chống oxy hóa các chất phân lập được.<br /> Kết quả: Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu lá Chùm ngây. Phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống<br /> oxi hóa là vitexin (25 mg) và isoquercitrin (200 mg). Cả 2 chất phân lập được từ phân đoạn ethyl acetat của lá<br /> Chùm ngây đều có khả năng chống oxy hóa theo những cơ chế khác nhau.<br /> Kết luận: Những kết quả nghiên cứu này cho thấy Chùm ngây có tiềm năng làm thuốc hay thực phẩm chức<br /> năng chống oxy hóa.<br /> Từ khóa: Moringa oleifera, vitexin, isoquercitrin, chống oxy hóa.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ANTIOXIDANT COMPOUNDS FROM LEAVES OF<br /> MORINGA OLEIFERA LAM., MORINGACEAE<br /> Tran Cong Luan, Tran Thi Thuy Quynh, Salihal<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 175 - 179<br /> Objective: Chum ngay (Moringa oleifera Lam.) is well interested in antioxidant activity. In order to<br /> use the plant more effectively and contribute to developing antioxidant production of Chum ngay, this study<br /> was conducted with the aim of isolating and identifying the antioxidant compounds from leaves of Moringa<br /> oleifera Lam.<br /> Methods: Leaves of “Chum ngay” were collected at Tri Ton district, An Giang province. Isolation and<br /> structure determination of compounds having strong antioxidant activity in leaves. Isolated compounds were<br /> tested on antioxidant activities .<br /> Results: Purity standard of Chum ngay leaves was determined. Two antioxidant compounds vitexin (25<br /> mg) and isoquercitrin (200 mg) were isolated and structural identification by means of 1D and 2D NMR<br /> techniques . Two isolated compounds had antioxidant effects with different mechanisms of action.<br /> Conclusion: The results of this study showed potential antioxidant drug or functional food from Chum ngay<br /> leaves.<br /> Keywords: Moringa oleifera, vitexin, isoquercitrin, antioxidant<br /> ∗ Trung tâm sâm và dược liệu Tp. HCM ∗∗ Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y dược Tp. HCM<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Công Luận. ĐT: 0903671323.<br /> Email: congluan53@gmail.com.<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> 175<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Cuộc sống hiện nay con người càng đối mặt<br /> với nhiều căn bệnh nguy hiểm do tác động của<br /> các chất oxy hóa: Đái tháo đường, xơ vữa động<br /> mạch, đục nhân mắt, cao huyết áp, ung thư… Do<br /> đó, chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng và<br /> không thể thiếu trong phác đồ điều trị cũng như<br /> liệu pháp dự phòng các bệnh thoái hóa và ác<br /> tính. Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) là loài<br /> cây hiện đang rất được quan tâm về hoạt tính<br /> chống oxy hóa. Để tìm hiểu sâu hơn về khả năng<br /> chống oxy của Chùm ngây, nhằm sử dụng loài<br /> cây này hiệu quả hơn, góp phần cho mục đích<br /> phát triển Chùm ngây như một loại thuốc hay<br /> thực phẩm chức năng chống oxy hóa, chúng tôi<br /> thục hiện đề tài “Phân lập và xác định các hợp<br /> chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá Chùm<br /> ngây (Moringa oleifera Lam., Moringaceae)”.<br /> <br /> NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Nguyên liệu<br /> Lá Chùm ngây thu tại Tri Tôn, An Giang vào<br /> ngày 1/8/2010. Mẫu sử dụng bao gồm cuống và<br /> lá chét. Mẫu được thu hái, loại bỏ bụi bẩn, lá hư,<br /> sâu… Một phần được phơi khô ở 50 0C – 60 0C<br /> rồi xay nhỏ thành bột. Một phần lá tươi được<br /> dùng để chiết etanol thu cao toàn phần. Mẫu<br /> được định danh và lưu trữ tại Trung tâm Sâm và<br /> Dược liệu TP. Hồ Chí Minh.<br /> <br /> Cao cồn toàn phần và các cao phân đoạn<br /> được tiến hành định lượng phenolic tổng bằng<br /> phương pháp Folin – Ciocalteu theo<br /> Waterman và Mole (1994)(5) và được sàng lọc<br /> hoạt tính chống oxy hóa bằng phản ứng quét<br /> gốc tự do DPPH.<br /> Phân lập các chất trong các cao có hoạt tính<br /> chống oxy hóa cao bằng sắc kí cột nhanh – cột<br /> khô và sắc kí cột cổ điển với hệ dung môi đã<br /> thăm dò trên SKLM. Tinh chế các chất phân lập<br /> được bằng cách lọc qua phễu thủy tinh xốp và<br /> kết tinh lại với dung môi phù hợp. Khảo sát cấu<br /> trúc hóa học các chất phân lập được bằng các<br /> phương pháp phổ UV, phổ khối MS, phổ cộng<br /> hưởng từ hạt nhân NMR.<br /> <br /> Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa các chất<br /> phân lập được<br /> Phương pháp quét gốc tự do DPPH(4)<br /> Dựa vào phương trình hồi quy, tính được giá<br /> trị IC50 là nồng độ quét được 50% gốc tự do<br /> DPPH. Các mẫu có giá trị IC50 càng thấp thì hoạt<br /> tính chống oxy hóa càng cao.<br /> Phương pháp xác định năng lực khử: Theo<br /> phương pháp của Yen và Duh (1993) (6)<br /> Phương pháp thử hoạt tính quét gốc<br /> hydroxyl tự do: Được xác định theo phương<br /> pháp của Li và cộng sự (2007) (3)<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu<br /> <br /> Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu<br /> Xác định độ ẩm bột dược liệu, xác định độ<br /> tro toàn phần, xác định độ tro không tan trong<br /> acid hydrocloric theo DĐVN IV (1)<br /> <br /> Xác định giảm khối lượng do sấy khô là<br /> 78,13 %. Độ ẩm bột dược liệu là 8,857 %. Độ tro<br /> toàn phần là 13,30 %. Tro không tan trong HCl là<br /> 0,36 %.<br /> <br /> Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật có<br /> trong lá Chùm ngây.<br /> <br /> Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật,<br /> trong là Chùm ngây có các hợp chất tinh dầu,<br /> acid béo, carotenoid, triterpenoid, alkaloid,<br /> anthraquinon, coumarin, tanin, flavonoid,<br /> saponin, chất khử, acid hữu cơ và polyuronic.<br /> <br /> Nghiên cứu hóa học<br /> Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp<br /> ngấm kiệt và cô thu hồi để được cao cồn toàn<br /> phần. Cao cồn toàn phần được chiết phân bố<br /> lỏng – lỏng qua các dung môi có độ phân cực<br /> tăng dần, thu được các cao phân đoạn.<br /> <br /> 176<br /> <br /> Chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn<br /> Từ 10 kg nguyên liệu lá tươi thu được 600 g<br /> cao toàn phần. Bằng phương pháp chiết lỏng –<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> lỏng, thu được 4 cao phân đoạn: Cao eter 168 g,<br /> cao cloroform 2,63 g, cao etyl acetat 28,40g, cao<br /> nước 120 g.<br /> <br /> Kiểm tra trên SKLM phân đoạn E4 và EM có<br /> chứa nhiều thành phần có hoạt tính chống oxy<br /> hóa và khối lượng cao lớn.<br /> <br /> Định lượng phenolic toàn phần và khảo sát<br /> hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn<br /> <br /> Phân đoạn E4 được tiến hành sắc ký cột cổ<br /> điển phân lập các hợp chất tinh khiết. Hệ dung<br /> môi giải ly là etyl acetat : metanol, thu được 7<br /> phân đoạn.<br /> <br /> Định lượng phenolic toàn phần<br /> - Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao<br /> cồn toàn phần là 108,011 µg GAE/mg (µg<br /> đương lượng acid gallic/ml), chiếm khoảng 8,6<br /> % khối lượng cao. Kết quả cho thấy lá Chùm<br /> ngây có chứa hàm lượng phenolic khá cao, vì<br /> vậy có tiềm năng là nguồn chất chống oxy hóa<br /> tự nhiên dồi dào.<br /> - Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao<br /> eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước<br /> lần lượt là 44,528 µg GAE/mg, 110,914 µg<br /> GAE/mg, 271,822 µg GAE/mg, 90,881µg<br /> GAE/mg. Hàm lượng phenolic toàn phần tập<br /> trung nhiều nhất trong phân đoạn etyl acetat.<br /> <br /> Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa thông qua cơ<br /> chế quét gốc tự do DPPH.<br /> Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH<br /> của cao cồn toàn phần, cao eter, cao cloroform,<br /> cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 95,26<br /> µg/ml, 287,79 µg/ml, 148,35 µg/ml, 24,59 µg/ml và<br /> 206,69 µg/ml. Kết quả cho thấy phân đoạn etyl<br /> acetat là phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa<br /> cao nhất.<br /> <br /> Phân lập các hợp chất có hoạt tính chống<br /> oxi hóa<br /> Tiến hành khai triển các cao phân đoạn trên<br /> SKLM với hệ dung môi etyl acetat – metanol –<br /> nước (100: 17: 13) sử dụng thuốc thử DPPH. Kết<br /> quả cho thấy các chất có hoạt tính chống oxy hóa<br /> tập trung trong phân đoạn etyl acetat chủ yếu là<br /> các hợp chất phenolic.<br /> Tiến hành sắc kí cột nhanh – cột khô phân<br /> đoạn etyl acetat với hệ dung môi rửa giải:<br /> Cloroform 100% thu được 2 phân đoạn, etyl<br /> acetat 100% thu được 4 phân đoạn (E1-E4),<br /> etyl acetat – metanol (50 : 50) thu được 1 phân<br /> đoạn (EM).<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Phân đoạn 3, xuất hiện tủa màu vàng lắng<br /> dưới đáy. Tách riêng tủa và rửa tủa bằng<br /> metanol, thu được chất I.<br /> Từ phân đoạn 5, 6 xuất hiện kết tinh hình<br /> kim màu vàng. Tách riêng kết tinh, làm sạch<br /> bằng cách cho tái kết tinh trong dung môi etyl<br /> acetat, thu được chất II.<br /> Chất I và chất II được đo và giải phổ NMR<br /> (phổ H, phổ C, DEPT, HSQC, COSY, HMBC) và<br /> khối phổ MS.<br /> Chất I: 13C-NMR (125 MHz, DMSO)<br /> δc163,85; 102,37; 181,97; 155,90; 98,08;162,49;<br /> 104,55; 160,32; 103,96; 121,54; 128,81; 115,73;<br /> 161,03; 115,73; 128.81; 73,31; 70,82; 78,62; 70,54;<br /> 81,71; 61,26. 1H-NMR (500 MHz, DMSO) δH<br /> 4,93 (1H,d, J = 9,8 Hz, H-1’’); 6,77 (1H, s, H-3);<br /> 6,88 (2H, d, J= 8,7 Hz, H-5’); 6,90 (2H, d, J= 8,7<br /> Hz, H-3’); 8,01(2H, d, J = 8,7 Hz, H-6’); 8,03 (2H,<br /> d, J = 8,7 Hz, H-2’); 13,16 (1H, s, 5-OH).<br /> Chất II: 13C-NMR (125 MHz, DMSO) δc<br /> 156,16; 133,35; 177,39; 161,18; 98,58; 164,03;<br /> 93,42; 156,27; 103,95; 121,15; 115,15; 144,72;<br /> 148,37; 116,19; 121,51; 100,96; 74,06; 76,49;<br /> 69,94; 77,42; 60,97. 1H-NMR (500 MHz, DMSO)<br /> δH 5,45 (1H, d, J = 6,9 Hz, H-1″);6,20 (1H, d, J =<br /> 1,8 Hz, H-6); 6,40 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-8); 6,83<br /> (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5′); 7,56 (1H, br s, H-2′);<br /> 7,58 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6′).<br /> Phổ H và phổ C của chất I và chất II được đối<br /> chiếu với phổ của chất chuẩn đã được công bố ta<br /> thấy chất I đúng là vitexin (C21H20O10 : (1S)-1,5anhydro-1-[5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)4-oxo-4H-chromen-8-yl]-D-glucitol)(7) và chất II<br /> 2-(3,4là<br /> isoquercitrin<br /> (C21H20O12:<br /> dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo-4Hchromen-3-yl β-D-glucopyranosid) (2).<br /> <br /> 177<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> (I)<br /> <br /> Hình 3. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của<br /> Isoquercitrin.<br /> <br /> Khảo sát năng lực khử<br /> Ở nồng độ 1000 µg/ml, vitexin đạt được 21,66<br /> % năng lực khử của vitamin C và isoquercitrin<br /> đạt được 70% năng lực khử của Vitamin C.<br /> <br /> (II)<br /> <br /> Hình 1. Cấu trúc của vitexin (I) và isoquercitrin (II)<br /> <br /> Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do<br /> Giá trị IC50 của vitexin và isoquercitrin và<br /> vitamin C lần lượt là 248,152‡g/ml, 394‡g/ml và<br /> 2183‡g/ml. Kết quả cho thấy vitexin có hoạt tính<br /> quét gốc hydroxyl tự do cao nhất, cao hơn<br /> vitamin C.<br /> <br /> Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các<br /> chất phân lập<br /> Hoạt tính quét gốc tự do DPPH<br /> Giá trị IC50 của vitexin và isoquercitrin là<br /> 85,18 µg/ml và 6,64 µg/ml. Isoquercitrin có hoạt<br /> tính cao hơn vitexin và cao hơn chứng dương<br /> vitamin C.<br /> Hình 4. Năng lực khử của vitexin, isoquercitrin và<br /> Vitamin C.<br /> <br /> Hình 2. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của<br /> vitexin<br /> Hình 5. Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của<br /> vitexin và isoquercitrin.<br /> <br /> 178<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> Chùm ngây là đối tượng đang được quan<br /> tâm nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng như<br /> trong nước. Kết quả cho thấy các hợp chất trong<br /> lá Chùm ngây có tiềm năng làm thuốc hay thực<br /> phẩm chức năng chống oxy hóa.<br /> <br /> 1.<br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Đây là nghiên cứu đầu tiên trong nước được<br /> công bố đã phân lập được 2 hợp chất flavonoid<br /> là vitexin (25mg) và isoquercitrin (200mg) có<br /> hoạt tính chống oxi hóa từ phân đoạn etyl acetat<br /> trong lá Chùm ngây.<br /> Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa các chất<br /> phân lập được cho thấy:<br /> - Isoquercitrin có hoạt tính quyét gốc tự do<br /> DPPH cao hơn vitexin và cao hơn chứng dương<br /> vitamin C.<br /> - Vitexin đạt được 21,66 % năng lực khử<br /> của vitamin C và isoquercitrin đạt được 70%<br /> năng lực khử của Vitamin C<br /> - Vitexin có hoạt tính quét gốc hydroxyl tự<br /> do cao nhất, cao hơn vitamin C.<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr.PL – 182, PL<br /> – 183, PL – 239.<br /> Deepralard K., Kazuko K., Masataka M., Thitima P., Rutt S.<br /> (2009). Flavonoid glycosides from the leave of Uvaria rufa with<br /> advanced glycation end – products inhibitory activity. Thai J.<br /> Pharm. Sci., 33, pp. 84 – 90<br /> Li TR, Yang ZY, Wang BD (2007). Synthesis, characterization<br /> and antioxidant of naringenin schiff base and its Cu (II), Ni(II),<br /> Zn (II) complexes. Chem Pharm Bull, 55, pp. 26 – 28.<br /> Nguyễn Thị Thu Hương (2010). Nghiên cứu tác dụng chống oxy<br /> hóa theo hướng bảo vệ gan của nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum.<br /> Tạp chí Y học TP. HCM, tập 14 số 2, tr. 131 - 132<br /> Pilaipark C., Panya K., Yupin S., Srichan P., Noppawan M<br /> (2008). The in vitro and ex vitro antioxidant properties,<br /> hypolipidaemic and antitherosclerotic activities of water extract<br /> of Moringa oleifera Lam. Leave. Journal of Ethnopharmacology,<br /> 119, pp. 439 – 436.<br /> Zhang Z., Jin J., Shi L. (2008). Antioxidant activities of derivative<br /> of polysacchride extracted from a Chinese medical herb<br /> (Ramulus mori). Food Sci. Technol. Res., 14, pp. 160 -1 68.<br /> Zhou X., Peng J., Guorong F. (2005). Isolation and purification of<br /> flavonoid glycosides from Trollius ledebouri using high-speed<br /> counter-current chromatography by stepwise increasing the<br /> flow-rate of the mobile phase. J Chromatoqr A., 1092 (2), pp. 216 –<br /> 221.<br /> <br /> Ngày nhận bài báo:<br /> <br /> 3/10/2013<br /> <br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo:<br /> <br /> 15/10/2013,<br /> 20/10/2013<br /> <br /> Ngày bài báo được đăng:<br /> <br /> 02/01/2014<br /> <br /> 179<br /> <br />