phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt)

Chia sẻ: Nguyen Phuong Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

120
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian. Sử dụng cơ chất phát xạ huỳnh quang là phương pháp khá nhạy và có thể phát hiện được tới một phân tử chất phát xạ (fluorescein). Nói chung với các mẫu sinh phẩm thường có mức độ nhiễu tín hiệu nền cao. Thực tế này có thể được cải thiện với cơ chất fluorophore bền bị kích hoạt bởi sóng ánh sáng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt)

3, Cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian. Sử dụng cơ chất phát xạ huỳnh quang là phương pháp khá nhạy và có thể phát hiện được tới một phân tử chất phát xạ (fluorescein). Nói chung với các mẫu sinh phẩm thường có mức độ
nhiễu tín hiệu nền cao. Thực tế này có thể được cải thiện với cơ chất fluorophore bền bị kích hoạt bởi sóng ánh sáng. Sự phát xạ sau đó được ghi lại khi các bức xạ nền đã bị giảm. Đối với phương pháp dùng Alkaline phosphatase thì việc phát hiện nhân tố gắn lanthanide theo thời gian đi kèm với hoạt tính enzym này gọi là phương pháp phát quang lanthanide khuyếch đại bởi enzym (EALL: Evangelista, Pollack & Templeton, 1991). Trong trường hợp này, cơ chất không có khả hình thành phức hệ gắn với lathanide phát xạ. Dưới tác dụng của Alkaline phosphatase thì cơ chất và lanthalide bị chuyển thành
phức hệ hoạt động. Phương pháp này khá nhạy nhưng hạn chế lớn nhất của nó là cần thiết bị kích hoạt và đo bức xạ huỳnh quang. + Quá trình lai: Nói chung quá trình lai (Hybridization ) được tiến hành theo một trong 3 cách sau để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai trong dịch thể và lai với chất mang (solid support). a. Kỹ thuật lai với vi sinh vật (in situ), hình 1.4.
Hình 1.4. Minh hoạ kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridization) phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori. Kỹ thuật này được thực hiện để định vị chuỗi acid nucleic trong vi sinh vật sau khi đã được cố định trong các tiêu bản hiển vi. Tuy nhiên, do hầu hết các vi sinh vật có khả năng thấm (hay cho phép) các đoạn ngắn oligonucleotid đánh dấu
đi vào tế bào sau khi cố định mẫu vì vậy khi sử dụng mẫu dò đánh dấu với chất nhuộm huỳnh quang đặc biệt có thể nhìn thấy được trực tiếp vi sinh vật dưới kính hiển vi huỳnh quang. Điều đáng chú ý là phản ứng lai phải tiến hành trong thiết bị được hàn kín nhằm hạn chế việc bay hơi của dịch lai. Việc bay hơi dịch lai này dẫn đến việc bám không đặc hiệu của chất nhuộm huỳnh quang với tế bào. Nhiệt độ lai phụ thuộc vào oligonucleotid mẫu dò. Sau phản ứng lai thì mẫu phải được xem ngay hoặc được bảo quản trong tối trong thời gian 6 tháng. Nếu mẫu dò đặc hiệu cho RNA thì độ nhạy tăng lên rất lớn vì
có tới hàng ngàn bản copy của RNA trong mỗi tế bào (Stahl và Amman, 1991). Lai trong môi trường dịch thể: Phản ứng lai trong môi trường dịch thể xảy ra nhanh hơn nhiều so với môi trường có chất mang pha rắn (soild). Do cả phân tử ADN đích và mẫu dò đều có thể di động tự do trong môi trường do đó phản ứng đạt kết quả cao nhất. Nói chung với phép lai thực hiện trong dịch thể thì thời gian kết thúc nhanh hơn từ 5-10 lần so với trong điều kiện là chất mang (Bryan, et al., 1986). Tuy nhiên, cũng có thể
bổ sung thêm chất mang làm tăng phản ứng lai. Cần thêm bước cuối cùng là tách phức hợp mẫu dò-sợi ADN đích. Hạn chế ở đây là mẫu trong dịch cho nên có thể tạo lên các nền kém đặc hiệu, do vậy cần các giải pháp làm hạn chế mức độ nhiễu của nền cho thích hợp. Hình 1.5. Minh hoạ kỹ thuật lai trong môi trường dịch thể.
Trên thực tế hầu hết các KIT thương phẩm dùng cho vi sinh vật đều tiến hành trong môi trường dịch thể. Vi sinh vật trong mẫu đầu tiên được phân giải trong điều kiện thích hợp để ADN đích lai với mẫu dò. Sau đó là bước lai và tách phức hệ mẫu dò và ADN đích dựa vào các thông số của phép lai theo kiểu kẹp díp cụ thể. Các phép lai theo kiểu kẹp díp (hình 1.9) cần có hai đoạn ADN có trình tự khác nhau; một đoạn để bám giữ ADN đích gắn vào chất mang và một đoạn là mẫu dò. Điều quan trọng là hai đoạn ADN này phải có trình tự khác nhau cho dù chúng đều gắn với hai vùng khác nhau trên đoạn
ADN đích theo nguyên tắc bổ sung. Mẫu dò đánh dấu được bổ sung vào trong dung dịch có các đoạn ADN đích nghiên cứu. Như vậy theo hình vẽ phức hợp ADN mẫu dò đánh dấu để phát hiện gắn với ADN đích và phức hợp mẫu dò- ADN đích gắn vào chất mang đã được hình thành. Phức hợp này được tách ra khỏi dung dịch và khi có mặt cơ chất thích hợp để phát hiện được mẫu dò đánh dấu. Khi dùng hệ thống phát hiện dựa vào các hoá chất huỳnh quang hay tạo màu có thể dùng thiết bị phát hiện kết quả một cách tự động. + Kỹ thuật lai dựa vào màng:
Tác giả đầu tiên giới thiệu kỹ thuật cố định ADN trên màng là Nygaard và Hall (1963, 1964). Sau đó chính Southern (1975) là người mô tả việc tách ADN khỏi gel sau khi điện di và chuyển chúng lên màng nitrocellulose. Các đoạn ADN đích được phát hiện bằng kỹ thuật lai và đây là bước tiến quan trọng của sinh học phân tử. Từ năm 1977 đến nay đã có nhiều cải tiến về phép lai cũng như bước chuyển ADN lên màng của các tác giả khác nhau như: Meinkoth và Wahl (1984). Người ta cũng đã sử dụng một số màng nynol, màng nitrocellulose hoạt hoá hay có độ bền cho các phép lai. Đối với công
việc định loại vi sinh vật với kỹ thuật cố định trên màng cho phép lai ADN thì cần chấm mẫu (là ADN sạch, hay tế bào vi sinh vật hoặc sinh phẩm có vi sinh vật nghiên cứu) lên màng thích hợp. Mẫu được ly giải và ADN bị biến tính, sau đó ADN được cố định trên màng khi đưa vào tủ xấy tại 80oC trong 2 giờ hoặc đưa vào xử lý với tia UV trong trường hợp sử dụng màng lynon. Mẫu dò đánh dấu sau đó được đưa vào dung dịch. Bước tiền lai được thực hiện để hạn chế các mẫu bám vào nhau không đặc hiệu. Sau đó là bước lai, màng sau khi lai được rửa để loại các mẫu dò còn dư. Bước rửa tiếp theo để đánh
giá mức độ bám đặc hiệu của phép lai. Sau đó các mẫu dò đánh dấu lai với vị trí ADN mẫu trên màng được phát hiện bằng các hệ thống phát hiện tương thích. Toàn bộ quá trình lai trên màng đã được Meinkoth và Wahl (1984) mô tả chi tiết. Khi phát hiện typ vi sinh vật, chúng ta phải sử dụng kỹ thuật Southern. Trong phương pháp này ADN của nhiễm sắc thể được tinh sạch và được xử lý với enzym cắt hạn chế thích hợp, sau đó mẫu lại được điện di trên gel agarose và tạo ra dấu vân (finger print) của nhiễm sắc thể. Sau khi điện di gel được đặt dưới màng nitrocellulose hay
màng nylon nằm giữa một số lớp giấy. Lớp giấy lọc phía trên được đặt trên cùng phần gel và màng kẹp giữa giấy lọc như trong hình 1.6. Hình 1.6. Mô tả phương pháp chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật Southern Blot. Kết quả là đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên. Điều đó giúp cho việc chuyển các mảnh ADN từ gel lên màng và
bám chặt vào màng với kích thước và phiên bản đúng như trên gel sau khi điện di (mô tả chi tiết theo Sambrook 1989). Phương pháp truyền thống này cũng được cải tiến khi dùng màng nylon để chuyển ADN trong điều kiện biến tính (Read và Mann 1985). Thời gian chuyển có thể vài giờ hoặc qua đêm. Việc cố định ADN trên màng được thực hiện sau đó bằng cách xử lý nhiệt hay tia UV như đã trình bày ở trên. Tuy nhiên, nhiều phương pháp cải tiến được thực hiện nhanh như chuyển bằng điện di (Bittner, Kupfere, Morris, 1980) hay sử dụng bơm
chân không (Medveczky, 1987; Olszewsk, 1988). Trong nhiều trường hợp dùng điện để chuyển ADN từ gel agarose lên màng thì trước tiên gel phải được xử lý biến tính và được làm trung hoà trở lại. Gel được đặt giữa hai bản điện có các bản giấy thấm (hình 1.7). Hình 1.7. Minh hoạ bước chuyển ADN lên màng.
Sau đó nguồn điện được nối và lúc đó ADN sẽ được chuyển lên màng. Thời gian chuyển sẽ phụ thuộc vào kích thước đoạn ADN nhưng thường dao động trong khoảng 1-3 giờ. Phương pháp có thể thực hiện theo chiều thẳng đứng hay chiều nằm ngang. Hiện nay có một số thiết bị bán trên thị trường được dùng cho kỹ thuật này. Với thiết bị nằm thẳng đứng, thì toàn bộ được ngâm trong đệm và có thể tăng cường độ dòng điện (chú ý vì có thể làm tăng nhiệt độ), phương pháp này cần dùng nhiều đệm. Ngược lại theo phương pháp nằm ngang hay phương pháp semi-dry, ở đây gel và màng được kẹp giữa
các bản giấy lọc đã tẩm ướt bằng đệm thích hợp. Trường hợp này cần rất ít đệm và cường độ dòng điện là 1mA/cm2 là thích hợp. Trong trường hợp chuyển ADN lên màng bằng áp lực do chân không, việc thiết lập hệ thống được trình bày mà ở đó gel được đặt trên màng và sử dụng lực hút chân không để đưa ADN lên màng. Dùng lực hút chân không đạt được hiệu quả chuyển ADN lên màng cao hơn phương pháp thấm tự nhiên. Hiệu quả tối đa cho chuyển gel với trường hợp geneom sau xử lý enzym cắt hạn chế có thể đạt được sau 1 giờ.
+ Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN. Giới thiệu phương pháp: Như đã trình bày, sự phức tạp trong kỹ thuật RELP đã tạo ra những khó khăn cho việc xác định các tác nhân gây bệnh trong các nghiên cứu về dịch tễ học. Điều này còn khó khăn và phức tạp hơn trong khi so sánh các kết quả thu được trên các bản gel khác nhau hoặc tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Nguyên nhân là do số lượng các băng ADN lớn tới mức không thể xác định kích thước của chúng hay các băng thu được không lặp lại các kết quả nghiên cứu.
Mặc dù vậy, theo phương pháp này các phổ ADN phức tạp sau khi xử lý với enzym cắt hạn chế sẽ được làm biến tính và chuyển lên màng nitroxenluloza hay nylon. Màng sẽ được lai với mẫu dò thích hợp, kết quả phổ phép lai sẽ rõ và không quá phức tạp do nó chỉ hiển thị các mảnh ADN bắt cặp với mẫu dò. Với một số lượng không lớn các mảnh hiển thị thu được sau phép lai sẽ cho phép xác định được chính xác hơn về kích thước. Điều này làm cơ sở cho so sánh giữa các gel với nhau cũng như kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau.
Khi sử dụng phương pháp này cần chú ý một số mẫu dò sau: 1, Mẫu dò có thể là đoạn RNA ribosom từ một loài sinh vật nào đó: ví dụ rRNA của E.coli có thể được các công ty thương phẩm cung cấp (Boeringer Mannheim), đây là mẫu dò khá thuận lợi và được đánh dấu phóng xạ hay với các cơ chất huỳnh quang. Ưu điểm chính của mẫu dò này ở chỗ phần RNA là đoạn khá bảo thủ do đó mẫu dò có thể dùng lai với các sản phẩm xử lý enzym cắt hạn chế của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Có một số loài khi lai với mẫu dò chỉ cho một kết quả giống nhau trong khi đó ở loài khác khi lai các chủng