Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký

Chia sẻ: Bảo Phúc | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

1.028
lượt xem 139
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl và ít nhất một nhóm amino trừ prolin chỉ có nhóm NH(thực chất là một acid imin). Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau, do đó việc phân tích chúng để xác định thành phần axit amin hoặc hàm lượng của các protein, peptide, và các chế phẩm dược phẩm khác rất cần thiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ KHOA CƠ KHÍ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký GVHD : PHẠM TRẦN THÙY HƯƠNG NHÓM :2.5
A.ĐẶT VẤN ĐỀ A.Đ Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl và ít nhất một nhóm amino trừ prolin chỉ có nhóm NH(thực chất là một acid imin). Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau, do đó việc phân tích chúng để xác định thành phần axit amin hoặc hàm lượng của các protein, peptide, và các chế phẩm dược phẩm khác rất cần thiết.
B.NỘI DUNG B.N I.Xử lý mẫu Tạo dẫn xuất 1. Thủy phân protien,peptide Có nhiều cách thủy phân : bằng axit, kiềm, enzim tùy vào loại thực phẩm và thành phần của protien. Thứ tự thủy phân : +Đốt nóng lò ở 105 ÷ 112oC khoảng 20 30 phút trước khi thủy phân +Cân mẫu và làm giàu protein (tùy vào loại thực phẩm) +Dùng tác nhân để thủy phân (như HCl phải có phenol để ngăn cản halogel hóa của tyrosin )
2. Tạo dẫn xuất: 2.  Tăng độ nhạy trong quá trình phân tích người ta th ường Tăng tạo dẫn xuất acid amin, trong đó có các axit amin phản ứng với một tiền chất để mang lại khả năng hấp thụ m ạnh tia UV/Vis hoặc một tạo một hợp chất huỳnh quang. Có nhiều chất để tạo dẫn xuất với protien nh ư: Có  o-phthalaldehyde (OPA), Phenylisothiocyanate (PITC), o-phthalaldehyde carbamate 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl (AQC) ...Ứng với mỗi dẫn xuất thì chọn detector có bước (AQC) sóng khác nhau.  Việc tạo dẫn xuất phải thực hiện qua nhi ều b ước.  Quy trình sấy khô Quy Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khô lại Cho vào bình định mức Tiến hành sấy khô hút chân không cho đến khô
 Chuẩn bị dung dich dẫn xuất Chuẩn bị hỗn hợp theo tỉ lệ các chất tùy vào phương pháp dẫn xuất  Tạo dẫn xuất Rút 20µl hỗn hợp dung dịch tạo dẫn xuất mới pha ở trên, cho vào mỗi ống mẫu đã sấy khô Lắc vài giây Để yên 20 phút ở nhiệt độ 2025oC Sấy khô
a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA o-phthalaldehyde hoặc ortho-  phthalaldehyde (OPA) là các hợp chất hóa học với công thức C6 H4 (CHO)2. (CHO) Thường được viết tắt OPA, phân tử  này là một dialdehyde bao gồm hai nhóm formyl (CHO) gắn liền kề trên một vòng benzene. Là chất rắn màu vàng nhạt được dùng trong việc tổng hợp các hợp chất dị vòng và là một OPA thuốc thử trong phân tích của các acid amin.
a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Ortho-phthalaldehyde (OPA) được hòa tan và ổn định  trong dung dịch nước ở pH
a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA a. Có 2 phương pháp tạo dẫn xuất OPA: tạo dẫn xuất ti ền cột (Precolumn derivatization) và tạo dẫn xuất sau c ột (derivatization postcolumn). Dẫn xuất tiền cột:  Nguyên tắc chung tạo Precolumn derivatization là tạo dẫn xuất của các axit amin với o- phthalaldehyde (OPA), tiếp theo là tách HPLC ngược pha, các sắc ký lỏng được trang bị một máy dò fluorometric để phát hiện các dẫn xuất acid amin. Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được theo dõi với bước sóng kích thích 348 nm và bước sóng phát xạ 450 nm.
a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất tiền cột:  ophthalaldehyde (OPA) phản ứng với các acid amin với sự có mặt của hợp chất thiol để hình thành các sản phẩm huỳnh quang. N-acetyl-L-cysteine và 2 -mercaptoethanol có thể được sử dụng như là các thiol.  OPA tự nó không phát huỳnh quang và do đó không ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất tiền cột:  Độ hòa tan và độ ổn định của nó trong dung dịch nước cùng với tốc độ phản ứng nhanh nên có thể tạo dẫn xuất tự động và phân tích bằng cách sử dụng một máy lấy mẫu tự động, dẫn xuất này có độ nhạy rất cao, giới hạn phát hiện tối thiểu là 50 fmol (10 -15mol) mol)  Tuy nhiên, vì không có khả năng phản ứng với acid amin thứ cấp nên làm hạn chế ưu thế của phương pháp tạo dẫn xuất này. Phương pháp này không phân tích được các acid amin thứ cấp (ví dụ như proline).
a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất sau cột  Nguyên tắc tạo dẫn xuất sau cột là sử dụng cột trao đổi ion để tách các axit amin tự do, tiếp theo là quá trình oxy hóa các acid amid bằng hypochlorite natri rồi thực hiện phản ứng với OPA với sự có mặt của hợp chất thiol như N-acetyl-L-cysteine và 2-mercaptoethanol  Mặc dù OPA không phản ứng với các amin thứ cấp ( proline) để tạo thành các chất huỳnh quang, nhưng quá trình oxy hóa bằng hypochlorite natri cho phép các amin thứ cấp phản ứng với OPA.
a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất sau cột  Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được đo với một bước sóng kích thích 348 nm và phát xạ bước sóng 450 nm vì vậy khi tiến hành phân tích dùng đầu dò huỳnh quang 348nm.  Giới hạn phát hiện tối thiểu khoảng một vài chục pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin, tuyến tính trong phạm vi của một vài pmol đến vài chục nmol.  So với dẫn xuất tiền cột thì dẫn xuất này có độ nhạy thấp hơn tuy nhiên ưu điểm là có thể phân tích được acid amin thứ cấp.
b. Phương pháp tạo dẫn xuất NBD-F  Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất NBDF là phản ứng của các acid amin với 7fluoro4 nitrobenzo2oxa1.3diazole (NBDF), NBD F phản ứng với các acid amin kể cả các acid amin thứ cấp để tạo thành sản phẩm cao huỳnh quang, tiếp theo là tách HPLC pha đảo với sử dụng đầu dò huỳnh quang bước sóng kích thích là 480 nm và bước sóng phát xạ là 530 nm. NBDF
b. Phương pháp tạo dẫn xuất NBD-F  Các điều kiện tốt nhất cho phản ứng tạo dẫn xuất là ở nhiệt độ 60oC và môi trường kiềm trong 5 phút, sau đó dùng acid HCl bổ sung vào hỗn hợp để hạn chế ảnh hưởng của chất chất nền huỳnh quang.  Ưu điểm: Độ nhạy của phương pháp này gần với phương pháp tạo dẫn xuất tiền cột OPA nhưng có ưu điểm hơn là phản ứng được với acid amin thứ cấp.  Giới hạn phát hiện của phương pháp tạo dẫn xuất này cho mỗi acid amin là khoảng 10 fmol.
c. Phương pháp tạo dẫn xuất PITC Phenyl isothiocyanate (PITC) là  một thuốc thử được sử dụng trong HPLC pha đảo ngược PITC, ít nhạy cảm hơn (OPA) và không thể hoàn toàn tự động tuy nhiên PITC có thể tạo sản phẩm ổn định với tất cả các axit amin, trong đó có acid amin thứ cấp (proline). PITC phản ứng với axit amin để tạo  thành phenylthiocarbamyl (PTC) hấp thụ cực đại bước sóng tử ngoại 254 nm
c. Phương pháp tạo dẫn xuất PITC Đầu tiên loại hết HCl dư và làm khô. Sau khi đã làm khô bổ  sung thuốc thử tạo dẫn xuất gồm ethanol:TEA: nước cất: PITC = 7:1:1:1, làm sạch dẫn xuất bằng cách hạ áp suất trong 30 45 phút. Lưu trữ mẫu dẫn xuất PITC sau khi sấy khô, tái sử dụng dẫn  xuất bằng cách hòa tan lại nó vào dung dịch đệm photphat pH= 7,4 và acetonitrile với tỉ lệ 95:5 chỉ có thể giữ được tối đa một ngày ở nhiệt độ phòng, hay 6070 giờ khi để trong tủ lạnh.
c. Phương pháp tạo dẫn xuất PITC Phát hiện các dẫn xuất bằng cách sử dụng một máy dò tia cực tím ở  254 nm, giới hạn phát hiện tối thiểu được khoảng 1 pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin. Tuyến tính thu được trong khoảng 20 500 pmol. Các thuốc thử PITC là dễ bay hơi, làm cho nó có thể loại bỏ thuốc  thử dư thừa, qua đó giảm thiểu khả năng ảnh hưởng của thuốc thử. PITC chỉ có thể áp dụng cho trường hợp tạo dẫn xuất tiền cột vì sự  chuẩn bị mẫu và tạo dẫn xuất yêu cầu thời gian dài.
II. Định lượng axit amin bằng phương II. pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)  Nguyên tắc của phương pháp: • HPLC là phương pháp sắc ký được phát triển dựa trên phương pháp ghi sắc ký cột, các chất phân tích khi qua cột sắc ký do có ái lực khác nhau với pha động( dung môi) và pha tĩnh (các hạt nhồi trong cột) mà chúng ra khỏi cột với thời gian khác nhau,chất nào có ái lực với pha tĩnh lớn hơn sẽ giữ trong cột lâu hơn, còn chất có ái lực nhỏ với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột cùng với pha động sớm hơn . • Thay vì để dung môi nhỏ giọt qua một cột ghi sắc ký dưới tác dụng của trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng 400at để sự dịch chuyển xảy ra nhanh hơn. • Phương pháp này cho phép chúng ta sử dụng các hạt có kích thước nhỏ trong cột hấp phụ và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh và các phân tử chất phân tích đi qua nó. Điều này sẽ tăng cường khả năng phân tích các chất có trong hỗn hợp.
II. Định lượng axit amin bằng phương II. pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC) 1. Chuẩn bị dung dịch axit amin chuẩn: Dùng pipet tự động rút 3,5,7,10 µl dung dịch axit amin chuẩn cho  vào ống nghiệm và làm dẫn xuất như đối với dung dịch mẫu Chú ý Sấy khô mẫu tạo dẫn xuất để loại bỏ những vết cuối cùng của  PITC Cần chuấn bị tạo dẫn xuất ở mỗi lần phân tích  Ở nhiệt độ phòng,các mẫu đã được pha loãng chỉ cho kết quả ổn  định trong vòng 10 giờ.Còn các mẫu chưa pha loãng thì có thể giữ được trong 60 giờ,Vì vậy không nên lưu trữ các mẫu chưa pha loãng.Những mẫu khô có thể để nhiều tuần trong tủ đông. 2. Xử lí mẫu (như đã trình bày ở trên )
II. Định lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC) 3. Dụng cụ hóa chất 3. D Dung dịch HCL 6M có bổ sung phenol 1% (10 μl  phenol cho vào 1 ml hcl Bình khí nitơ  Chất tạo dẫn xuất như Phenylisothiocyanate ( PITC) ,  Triethylamine (TEA)  Ethanol loại dùng cho HPLC  Nước cất lần 2 Dụng cụ và thiết bị hỗ trợ cho sắc ký 