Phát hiện đột biến gen RB ở mức rna trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN RB Ở MỨC RNA  <br /> TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC <br /> Hoàng Anh Vũ*, Nguyễn Công Kiệt** <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Giới thiệu: Đột biến gen RB gây nên u nguyên bào võng mạc (UNBVM). Phát hiện đột biến gen RB có ý <br /> nghĩa quan trọng trong việc hoạch định chương trình tầm soát ung thư cho người lành mang gen đột biến cũng <br /> như góp phần đánh giá nguy cơ xuất hiện bệnh ở mắt còn lại trên bệnh nhân đang được điều trị. <br /> Mục tiêu: Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen RB từ RNA của máu và mô <br /> u. <br /> Đối tượng và phương pháp: Toàn bộ vùng mã hóa protein của gen RB gồm 27 exon đã được khuếch đại và <br /> giải trình tự chuỗi DNA từ 4 bệnh nhân. <br /> Kết quả: Chúng tôi phát hiện một bệnh nhân có đột biến mất đoạn exon 2, một bệnh nhân bị mất đoạn exon <br /> 14 và một bệnh nhân bị chèn thymine trên exon 3. <br /> Kết  luận: Kỹ thuật xác định đột biến gen RB ở mức RNA có thể ứng dụng trong công tác chẩn đoán và <br /> điều trị cho bệnh nhân. <br /> Từ khóa: u nguyên bào võng mạc, đột biến gen RB, giải trình tự chuỗi DNA <br /> <br /> ABSTRACT <br /> DETECTION OF RB MUTATIONS AT RNA LEVEL IN RETINOBLASTOMA PATIENTS <br /> Hoang Anh Vu, Nguyen Cong Kiet <br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 72 ‐ 75 <br /> Introduction: Mutations in the RB gene cause retinoblastoma. Detection of RB mutations is important for <br /> a strategy for cancer screening in carriers and for prediction of relapse in retinoblastoma patients. <br /> Objective: This study  aims  to  establish  a  testing  procedure  for  RB  mutant  identification  from  blood  and <br /> tumor‐derived RNA. <br /> Patients and methods: The RB coding region encompassing 27 exons were amplified and sequenced from <br /> 4 patients. <br /> Results:  We  found  RB  mutations  in  3  patients,  including  deletion  of  exon  2,  deletion  of  exon  14  and <br /> insertion of thymine in exon 3. <br /> Conclusion: The technique described here should be applied to clinical setting. <br /> Key words: retinoblastoma, RB gene mutation, DNA sequencing <br /> sinh  sống  và  không  có  sự  khác  biệt  giữa  các <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> chủng tộc và giới tính(6). Bệnh thường biểu hiện <br /> U nguyên bào võng mạc (UNBVM) là dạng <br /> trước 3 tuổi với các dấu hiệu đồng tử  trắng, lé, <br /> ung  thư  hốc  mắt  thường  gặp  nhất  ở  trẻ  em, <br /> thị lực kém, mắt đỏ và đau (khi có biến chứng). <br /> chiếm khoảng 3% trong tổng số các trường hợp <br /> Các  trường  hợp  UNBVM  có  tính  gia  đình <br /> ung thư trong lứa tuổi này. Tần suất bệnh được <br /> chiếm  40%,  thường  có  nhiều  u,  biểu  hiện  ở  cả <br /> ước  tính  trong  khoảng  1/15.000  –  1/20.000  trẻ <br /> hai mắt và xuất hiện triệu chứng sớm trong năm <br /> *Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM <br /> <br /> **Bộ môn Mắt, Đại học Y Dược TPHCM <br /> <br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Hoàng Anh Vũ <br /> <br /> Email: hoangvuxinh@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh <br /> <br /> ĐT: 0122‐2993537<br /> <br /> 71<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013<br /> <br /> đầu  tiên(8).  Các  trường  hợp  ngẫu  nhiên  thường <br /> chỉ  có  1  khối  u  của  1  bên  mắt  và  khởi  phát  trễ <br /> hơn. Tại Việt Nam, hầu hết bệnh nhi thường chỉ <br /> được  phát  hiện  ở  giai  đoạn  trễ,  xâm  lấn  nhiều, <br /> đe  dọa  tính  mạng  nên  điều  trị  bảo  tồn  rất  hạn <br /> chế  và  phải  cắt  bỏ  nhãn  cầu(8).  Trong  khi  đó,  ở <br /> các nước phát triển, tỷ lệ điều trị thành công trên <br /> 95% do được phát hiện sớm(7). <br /> Đột biến gen RB gây ra sự bất hoạt của cả 2 <br /> alen  đã  được  xác  định  là  nguyên  nhân  gây <br /> UNBVM  trong  cả  các  trường  hợp  có  tính  gia <br /> đình  và  ngẫu  nhiên(5).  Đột  biến  ở  alen  đầu  tiên <br /> có thể là đột biến mầm ở các trường hợp có tính <br /> gia đình hoặc đột biến sinh dưỡng trong trường <br /> hợp  bệnh  ngẫu  nhiên;  trong  khi  đó  đột  biến  ở <br /> alen thứ hai là đột biến sinh dưỡng xảy ra trên tế <br /> bào của võng mạc. Việc phát hiện đột biến gen <br /> RB trong UNBVM có ý nghĩa quan trọng trong <br /> việc hoạch định chương trình tầm soát ung thư <br /> cho  người  lành  mang  gen  đột  biến  cũng  như <br /> góp  phần  đánh  giá  nguy  cơ  tái  phát  trên  bệnh <br /> nhân đang được điều trị(2,6). <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> Đối tượng nghiên cứu <br /> 4  bệnh  nhi  UNBVM  được  điều  trị  tại  Bệnh <br /> viện  Mắt  TPHCM  thỏa  các  điều  kiện:  Bệnh  nhi <br /> được chẩn đoán xác định UNBVM dựa vào kết <br /> quả khám lâm sàng, chụp cắt lớp điện toán, siêu <br /> âm và giải phẫu bệnh sau khi được cắt bỏ nhãn <br /> cầu.  Cha  mẹ  của  mỗi  bệnh  nhi  có  giấy  đồng <br /> thuận tự nguyện tham gia nghiên cứu này.  <br /> <br /> Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA <br /> Từ  mỗi  bệnh  nhi,  chúng  tôi  thu  nhận  4  mL <br /> máu ngoại vi được chống đông trong EDTA có <br /> bổ  sung  puromycin  (200  μg/mL)  và  lắc  nhẹ <br /> trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó RNA được <br /> tách  chiết  bằng  RNeasy  mini  Kit  (Qiagen,  Mỹ) <br /> theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được đo <br /> nồng  độ  bằng  máy  quang  phổ  kế <br /> spectrophotometer. DNA bổ sung (complement <br /> DNA  hay  cDNA)  được  tổng  hợp  từ  1  μg  RNA <br /> với  bộ  hóa  chất  SuperScript™  II  Reverse <br /> Transcriptase  (Invitrogen,  Mỹ).  Chất  lượng <br /> <br /> 72<br /> <br /> cDNA được kiểm tra bằng cách khuếch đại đoạn <br /> cDNA  của  gen  beta‐actin  dài  1180  bp.  Ở  một <br /> bệnh  nhân,  mẫu  mô  u  cũng  được  thu  nhận  để <br /> đối  chiếu  với  kết  quả  đột  biến  gen  phát  hiện <br /> trong máu. <br /> <br /> Thiết  kế  mồi  cho  PCR  (polymerase  chain <br /> reaction) <br /> Toàn  bộ  vùng  mã  hóa  protein  của  gen  RB <br /> dài  khoảng  3  kb  được  khuếch  đại  bằng  2  cặp <br /> mồi được thiết kết với phần mềm Oligo 4.1 dựa <br /> trên  trình  tự  chuẩn  của  RB  mang  accession <br /> number  NM_000321  trong  GenBank.  Thông  tin <br /> các đoạn mồi được trình bày trong Bảng 1. <br /> Bảng 1: Thông tin về các đoạn mồi dùng cho PCR. <br /> Tên<br /> mồi<br /> <br /> Vùng gen<br /> được<br /> khuếch<br /> đại<br /> RBExon 1 –<br /> TGTAACGGGAGTCGGGAGAG<br /> 1F<br /> 16<br /> RBCCATGGGAAAGACAAATCTG<br /> 3R<br /> RBExon 17 –<br /> GAGGTTGTAATGGCCACATA<br /> 4F<br /> 27<br /> RB5R<br /> <br /> Trình tự (5’---3’)<br /> <br /> Sản<br /> phẩm<br /> PCR<br /> (bp)<br /> 1652<br /> <br /> 1380<br /> <br /> CAGTCACATCTGTGAGAGAC<br /> <br /> Thực hiện PCR <br /> Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 25 μL, <br /> các thành phần gồm  có  PCR  buffer,  dNTP  (250 <br /> μM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 <br /> μM  cho  mỗi  loại),  TaKaRa  TaqTM  HotStart <br /> Polymerase (Takara Bio, Nhật Bản) và cDNA (25 <br /> ng). Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy <br /> GeneAmp®  PCR  system  9700  (Applied <br /> Biosystems,  Mỹ)  bao  gồm  giai  đoạn  biến  tính <br /> ban  đầu  ở  980C  trong  2  phút,  theo  sau  bằng  45 <br /> chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn <br /> mồi ở 600C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở <br /> 720C  trong  90  giây  và  kết  thúc  bằng  giai  đoạn <br /> kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm <br /> PCR  được  phát  hiện  bằng  điện  di  trên  thạch <br /> agarose  1,2%  có  nhuộm  ethidium  bromide  và <br /> quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật <br /> Bản), tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit <br /> và  được  kiểm  tra  lại  bằng  điện  di  trên  thạch <br /> agarose 1,2%. <br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA <br /> Sản  phẩm  PCR  đã  được  tinh  sạch  sẽ  được <br /> thực  hiện  phản  ứng  cycle  sequencing  với <br /> BigDye  V3.1  (Applied  Biosystems,  Mỹ),  theo  2 <br /> chiều  xuôi  và  ngược.  Các  đoạn  mồi  dùng  cho <br /> cycle sequencing được liệt kê trong Bảng 2. Sản <br /> phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan <br /> trong Hi‐Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 <br /> phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA <br /> được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, <br /> với POP‐7 polymer và capillary 80 cm (Applied <br /> Biosystems,  Mỹ).  Kết  quả  được  phân  tích  bằng <br /> phần mềm SeqScape. <br /> Bảng 2: Các đoạn mồi dùng cho cycle sequencing. <br /> Tên<br /> RB-1F<br /> RB-2F<br /> RB-3F<br /> RB-4F<br /> RB-5F<br /> RB-1R<br /> RB-2R<br /> RB-3R<br /> RB-4R<br /> RB-5R<br /> <br /> Trình tự (5’---3’)<br /> TGTAACGGGAGTCGGGAGAG<br /> GTATTGTTTGCACTCTTCAG<br /> AATGGACTTCCAGAGGTTGA<br /> GAGGTTGTAATGGCCACATA<br /> GTCTGAGCACCCAGAATTAG<br /> CGAACTGCTGGGTTGTGTCA<br /> CTGTCTATAGAATCAGTCTG<br /> CCATGGGAAAGACAAATCTG<br /> GTTCATACTCATTCTGCAGG<br /> CAGTCACATCTGTGAGAGAC<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN <br /> Xây  dựng  kỹ  thuật  giải  trình  tự  RNA  của <br /> gen RB <br /> Gen RB là một gen lớn nằm trên nhiễm sắc <br /> thể 13, gồm 27 exon chiếm chiều dài hơn 180 kb. <br /> Đột biến trên genomic DNA không có tính khu <br /> trú vào một vùng nhất định nào của gen này mà <br /> phân bố khắp chiều dài gen, làm cho việc khảo <br /> sát đột biến trên genomic DNA rất phức tạp và <br /> tốn kém. Kỹ thuật phân tích đột biến trên RNA <br /> tập trung vào các exon, có thể phát hiện các đột <br /> biến thuộc vùng mã hóa protein của gen. Chúng <br /> tôi  đã  khuếch  đại  thành  công  vùng  mã  hóa <br /> protein  của  gen  RB  bằng  2  phản  ứng  PCR,  với <br /> sản phẩm tương ứng là 1652 bp và 1380 bp, giúp <br /> đơn giản quá trình phân tích đột biến gen (Hình <br /> 1A).  Trước  khi  tách  chiết  RNA,  mẫu  máu  đã <br /> được trộn ủ với puromycin nhằm ngăn chặn sự <br /> thoái hóa các RNA đột biến trong tế bào(1,4,11). <br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh <br /> <br />  <br /> Các  sản  phẩm  PCR  sau  khi  được  tinh  sạch <br /> đã  được  tiến  hành  giải  trình  tự  chuỗi  DNA  để <br /> xác định thay đổi trên exon của gen RB. Toàn bộ <br /> các kết quả giải trình tự chuỗi DNA đều cho kết <br /> quả  đặc  hiệu  với  các  vùng  gen  RB  đã  được <br /> khuếch đại. <br /> <br /> Phát hiện đột biến gen RB trên bệnh nhân <br /> u nguyên bào võng mạc <br /> Từ  mẫu  máu  của  4  bệnh  nhân,  chúng  tôi <br /> phát hiện 3 bệnh nhân có mang đột biến của gen <br /> RB, gồm 2 đột biến mất đoạn và 1 đột biến chèn <br /> đoạn (Hình 1B‐E). Cả 3 đột biến phát hiện trong <br /> máu đều ở trang thái dị hợp tử vì còn hiện diện <br /> alen bình thường khi phân tích sóng giải trình tự <br /> chuỗi DNA. <br /> Đột  biến  mất  đoạn  exon  14  vẫn  bảo  tồn <br /> khung đọc nhưng làm mất đi 19 amino acid do <br /> exon  này  mã  hóa.  Đột  biến  này  đã  được  mô  tả <br /> trên  một  bệnh  nhân  bị  UNBVM  cả  hai  mắt  và <br /> trên người cha bị UNBVM một bên mắt(9). Đây là <br /> một kiểu trượt exon bất thường, chỉ có thể phát <br /> hiện được khi khảo sát ở mức RNA, trong khi cơ <br /> chế  chính  xác  chưa  thể  được  xác  định  trong <br /> phân  tích  đột  biến  trên  genomic  DNA(9).  Khi <br /> phân tích trên mẫu máu, chúng tôi ghi nhận đột <br /> biến  mất  exon  14  ở  trạng  thái  dị  hợp  tử  (Hình <br /> 1B); tuy nhiên phân tích mẫu mô u cho thấy đột <br /> biến này ở trạng thái đồng hợp tử (Hình 1C). Kết <br /> quả phù hợp với vai trò của RB trong phát sinh <br /> UNBVM: đột biến mầm phát hiện trong máu đã <br /> kết  hợp  với  một  sự  cố  thứ  2  trên  tế  bào  võng <br /> mạc làm mất tính dị hợp tử và gây bệnh(3). <br /> <br /> 73<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013<br /> <br /> Gen RB mã hóa protein gồm 928 amino acid. <br /> Đột biến mất exon 2 làm lệch khung đọc, tạo ra <br /> protein với mã dừng sớm ở codon 68, thiếu hầu <br /> hết các vùng quan trọng của protein này (Hình <br /> 1D). Trường hợp này có thể coi đột biến đã làm <br /> mất chức năng ức chế khối u của RB, giải thích <br /> cho  tính  mẫn  cảm  cao  với  sự  hình  thành <br /> UNBVM  trên  bệnh  nhân.  Tương  tự,  đột  biến <br /> thêm 1 nucleotide ở exon 3 cũng làm lệch khung <br /> đọc  và  dừng  tổng  hợp  protein  tại  codon  109 <br /> (Hình 1E). <br /> So  với  kỹ  thuật  khảo  sát  đột  biến  ở  mức <br /> genomic DNA thì kỹ thuật sử  dụng  RNA  cho <br /> phép  xác  định  được  các  hậu  quả  do  đột  biến <br /> DNA  gây  nên:  đó  là  những  bất  thường  hình <br /> thành  trong  quá  trình  phiên  mã  tạo  RNA(9, 12). <br /> Tuy  nhiên,  cần  chú  ý  thao  tác  trên  RNA  đòi <br /> hỏi  các  tiêu  chuẩn  kỹ  thuật  nghiêm  ngặt  hơn <br /> như bảo quản mẫu tươi đúng quy cách, trong <br /> quá  trình  tách  chiết  RNA  và  tổng  hợp  cDNA <br /> tránh  làm  phân  hủy  RNA  do  luôn  có  sự  hiện <br /> diện RNase trên bề mặt da của người thao tác <br /> kỹ thuật. <br /> Trong  nghiên  cứu  này,  có  một  bệnh  nhân <br /> chúng  tôi  không  phát  hiện  đột  biến  nào  trong <br /> vùng mã hóa protein của gen RB. Một số nghiên <br /> cứu cho thấy ngoài các đột biến trên gen RB, sự <br /> bất hoạt của RB còn có thể do hiện tượng methyl <br /> hóa  quá  mức  vùng  điều  hòa  gen(10).  Kỹ  thuật <br /> phát  hiện  tình  trạng  methyl  hóa  đang  được <br /> chúng tôi tiếp  tục  xây  dựng  để  hoàn  thiện  việc <br /> khảo sát bất thường của gen RB. <br /> KẾT LUẬN <br /> Kỹ  thuật  khảo  sát  đột  biến  gen  RB  ở  mức <br /> RNA giúp phát hiện được các đột biến gây bệnh <br /> trên  bệnh  nhân  UNBVM.  Việc  ứng  dụng  kỹ <br /> thuật  này  vào  lâm  sàng  có  thể  giúp  ích  cho <br /> chương  trình  chẩn  đoán  sớm  qua  sàng  lọc  và <br /> theo dõi điều trị. <br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO <br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> 6.<br /> 7.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> 9.<br /> <br /> 10.<br /> <br /> 11.<br /> <br /> 12.<br /> <br /> Andreutti‐Zaugg  C,  Scott  RJ,  Iggo  R  (1997).  Inhibition  of <br /> nonsense‐mediated messenger RNA decay in clinical samples <br /> facilitates detection of human MSH2 mutations with an in vivo <br /> fusion  protein  assay  and  conventional  techniques.  Cancer <br /> Res;57(15):3288‐93. <br /> Bamne  MN,  Ghule  PN,  Jose  J,  Banavali  SD,  Kurkure  PA, <br /> Amare  Kadam  PS(2005).  Constitutional  and  somatic  RB1 <br /> mutation  spectrum  in  nonfamilial  unilateral  and  bilateral <br /> retinoblastoma in India. Genet Test;9(3):200‐211. <br /> Burkhart  DL,  Sage  J(2008).  Cellular  mechanisms  of  tumour <br /> suppression  by  the  retinoblastoma  gene.  Nat  Rev <br /> Cancer;8(9):671‐82. <br /> Dehainault C, Michaux D, Pagès‐Berhouet S, Caux‐Moncoutier <br /> V, Doz F, Desjardins L, Couturier J, Parent P, Stoppa‐Lyonnet <br /> D,  Gauthier‐Villars  M,  Houdayer  C(2007).  A  deep  intronic <br /> mutation  in  the  RB1  gene  leads  to  intronic  sequence <br /> exonisation. Eur J Hum Genet;15(4):473‐7. <br /> Fletcher  O,  Houlston  RS.  Architecture  of  inherited <br /> susceptibility  to  common  cancer(2010).  Nat  Rev <br /> Cancer;10(5):353‐361. <br /> Lin  P,  O’Brien  JM(2009).  Frontiers  in  the  management  of <br /> retinoblastoma. Am J Ophthalmol;148(2):192‐8. <br /> MacCarthy  A,  Draper  GJ,  Steliarova‐Foucher  E,  Kingston <br /> JE(2006).  Retinoblastoma  incidence  and  survival  in  European <br /> children  (1978‐1997):  Report  from  the  Automated  Childhood <br /> Cancer  Information  System  project.  Eur  J  Cancer;42(13):2092‐<br /> 2102. <br /> Nguyễn Công Kiệt(2007). Giá trị của siêu âm và CT trong chẩn <br /> đoán ung thư nguyên bào võng mạc. Y học TPHCM;11(1):278‐<br /> 282. <br /> Parsam VL, Ali MJ, Honavar SG, Vemuganti GK, Kannabiran <br /> C(2011).  Splicing  aberrations  caused  by  constitutional  RB1 <br /> gene mutations in retinoblastoma. J Biosci;36(2):281‐287. <br /> Sheck  LH,  Ng  YS,  Watson  M,  Vincent  AL(2013).  Clinical <br /> Findings and Molecular Diagnosis of Retinoblastoma in Older <br /> Children. Ophthalmic Genet. (Epub ahead of print). <br /> Tsai T, Fulton L, Smith BJ, Mueller RL, Gonzalez GA, Uusitalo <br /> MS,  OʹBrien  JM(2004).  Rapid  identification  of  germline <br /> mutations  in  retinoblastoma  by  protein  truncation  testing. <br /> Arch Ophthalmol;122(2):239‐48. <br /> Zhang K, Nowak I, Rushlow D, Gallie BL, Lohmann DR(2008). <br /> Patterns  of  missplicing  caused  by  RB1  gene  mutations  in <br /> patients with retinoblastoma and association with phenotypic <br /> expression. Hum Mutat;29(4):475‐84. <br /> <br /> Ngày nhận bài báo <br />  <br />  <br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: <br /> Ngày bài báo được đăng: <br />  <br /> <br /> 11‐06‐2013 <br /> 20‐06‐2013 <br /> 15–07‐2013 <br /> <br />  <br /> <br /> 74<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  <br /> <br />