Phát hiện gen blaTEM và blaCTM-M ở các chủng E. coli và klebsiella pneumoniae bằng phản ứng multiplex-PCR

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> PHÁT HIỆN GEN blaTEM VÀ blaCTX-M Ở CÁC CHỦNG E. COLI VÀ<br /> KLEBSIELLA PNEUMONIAE BẰNG PHẢN ỨNG MULTIPLEX-PCR<br /> Nguyễn Đắc Trung*<br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu được tiến hành với 43 chủng E. coli và 24 chủng Klebsiella<br /> pneumoniae phân lập tại Bệnh viện Đa khoa TW Thái Nguyên và Bệnh viện<br /> Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên từ tháng 4 - 2012 đến 4 - 2013. Sàng lọc các<br /> chủng vi khuẩn (VK) có khả năng sinh beta-lactamase phổ rộng (ESBLs, extendedspectrum beta-lactamases) bằng kỹ thuật khoanh giấy đôi (double-disk test).<br /> Khuếch đại các gen ESBL blaTEM và blaCTM-M bằng phản ứng PCR đơn mồi và<br /> multiplex-PCR. Kết quả cho thấy 17 chủng E. coli (39,53%) và 8 chủng K.<br /> pneumoniae (33,33%) sinh ESBL, trong đó 9 chủng E. coli và<br /> 2 chủng K.<br /> pneumoniae chỉ mang gen blaTEM (970 bp). Gen blaCTM-M (540 bp) được tìm thấy ở<br /> 4 chủng E. coli và 5 chủng K. pneumoniae. Đặc biệt, có 2 chủng E. coli mang đồng<br /> thời cả gen blaTEM và blaCTM-M, 2 chủng E. coli và 1 chủng K. pneumoniae không<br /> tìm thấy bất kỳ gen bla nào kể trên.<br /> * Từ khóa: Beta-lactamase phổ rộng; BlaTEM; BlaCTM-M; E. coli; Klebsiella<br /> pneumoniae; Multiplex-PCR.<br /> <br /> DETECTION OF blaTEM AND blaCTX-M GENES IN E. COLI AND<br /> KLEBSIELLA PNEUMONIAE ISOLATES BY MULTIPLEX-PCR<br /> SUMMARY<br /> In the study, 43 isolates of E. coli and 24 isolates of Klebsiella pneumoniae isolated<br /> at Thainguyen Central General Hospital and Thainguyen Hospital of University of<br /> Medicine and Pharmacy from 4 - 2012 to 4 - 2013 were screened for ESBL production<br /> by double-disk test. The amplification for ESBL genes of blaTEM and blaCTX-M was also<br /> undertaken by single PCR and multiplex-PCR. The findings indicated ESBL was found<br /> in 17 of 43 isolates of E. coli (39.53%) and 8 of 24 isolates of K. pneumoniae (33.33%).<br /> With ESBL-producing isolates, gene blaTEM (970 bp) was harbored by 9 of 17 isolates<br /> of E. coli and 2 of 8 isolates of K. pneumoniae, 4 of 17 isolates of E. coli and 5 of 8<br /> isolates of K. pneumoniae possesed gene blaCTM-M (540 bp). Especially, there were 2<br /> isolates of E. coli carrying both gene blaTEM and blaCTM-M. In fact, no targeted gene bla<br /> was detected in 2 isolates of E. coli and 1 isolate of K. pneumoniae.<br /> * Key words: Extended-spectrum beta-lactamases; BlaTEM; BlaCTM-M; E. coli;<br /> Klebsiella pneumoniae; Multiplex-PCR.<br /> * Đại học Y Dược Thái Nguyên<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đắc Trung (dactrung69@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 27/9/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/10/2013<br /> Ngày bài báo được đăng: 8/11/2013<br /> 76<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trong nhiều thập kỷ qua, áp lực<br /> chọn lọc của kháng sinh luôn được<br /> duy trì lên VK gây bệnh do kháng<br /> sinh không được sử dụng hợp lý<br /> trong điều trị lâm sàng các bệnh<br /> nhiễm khuẩn. Áp lực chọn lọc này<br /> làm xuất hiện các beta-lactamase<br /> khác nhau ở một số VK gây bệnh.<br /> Các beta-lactamase phổ rộng<br /> (ESBLs, extended-spectrum betalactamases)<br /> là<br /> những<br /> betalactamase được tạo bởi VK Gram<br /> âm, có khả năng thủy phân kháng<br /> sinh β-lactam có chứa một nhóm<br /> oxyimino (cephalosporins thế hệ 3 và<br /> aztreonam) nhưng lại bị ức chế bởi<br /> các chất ức chế β-lactamase như axit<br /> clavulanic, sulbactam và tazobactam<br /> [2]. ESBLs thường được mã hóa bởi<br /> các gen nằm trên plasmid và được<br /> tìm thấy ở E. coli, Klebsiella và các<br /> VK Gram âm khác [6]. ESBLs phân<br /> thành 3 loại là TEM, SHV và CTX-M<br /> [1, 10]. Ở Việt Nam, việc phát hiện<br /> chủng VK Gram âm sinh ESBLs mới<br /> chỉ dựa vào kết quả kỹ thuật khoanh<br /> giấy đôi (double-disk test) và cũng<br /> chưa phải là một xét nghiệm thường<br /> quy. Thất bại trong việc phát hiện<br /> khả năng hình thành ESBLs bằng kỹ<br /> thuật kháng sinh khuếch tán đã<br /> được ghi nhận trên thế giới [7].<br /> Nhiều phòng xét nghiệm không ý<br /> <br /> thức được vai trò của ESBLs và<br /> chưa có biện pháp để phát hiện. Sự<br /> thiếu hiểu biết hoặc thiếu nguồn lực<br /> để kiểm soát cơ chế đề kháng này<br /> lan truyền sẽ dẫn đến thất bại liên<br /> tiếp trong việc tìm phương cách<br /> thích hợp giúp ngăn chặn VK gây<br /> bệnh sinh β-lactamase lan rộng [9].<br /> Mục tiêu của nghiên cứu: Phát hiện<br /> 2 gen ESBL blaTEM và blaCTM-M ở các<br /> chủng E. coli và Klebsiella<br /> pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh<br /> phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật<br /> multiplex-PCR.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 43 chủng E. coli và 24 chủng<br /> Klebsiella pneumoniae được phân lập<br /> từ bệnh phẩm lâm sàng tại Bệnh viện<br /> Đa khoa TW Thái Nguyên và Bệnh<br /> viện Đại học Y Dược Thái Nguyên<br /> từ 4 - 2012 đến 4 - 2013.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Phân lập và định danh chủng VK<br /> trên hệ thống máy tự động Vitek 2<br /> compact 60. Sàng lọc khả năng sinh<br /> ESBLs ở các chủng VK bằng<br /> phương pháp khoanh giấy đôi. Ở<br /> những chủng VK được sàng lọc có<br /> kiểu hình ESBL dương tính, sử dụng<br /> cặp mồi tham khảo để lần lượt phát<br /> hiện các gen ESBL đặc hiệu tương<br /> 77<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> ứng là blaTEM [4] và blaCTX-M [8] bằng<br /> phản ứng PCR đơn mồi và phát hiện<br /> đồng thời gen này bằng phản ứng<br /> multiplex-PCR. ADN khuôn cho<br /> phản ứng PCR được tách chiết trực<br /> tiếp từ khuẩn lạc VK theo phương<br /> pháp của Cebula và CS [5]. Sử dụng<br /> mồi cho phản ứng PCR đơn mồi và<br /> multiplex-PCR bao gồm:<br /> blaTEM-F: 5’-TCGGGGAAATGTGCGCG3’,<br /> blaTEM-R: 5’-TGCTTAATCAGTGAGGCACC3’,<br /> blaCTX-M-F: 5’-ATGTGCAGYACCAGT<br /> AARGT-3’,<br /> blaCTX-M-R:<br /> 5’TGGGTRAARTARGTSA CCAGA-3’.<br /> <br /> Hỗn hợp (Hãng Thermo Scientific)<br /> cho một phản ứng multiplex-PCR<br /> gồm: 200 µM của mỗi loại dNTP; 2,5<br /> mM MgCI2; 0,2 pmol của mỗi loại<br /> ADN mồi; 1 U Taq ADN polymerase<br /> và 1x đệm PCR (20 mM Tris-HCI,<br /> pH 8,4, 50 mM KCI), bổ sung nước<br /> khử ion tới thể tích 25 µl. Phản ứng<br /> PCR thực hiện trên hệ thống luân<br /> nhiệt với chu trình nhiệt:<br /> 7 phút<br /> 0<br /> biến tính ở 94 C, 30 chu kỳ (940C/ 50<br /> giây - 500C/40 giây - 720C/1 phút), chu<br /> kỳ tổng hợp cuối cùng ở 720C/10<br /> phút. Kiểm tra hiệu quả quá trình<br /> khuếch đại và kích thước sản phẩm<br /> PCR trên gel agarose 1% và<br /> nhuộm bằng ethidium bromide.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả phát hiện VK E. coli<br /> và K. pneumoniae sinh ESBL<br /> bằng xét nghiệm sàng lọc.<br /> Sau khi có kết quả kháng sinh đồ<br /> với chủng E. coli và K. pneumoniae,<br /> những chủng nghi ngờ sinh ESBL<br /> (có đường kính vòng vô khuẩn xung<br /> quanh các khoanh giấy kháng sinh:<br /> cefotaxime ≤ 27 mm, ceftriaxone<br /> ≤ 25 mm và ceftazidime ≤ 22 mm)<br /> đều được kiểm tra khả năng sinh<br /> ESBL (kiểu hình ESBL (+)) bằng<br /> phương pháp khoanh giấy đôi. Kết<br /> quả cho thấy: 17/43 (39,53%) chủng<br /> E. coli và 8/24 (33,33%) chủng K.<br /> pneumoniae có kiểu hình ESBL (+).<br /> Thực tế từ một số kết quả nghiên<br /> cứu thực hiện tại Việt Nam cũng như<br /> trên thế giới gần đây cho thấy khả<br /> năng sinh ESBL ở hai loại VK này<br /> luôn khác nhau [3, 4, 7].<br /> * Kết quả khuếch đại gen blaTEM<br /> bằng phản ứng PCR đơn mồi: theo<br /> tính toán lý thuyết, với việc sử dụng<br /> cặp mồi blaTEM trong phản ứng PCR,<br /> một đoạn băng ADN có kích thước<br /> 970 bp sẽ được khuếch đại, những<br /> chủng không có gen trong genome<br /> sẽ cho kết quả âm tính.<br /> <br /> 78<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> mang một trong 2 gen còn lại là<br /> blaCTX-M và blaSHV? Kết quả phản ứng<br /> PCR với cặp mồi blaTEM cho thấy: có<br /> 9 chủng VK E.coli ESBL (+) và 2<br /> chủng K. pneumoniae ESBL (+)<br /> mang gen blaTEM.<br /> * Kết quả khuếch đại gen bla CTXM<br /> <br /> bằng phản ứng PCR đơn mồi: với<br /> <br /> các chủng VK có kiểu hình ESBL<br /> Hình 1: Kết quả khuếch đại gen<br /> blaTEM bằng PCR đơn mồi.<br /> <br /> (+), ngoài phát hiện gen blaTEM, phản<br /> ứng PCR đơn mồi được sử dụng để<br /> <br /> M. Marker GeneRulerTM 1kb; 1.<br /> A25; 2. C15; 3. B5; 4. C5;<br /> <br /> khuếch đại gen blaCTX-M. Sử dụng<br /> <br /> 5. C10; 6. C12; 7. C27; 8. Chứng<br /> âm.<br /> <br /> và tính toán lý thuyết, phản ứng<br /> <br /> Phân tích kết quả điện di hình 1<br /> cho thấy phân đoạn ADN được<br /> khuếch đại có kích thước khoảng<br /> <br /> cặp mồi tương ứng cho gen blaCTX-M<br /> PCR có thể tạo sản phẩm là một<br /> băng ADN đặc hiệu có kích thước<br /> khoảng 540 bp.<br /> <br /> 970 bp, hoàn toàn phù hợp với tính<br /> toán lý thuyết. Trên các đường chạy<br /> số 1, 3 - 7 tương ứng với chủng<br /> A25, B5, C5, C10, C12 và C27 đều<br /> thấy xuất hiện một băng ADN có<br /> kích thước khoảng 970 bp. Như vậy,<br /> những chủng này đều cho kết quả<br /> dương tính với gen blaTEM. Riêng<br /> chủng C15 không thấy xuất hiện<br /> băng ADN tương tự (âm tính với<br /> gene blaTEM). Có thể chủng VK này<br /> <br /> Hình 2: Kết quả khuếch đại gen<br /> blaCTX-M bằng PCR đơn mồi.<br /> 79<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> 1.A25; 2. B5; 3. C12; 4.C15; 5.<br /> C17; 6. C18; 7. C20; 8. Chứng âm;<br /> 9.C19; M. Marker GeneRulerTM 1kb<br /> Kết quả điện di hình 2 cho thấy<br /> phân đoạn ADN được khuếch đại<br /> với cặp mồi blaCTX-M có kích thước<br /> khoảng 540 bp, hoàn toàn phù hợp<br /> với lý thuyết tính toán. Trên đường<br /> chạy số 1, 3 - 6 và 9 tương ứng các<br /> chủng VK A25, C12, C15, C17, C18<br /> và C19 đều cho kết quả dương tính<br /> với gen blaCTX-M (xuất hiện 1 băng<br /> ADN có kích thước khoảng 540 bp).<br /> Riêng chủng B5 và C20 không xuất<br /> hiện băng ADN nào ở vị trí tương tự<br /> của các chủng cho kết quả dương<br /> tính với gen đích cần phát hiện. Có<br /> thể, ESBL ở các chủng VK này do<br /> gen còn lại là blaSHV mã hóa? Với<br /> việc sử dụng cặp mồi blaCTX-M, kết<br /> quả phản ứng PCR cho thấy: có 4<br /> chủng VK E. coli ESBL (+) và 5<br /> chủng K. pneumoniae ESBL (+)<br /> mang gen blaCTX-M.<br /> Kết quả từ phản ứng PCR với hai<br /> cặp mồi riêng rẽ blaTEM và blaCTX-M<br /> còn cho thấy có 2 chủng E. coli<br /> ESBL(+) mang đồng thời cả hai gen<br /> blaTEM và blaCTX-M.<br /> <br /> Kết quả khuếch đại 2 gen đích<br /> bằng phản ứng PCR với từng cặp<br /> mồi đơn trong nghiên cứu này cho<br /> thấy có 3 chủng VK là A22, A28 và<br /> C20 cho kết quả âm tính với cả 2<br /> gen, mặc dù chúng đều có kiểu hình<br /> ESBL (+). Có thể gen mã hóa cho<br /> ESBL ở 3 chủng VK này thuộc nhóm<br /> gen khác với 2 gen cần tìm. Trong<br /> khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi<br /> chưa có điều kiện tìm hiểu thêm<br /> những gen này. Trên thực tế, với số<br /> lượng kiểu gen ESBL phong phú (do<br /> đột biến của gen ESBL được tìm<br /> thấy đầu tiên), việc chỉ sử dụng một<br /> số cặp mồi để phát hiện gen đích<br /> ESBL có thể bỏ sót và không tìm thấy<br /> gen ở những chủng VK sinh ESBL.<br /> Hiện tượng không tìm thấy gen ESBL<br /> ở một chủng K. pneumoniae và 2<br /> chủng E. coli kháng cephalosporin<br /> phổ rộng cũng đã được đề cập tới<br /> trong nghiên cứu của Van Cao và<br /> CS thực hiện tại Việt Nam (2001) [4].<br /> Kết quả này cho thấy cần nghiên<br /> cứu bổ sung các ESBL mới ở<br /> những chủng VK này. Cũng từ kết<br /> quả phản ứng PCR đơn mồi trong<br /> nghiên cứu của chúng tôi, 2 chủng<br /> VK E.coli ESBL (+) mang đồng thời<br /> cả hai gen ESBL là blaTEM và blaCTXM. Hiện tượng một chủng VK Gram<br /> âm cùng một lúc mang hai hoặc<br /> nhiều loại gen ESBL khác nhau đã<br /> 80<br /> <br />