Phát triển phương pháp phát hiện Ricin trong mẫu nước sử dụng Aptamer kết hợp với Real-time PCR

Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN RICIN TRONG MẪU<br /> NƯỚC SỬ DỤNG APTAMER KẾT HỢP VỚI REAL-TIME PCR<br /> Ngô Ngọc Trung1*, Nguyễn Thị Thu Thủy2, Lã Thị Huyền2, Lê Quang Huấn2<br /> Tóm tắt: Ricin là một loại lecin thực vật, được tìm thấy nhiều trong hạt Thầu<br /> Dầu. Ricin gây độc cho tế bào động vật bằng cách thay thế một base adenine đơn<br /> trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL), từ đó làm thay đổi cấu trúc của tiểu đơn vị<br /> lớn rARN 28S, gây ức chế quá trình tổng hợp protein trong tế bào. Do vậy, ricin<br /> được xếp vào nhóm vũ khí sinh học nguy hiểm được sử dụng trong chiến tranh hoặc<br /> khủng bố. Phương pháp real time PCR là một trong những phương pháp phát hiện<br /> và định lượng ADN hiện đại nhất hiện nay. Các nghiên cứu sử dụng phương pháp<br /> real time PCR để phát hiện ricin trong mẫu lương thực, thực phẩm thông qua phát<br /> hiện ADN của đoạn gen mã hóa cho độc tố ricin. Tuy nhiên, chưa có nhiều công<br /> trình công bố về sử dụng phương pháp real time PCR để phát hiện trực tiếp ricin<br /> trong mẫu môi trường. Bài báo này trình bày các nghiên cứu phát triển phương<br /> pháp phát hiện ricin sử dụng kỹ thuật real-time PCR dựa trên aptamer Ar 5.9 đặc<br /> hiệu ricin. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp này có thể phát hiện ricin<br /> trong môi trường nước với ngưỡng phát hiện (LOD) là 0,36 ng, giới hạn định lượng<br /> (LOQ) là 1,32 ng/ml, độ nhạy với nước ngầm và nước mặt đạt 98%, nước sinh hoạt<br /> đạt 99%, độ đặc hiệu đạt 98%.<br /> Từ khóa: Ricin; Real-time PCR phát hiện Ricin; Aptamer đặc hiệu Ricin.<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Ricin từ hạt thầu dầu là một loại glycoprotein thuộc nhóm lectin, có khối lượng phân tử<br /> khoảng 65 kDa. Phân tử gồm 02 chuỗi polypetid (chuỗi A và B) nối với nhau qua cầu nối<br /> disunfua (-S-). Sau khi xâm nhập vào tế bào, ricin được vận chuyển đến bộ máy Golgi và<br /> tại đây, chuỗi A sẽ tách khỏi phân tử ricin, đi vào nhân và đến ribosom. Chuỗi A làm thay<br /> đổi cấu trúc của tiểu đơn vị lớn rARN 28S bằng cách thay thế một base adenine đơn<br /> (A4324) trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL) [10], từ đó gây bất hoạt tiểu đơn vị này và<br /> gây ra ức chế quá trình tổng hợp protein trong nhân tế bào dẫn đến gây chết tế bào. Bên<br /> cạnh đó, ricin tinh sạch có các tính chất như không mùi, không vị, dễ tan trong nước và có<br /> thể tồn tại trong môi trường trong một thời gian dài. Các nghiên cứu còn cho thấy giá trị<br /> LD50 của ricin đối với động vật như Thỏ, Chuột nhắt trắng trong khoảng từ 1-5µg/kg [6].<br /> Do vậy, ricin được liệt vào danh sách các chất cực độc dùng trong chiến tranh sử dụng vũ<br /> khí hủy diệt lớn hoặc khủng bố quy mô vừa và nhỏ [11]. Bởi vậy, phát triển các phương<br /> pháp phát hiện độc tố ricin là rất cần thiết, đảm bảo an toàn sinh học trong cộng đồng cũng<br /> như sử dụng trong huấn luyện sẵn sàng chiến đấu trong quân đội.<br /> Real-time PCR là một kỹ thuật được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó<br /> có ứng dụng phát hiện các vi sinh vật và độc tố gây bệnh cho người cũng như phát hiện<br /> các độc tố trong môi trường. Để phát hiện ricin, Xiahua He và cộng sự đã phát triển<br /> phương pháp ImmunoPCR (IPCR) sử dụng kháng thể đơn dòng kháng chuỗi A kết hợp<br /> với một đoạn ADN đã được biotin hóa. Sau khi gắn với ricin, đoạn ADN sẽ được tách ra<br /> và phát hiện bằng real-time PCR. Phương pháp này là sự kết hợp giữa ELISA và real-time<br /> PCR nên có độ nhạy cực cao với ngưỡng phát hiện là 10 pg ricin [6]. Tiếp theo, ông cũng<br /> phát triển phương pháp phát hiện ricin trong các mẫu thực phẩm như thịt bò, sữa, trứng với<br /> ngưỡng phát hiện đến 10 pg/ml [7]. Xiahua He cũng phát triển phương pháp real-time<br /> PCR để phát hiện trực tiếp genome của hạt thầu dầu trong thực phẩm với ngưỡng phát<br /> hiện là 0,5 µg ricin/1g mẫu [8]. Trong một nghiên cứu khác, Eva Felder và cộng sự đã phát<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 151<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> hiện ricin trực tiếp trong hỗn hợp bột của hạt cây Thầu Dầu bằng phương pháp real-time<br /> PCR với độ nhạy là 3 copy tương đương với 3 tế bào/phản ứng [9].<br /> Aptamer là các sợi đơn ADN hoặc ARN có cấu trúc đặc biệt và có khả năng gắn kết<br /> đặc hiệu với các phân tử đích khác nhau. Aptamer Ar5.9 là một đoạn ADN sợi đơn đặc<br /> hiệu ricin được sàng lọc dựa trên quy trình SELEX cải tiến sử dụng cột sàng lọc Nanosep<br /> 3K Omega [5]. Tính đặc hiệu cao của Ar5.9 với ricin là cơ sở để sử dụng phương pháp<br /> real-time PCR phát hiện ricin trong mẫu môi trường với sơ đồ sau:<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ phát hiện ricin dựa trên phương pháp Real-time PCR<br /> sử dụng aptamer Ar5.9.<br /> Các mẫu môi trường nước (nước mặt, nước ngầm, nước sinh hoạt) sau khi lấy về phòng<br /> thí nghiệm được xử lý mẫu và gắn kết protein trong mẫu lên đĩa 96 giếng. Ricin có bản<br /> chất là protein nên cũng được gắn lên đĩa một cách dễ dàng. Tiếp theo là quá trình rửa trôi<br /> các thành phần không gắn kết bằng đệm chuyên dụng, blocking đĩa để tránh các thành<br /> phần khác gắn lên. Aptamer Ar5.9 sau đó được thêm vào để gắn kết đặc hiệu với ricin<br /> trong giếng. Tiếp theo là quá trình rửa trôi các aptamer thừa, không gắn kết với các phân<br /> tử ricin. Hỗn hợp aptamer - ricin được biến tính nhiệt để loại bỏ gắn kết giữa ricin và<br /> aptamer Ar5.9, sau đó sử dụng phản ứng real-time PCR để phát hiện các aptamer Ar5.9 đã<br /> gắn kết với ricin. Từ đường chuẩn giữa aptamer Ar5.9 và ricin đã biết, có thể phát hiện<br /> ricin trong mẫu môi trường dựa vào phản ứng real-time PCR. Phương pháp này có thể<br /> phát hiện và định lượng ricin chính xác với thời gian thực hiện nhanh, thao tác dễ dàng với<br /> độ nhạy, độ đặc hiệu cao.<br /> 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất<br /> 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu<br /> Ricin tinh sạch, aptamer Ar5.9 được cung cấp bởi Viện Hóa học Môi trường quân sự.<br /> Trình tự của Aptamer Ar5.9: 5’ - ATCCGTCACACCTGCTCTCATATG -<br /> TCGCCATGGTAAGATGTCTCGCTCTCGTTCGTGTCTTTAG -<br /> AGCTTTGGTGTTGTTGGCTCCCGTT- 3’<br /> 2.1.2. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu<br /> Các loại hóa chất cơ bản dùng trong nghiên cứu: TBPS, PBS, agarose, SDS (Pro-lab),<br /> nước khử ion 2 lần, nước đã xử lý ARN và ADN, methanol, tween 20%, skim milk, MgCl2<br /> (Merk), Master Mix (Fisher scientific), dung dịch gốc của dNTPs ( Hybaid, Germany),<br /> Primer F, Primer R (Invitrogen) và một số hóa chất phân tích tinh khiết khác.<br /> Cặp mồi chạy phản ứng real-time PCR:<br /> ApF2: 5’ – ATCCGTCACACCTGCTCTCATA - 3’<br /> <br /> <br /> 152 N. N. Trung, …, L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện … với real-time PCR.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> ApR2: 5’- ATACGGGAGCCAACACCAAAGC - 3’<br /> 2.2. Thiết bị nghiên cứu<br /> Máy li tâm (Eppendorf, Đức), tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật), tủ hút, máy đo pH<br /> (Metter, Thuỵ Sĩ), máy vortex (Rotolab OSI), máy Real-time PCR (Aligent,Mỹ), máy đo<br /> nanodrop, tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật), cân phân tích 10-4 g (Mettler Toledo), pipetman các<br /> loại (Gilson) và một số thiết bị nghiên cứu khác.<br /> 2.3. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.3.1. Xây dựng đường chuẩn giữa ricin với aptamer Ar5.9 và thử nghiệm với các mẫu<br /> nước [4]<br /> Từ dung dịch ricin gốc ban đầu có nồng độ 0,45 mg/ml, tiến hành pha loãng xuống 0,1<br /> mg/ml bằng nước cất 2 lần rồi tiếp tục pha loãng mỗi bậc 10 lần (09 phần nước cất: 01<br /> phần ricin) để đạt các nồng độ 0,1; 1,0; 10; 100; 1.000; 10.000 và 100.000 ng/ml. 100 μl<br /> ricin với các nồng độ 0,1; 1,0; 10; 100; 1.000; 10.000 và 100.000 ng/ml được hòa trong<br /> đệm gắn bản (coating buffer, 50 mM bicarbonate buffer, pH 9,6), ủ trong các giếng của<br /> khay polystiren 16 giờ. Để loại bỏ ricin dư thừa, các giếng được rửa 03 lần với 300 μl đệm<br /> rửa TPBS (PBS + 0,05% tween-20). Đĩa sau đó được phủ với skim milk 5% pha trong<br /> PBS và ủ 60 phút ở nhiệt độ phòng, rửa bằng đệm PBS 1X 03 lần. 50µl aptamer Ar5.9<br /> được thêm vào các giếng và ủ lắc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó các giếng được rửa<br /> với TPBS 1X ba lần, sau đó rửa tiếp với PBS ba lần. 100 μl PBS được thêm vào sau khi<br /> rửa. Sốc nhiệt ở 95oC trong 5 phút để phá vỡ liên kết Ar5.9 - ricin. Dịch thu được được<br /> đưa vào phản ứng real-time PCR để xác định mối tương quan giữa ricin và aptamer Ar5.9.<br /> Để xác định ricin trong các mẫu nước, sau khi được pha vào đệm gắn bản với tỷ lệ 1:9<br /> sẽ được thực hiện tương tự như các bước trong xây dựng đường chuẩn. Kết quả thu được<br /> từ phản ứng real-time PCR sẽ được so sánh với đường chuẩn thu được giữa aptamer Ar5.9<br /> và ricin để xác định ngưỡng phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng.<br /> 2.3.2. Phương pháp real-time PCR để phát hiện aptamer Ar5.9 [7]<br /> Các thành phần của phản ứng real-time PCR được trình bày trong bảng dưới đây:<br /> Bảng 1. Thành phần các chất trong phản ứng real-time PCR.<br /> Thành phần Thể tích (µl)<br /> Master Mix 2x 10<br /> Primer AptF 10 µM 0,8<br /> Primer AptR 10 µM 0,8<br /> ADN khuôn 3,0<br /> H2O 5,4<br /> Tổng 20<br /> Chu kỳ nhiệt của phản ứng real-time PCR: bước 1: biến tính 95oC trong 3 phút; bước 2:<br /> chu trình lặp lại 40 chu kỳ (95oC trong 05 giây, 40oC trong 10 giây; bước 3: Phân tích<br /> điểm nóng chảy (Melting Curves): 95oC trong 30 giây, 65 oC trong 30 giây và 95oC trong<br /> 30 giây.<br /> 2.3.3. Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu [1]<br /> Tiến hành thử nghiệm trên các loại mẫu nước khác nhau tại nồng độ nhỏ nhất mà<br /> phương pháp có thể phát hiện được (dựa vào kết quả xác định giới hạn định lượng của<br /> phương pháp). Mỗi loại nước (nước mặt, nước ngầm, nước sinh hoạt và đối chứng)<br /> được thử nghiệm với 100 mẫu. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phép thử được xác định<br /> theo công thức:<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 153<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 2.3.4 Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện (LOD) giới hạn định lượng (LOQ)<br /> Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không<br /> đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có<br /> thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. Có nhiều cách xác định LOD khác<br /> nhau tùy thuộc vào phương pháp áp dụng là phương pháp công cụ hay không công cụ.<br /> Một trong các cách tiếp cận có thể chấp nhận được là cách tính dựa trên độ lệch chuẩn<br /> thực hiện trên mẫu trắng.<br /> Phân tích mẫu trắng 10 lần song song, tính độ lệch chuẩn (độ lệch chuẩn của các phép<br /> thử phải khác 0), LOD được tính theo công thức [4]:<br /> <br /> Công thức tính LOD: LOD = x 0  3SD 0<br /> 2<br /> <br /> Với SD0 =<br />  (x 0i  x0 )<br /> n 1<br /> <br /> Trong đó: x0 = trung bình của mẫu trắng<br /> SD0 = độ lệch chuẩn của mẫu trắng<br /> Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta<br /> có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn. Có<br /> nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể mà lựa<br /> chọn cho phù hợp. Một trong các cách thường được sử dụng để tính LOQ là dựa trên độ<br /> lệch chuẩn, tính trên mẫu trắng với công thức:<br /> <br /> LOQ = x 0  10SD 0 [4].<br /> 2.3.5 Phương pháp lấy mẫu nước<br /> Các mẫu nước mặt, nước ngầm, nước sinh hoạt được lấy theo các tiêu chuẩn Việt Nam<br /> hiện hành [2].<br /> 2.3.6. Phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện ricin<br /> Sử dụng test phát hiện nhanh độc tố ricin theo nguyên lý sắc ký miễn dịch, để so sánh<br /> định tính với quá trình phân tích, phát hiện ricin theo phương pháp real-time PCR. Test<br /> phát hiện nhanh ricin bằng nguyên lý sắc ký miễn dịch được cung cấp bởi Viện Hóa học<br /> Môi trường Quân sự và hãng Osborn (Mỹ) [1].<br /> 2.3.7. Phương pháp thống kê sinh học trong xử lý kết quả thí nghiệm<br /> Tất cả các kết quả nghiên cứu được thực hiện lặp lại 03 lần, lấy giá trị trung bình và xử<br /> lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học sử dụng hàm chuẩn với độ tin cậy 95%, sai<br /> số cho phép  = 5% [3].<br /> 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 3.1. Kết quả phản ứng real-time PCR với aptamer Ar5.9<br /> Aptamer Ar5.9 được pha loãng với các nồng độ từ 90 nM giảm dần 10 lần đến 0,009<br /> nM và thực hiện phản ứng real - time PCR với cặp mồi AptF/R. Đây là bước thử nghiệm<br /> <br /> <br /> 154 N. N. Trung, …, L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện … với real-time PCR.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> khả năng liên kết giữa aptamer Ar5.9 với cặp mồi đặc hiệu nhằm thu nhận tín hiệu khuếch<br /> đại aptamer Ar5.9 trong phản ứng real-time PCR. Kết quả thu được như sau:<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả chạy Real-time PCR với Aptamer Ar5.9 (hình 2A) và xác định điểm nóng<br /> chảy (Tm) trong phản ứng Real-time sử dụng SYBR-Green I (Hình 2B).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm sau khi chạy real-time PCR Ar5.9.<br /> Đường chạy M: Marker<br /> Đường chạy: 1, 2, 3, 4, 5: các sản phẩm của Ar5.9 sau khi chạy real-time PCR với các<br /> nồng độ từ 0,009; 0,09; 0,9; 9,0 và 90 nM<br /> Kết quả cho thấy giá trị Ct thu được giảm dần theo từng nồng độ aptamer Ar5.9 tăng<br /> dần. Kết quả tính hệ số tương quan cho thấy giá trị R2 = 0,991 kết hợp với phân tích nhiệt<br /> độ nóng chảy (Tm) cho thấy sản phẩm real-time PCR của 05 nồng độ aptamer Ar5.9 có<br /> đỉnh Tm khoảng 810C. Bên cạnh đó, mẫu trắng có giá trị Ct đạt 35,5. Điều này là do các<br /> cặp mồi đã bắt cặp với nhau trong phản ứng real-time PCR với đỉnh Tm khoảng 770C (thể<br /> hiện trong hình 2B). Kết quả điện di các sản phẩm sau khi chạy real-time PCR cho thấy<br /> chỉ có 01 băng duy nhất với kích thước khoảng 80 bp, chứng tỏ không có sản phẩm phụ là<br /> các cặp mồi tự bắt cặp với nhau trong phản ứng real-time PCR có aptamer Ar5.9. Điều này<br /> chứng tỏ aptamer Ar5.9 đủ điều kiện sử dụng trong phản ứng Real-time PCR để thực hiện<br /> các thí nghiệm tiếp theo.<br /> 3.2. Kết quả phát hiện ricin trong môi trường đệm gắn bản (coating buffer)<br /> Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ ricin khác nhau pha trong đệm coating<br /> buffer. Khảo sát mối tương quan giữa 07 nồng độ ricin với aptamer Ar5.9 có nồng độ 90<br /> nM, kết quả thu được như sau:<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 155<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả phát hiện ricin trong đệm gắn bản sử dụng aptamer Ar5.9.<br /> <br /> Tt Nồng độ ricin (ng) Giá trị Ct (Trung bình)<br /> 1 0 35,5 ± 0,05<br /> 2 0,1 35,2 ± 0,07<br /> 3 1,0 32,5 ± 0,08<br /> 4 10 27,6 ± 0,05<br /> 5 100 24,5 ± 0,09<br /> 6 1.000 21,7 ± 0,09<br /> 7 10.000 20,6 ± 0,12<br /> 8 100.000 18,4 ± 0,07<br /> 1 2 3 4 5<br /> <br /> <br /> <br /> V¹ch kiÓm tra<br /> V¹ch ®äc kÕt qu¶ Âm tính<br /> Dương tính<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Kết quả kiểm tra bằng sắc ký miễn dịch với các nồngđộ ricin<br /> 1: 10.000 ng; 2: 1.000 ng; 3: 500 ng; 4: 50 ng; 5: 10 ng.<br /> Kết quả cho thấy không có sự tuyến tính về giá trị Ct tại các nồng độ ricin 10.000;<br /> 100.000 ng/ml. Khoảng tuyến tính bắt đầu từ nồng độ ricin 0,1 ng đến 1000 ng, giá trị Ct<br /> giảm khoảng 3-4 đơn vị sau mỗi độ pha loãng 10 lần. Từ các kết quả thu được, xây dựng<br /> đường chuẩn xác định mối tương quan giữa aptamer Ar5.9 và ricin trong đệm gắn bản,<br /> trong khoảng tuyến tính 0,1 - 1000 ng như sau:<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa ricin và aptamer Ar5.9 qua phản<br /> ứng real-time PCR trong đệm gắn bản 50 mM.<br /> <br /> <br /> 156 N. N. Trung, …, L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện … với real-time PCR.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> Từ các kết quả thu được, có thể khảng định đã xây dựng thành công đường chuẩn xác<br /> định định lượng ricin trong nước bằng kỹ thuật real-time PCR kết hợp aptamer Ar5.9 với<br /> phương trình đường chuẩn: y = 31,79-3,53*log(x), với R2 = 0,992 trong khoảng xác định<br /> từ 0,1 đến 1000 ng/ml.<br /> 3.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương<br /> pháp phát hiện ricin sử dụng real-time PCR kết hợp aptamer Ar5.9<br /> Để xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp<br /> real-time PCR kết hợp aptamer Ar5.9 phát hiện ricin, chúng tôi lựa chọn phương pháp<br /> đánh giá trên 10 mẫu âm tính (mẫu nước cất 2 lần, chạy phản ứng real-time PCR sử dụng<br /> aptamer Ar5.9) với phương trình y = 31,79-3,53*log(x), với công thức tính LOD = xtb+<br /> 3SD, LOQ = xtb+ 10SD, kết quả thể hiện trên bảng sau:<br /> Bảng 3. Kết quả real-time PCR trên 10 mẫu trắng.<br /> Log(x) = (Ct-31,79)/ Ricin<br /> (X0i-Xtb)2<br /> Stt Ct (-3,53) (nanogam)<br /> 1 35,55 -1,065155807 0,086068 0,000122739<br /> 2 35,53 -1,059490085 0,087199 0,007603612<br /> 3 35,50 -1,050991501 0,088922 0,007907096<br /> 4 35,52 -1,056657224 0,087769 0,007703455<br /> 5 35,54 -1,062322946 0,086632 0,007505059<br /> 6 35,55 -1,065155807 0,086068 0,007407785<br /> 7 35,51 -1,053824363 0,088344 0,007804611<br /> 8 35,5 -1,050991501 0,088922 0,007907096<br /> 9 35,54 -1,062322946 0,086632 0,007505059<br /> 10 35,52 -1,056657224 0,087769 0,007703455<br /> TB Xtb 0.09714<br /> LOQ = 1,32 LOD = 0,36 SD = 0,0876<br /> Từ kết quả thu được trên bảng 3.29, tiến hành tính toán giá trị SD và xtb bằng phương<br /> pháp bình phương tối thiểu, thu được giá trị Xtb = 0,086; SD = 0,0198, từ đó tính được<br /> LOD = xtb+ 3SD = 0,36 ng/ml; LOQ = xtb+ 10SD = 1,32 ng/ml.<br /> 3.4. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp phát hiện ricin sử dụng aptamer<br /> Ar5.9 và real-time PCR<br /> Ricin được pha loãng từ nồng độ ban đầu là 0,45 mg/ml về nồng độ 1,32 ng/ml và<br /> thử nghiệm với kỹ thuật real-time PCR sử dụng aptamer Ar5.9. Mẫu âm tính cũng được<br /> thử nghiệm lặp lại nhiều lần và ghi nhận kết quả. Kết quả thí nghiệm được trình bày<br /> dưới bảng sau:<br /> Bảng 4. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp real-time PCR<br /> sử dụng aptamer Ar5.9 phát hiện ricin.<br /> Kết quả<br /> Số<br /> Loại mẫu lượng Real-time Dương Dương tính Âm tính Âm tính<br /> mẫu PCR (Ct) tính thật giả thật giả<br /> Nước sinh hoạt 100 31,36±0,07 99 0 0 1<br /> Nước mặt 100 31,36 ± 0,05 98 0 0 2<br /> Nước ngầm 100 31,36± 0,04 98 0 0 2<br /> Mẫu đối chứng 100 35,5± 0,05 0 2 98 0<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 157<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> Kết quả phân tích cho thấy giá trị Ct thu được với các mẫu có độ ổn định cao. Tuy<br /> nhiên, vẫn có các giá trị dương tính giả và âm tính giả trong các mẫu phân tích. Các số liệu<br /> thu được cũng không chênh lệch nhiều so với giá trị theo đường chuẩn lý thuyết. Áp dụng<br /> công thức tính độ nhạy và độ đặc hiệu, ta tính được:<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Kết quả thí nghiệm cho thấy độ nhạy với nước mặt và nước ngầm đạt 98%, nước sinh<br /> hoạt đạt 99% và độ đặc hiệu đạt 98%, điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu<br /> trước đây về real-time PCR vì phương pháp này có độ nhạy và đặc hiệu rất cao. Kết quả<br /> này tương đương với phương pháp sắc ký miễn dịch khi xác định ricin trong nước [1]. Tuy<br /> nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp vẫn thấp hơn so với một số nghiên cứu về<br /> real-time PCR phát hiện ricin. Điển hình là nghiên cứu của Xiaohua He và cộng sự đã phát<br /> hiện gen mã hóa cho ricin từ cây Thầu Dầu bằng phương pháp real-time PCR với ngưỡng<br /> phát hiện 1 bản ADN và độ nhạy đạt 100% [8].<br /> Khả năng phản ứng chéo được xác định bằng cách thử nghiệm với một số mẫu protein<br /> tương tự ricin gồm lectin tinh sạch từ đậu tương (LĐT), nấm hương (LNH), nấm mỡ (LNM)<br /> và mẫu đối chứng. Kết quả được trình bày trong bảng sau:<br /> Bảng 5. Kết quả Ct (trung bình) xác định khả năng phản ứng chéo<br /> với một số loại lectin tương tự.<br /> Ricin LĐT LNH LNM Đối chứng<br /> Mẫu<br /> (1,32 ng) (10 ng) (10 ng) (10 ng)<br /> Kết quả 31,36± 0,05 35,7± 0,08 35,6 ± 0,07 35,2 ± 0,06 35,5 ± 0,03<br /> Kết quả phân tích cho thấy giá trị Ct của các loại lectin tương tự ricin tương đương với<br /> mẫu trắng. Điều này chứng tỏ aptamer Ar5.9 không liên kết chéo với một số loại mẫu<br /> protein có cấu trúc gần giống ricin. Điều này được giải thích do aptamer Ar5.9 chỉ liên kết<br /> đặc hiệu với ricin chứ không liên kết với bất kỳ loại protein nào khác. Do đó, mặc dù có<br /> rất nhiều loại protein khác nhau nhưng cũng không xảy ra phản ứng chéo nào.<br /> 3.5. Phát hiện ricin bằng phương pháp real - time PCR kết hợp Ar5.9 trong các<br /> mẫu nước<br /> Thí nghiệm được tiến hành với các mẫu nước sinh hoạt, nước ngầm qua xử lý<br /> được lấy tại Viện Hóa học Môi trường quân sự, nước mặt được lấy tại hạ lưu sông Đà (hạ<br /> lưu khu vực thủy điện Hòa Bình, là nguồn nước trước khi xử lý để trở thành nước sinh<br /> hoạt). Các mẫu nước được lấy mẫu, phân tích xác định các chỉ số hóa sinh theo các tiêu<br /> chuẩn Việt Nam (các kim loại nặng, chất tẩy rửa, E.coli, Coliform, các mẫu đạt tiêu chuẩn<br /> về nước sinh hoạt, nước mặt, nước ngầm theo các quy chuẩn Việt Nam, đảm bảo không có<br /> các yếu tố tác động đến cấu trúc không gian của ricin (số liệu không hiển thị trong bài<br /> báo). Để đảm bảo độ ổn định, các mẫu nước được đưa vào môi trường đệm gắn bản với tỷ<br /> lệ 1:9. Các mẫu nước sau quá trình xử lý mẫu được bổ xung ricin sao cho đạt nồng độ<br /> cuối cùng trong khoảng từ 1,32 ng đến 1.000 ng. Thực hiện quá trình gắn kết ricin vào<br /> khay polystyren, ủ với aptamer Ar5.9 và thực hiện phản ứng real-time PCR để phát hiện<br /> aptamer gắn kết với ricin. So sánh giá trị Ct theo đường chuẩn (Ct LT) và giá trị Ct thực tế<br /> thu được (Ct TĐ), kết quả được trình bày trong bảng 6:<br /> <br /> <br /> 158 N. N. Trung, …, L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện … với real-time PCR.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> Bảng 6. Kết quả chạy real-time PCR với các mẫu nghiên cứu.<br /> Giá trị Ct (Trung bình, SD)<br /> Ricin<br /> Tt (Ct TĐ)<br /> (ng) Ct LT<br /> Nước sinh hoạt Nước mặt Nước ngầm<br /> 1 1,28 31,36 31,35± 0,05 31,29± 0,03 31,32± 0,05<br /> 2 10 28,26 28,25 ± 0,06 28,23 ± 0,04 28,24 ± 0,07<br /> 3 60 25,51 25,5 ± 0,05 25,51 ± 0,05 25,45 ± 0,04<br /> 4 100 24,73 24,72 ± 0,06 24,7 ± 0,05 24,6 ± 0,06<br /> 5 500 22,26 22,3 ±0,05 22,3 ± 0,06 22,3 ± 0,04<br /> 6 1000 21,2 21,3 ± 0,05 21,3 ± 0,06 21,3 ± 0,05<br /> <br /> Kết quả thử nghiệm cho thấy giá trị Ct thu được qua phản ứng real-time PCR với 03<br /> loại mẫu nước đều tuyến tính với nồng độ ricin trong khoảng từ 1,32 - 1000 ng, không có<br /> sai khác nhiều và đều nằm trong khoảng tuyến tính đã thiết lập. Điều này chứng minh khả<br /> năng liên kết tốt với aptamer Ar5.9 và ricin trong khoảng giá trị trên. Kết quả nghiên cứu<br /> của chúng tôi có sai khác với các nghiên cứu của Xiaohua He và cộng sự. Trong nghiên<br /> cứu này, Xiaohua He sử dụng kháng thể đơn dòng gắn lên khay và bắt cặp đặc hiệu với<br /> ricin theo kiểu sandwich và sử dụng kháng thể đơn dòng thứ cấp gắn chuỗi ADN sau đó<br /> tiến hành real-time PCR chuỗi ADN để phát hiện ricin thì ngưỡng phát hiện đạt tới 10<br /> pg/ml [7]. Trong một nghiên cứu khác, Lubelli và cộng sự cũng đã phát hiện ricin trong<br /> huyết thanh người qua 02 loại kháng thể đơn dòng có gắn chuỗi ADN có ngưỡng phát hiện<br /> đến 10 fg/ml [6]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi gắn trực tiếp ricin lên khay<br /> polystyren và sử dụng aptamer Ar5.9 để gắn kết đặc hiệu ricin nên giới hạn phát hiện<br /> không tiếp cận được như các nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng gắn kết ricin trước<br /> khi đưa vào phản ứng real-time PCR.<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Nghiên cứu đã ứng dụng aptamer đặc hiệu ricin Ar5.9 và kỹ thuật real-time PCR để<br /> phát triển thành công phương pháp phát hiện ricin trong các loại mẫu nước (nước mặt,<br /> nước ngầm và nước sinh hoạt). Phương pháp có ngưỡng phát hiện và giới hạn định lượng<br /> với ricin lần lượt là 0,36 ng/ml và 1,32 ng/ml, độ nhạy với nước ngầm và nước mặt đạt<br /> 98%, với nước sinh hoạt đạt 99% và độ đặc hiệu đạt 98%. Kết quả nghiên cứu cũng cho<br /> thấy aptamer Ar5.9 không phản ứng chéo với các mẫu protein có cấu trúc lectin gần giống<br /> với ricin.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Nguyễn Quốc Hùng, “Hoàn thiện công nghệ sản xuất và áp dụng thử Test phát hiện<br /> nhanh độc tố ricin”, Đề tài AT cấp Bộ Quốc Phòng, 2015.<br /> [2]. TCVN 6663-1:2011, “Chất lượng nước – lấy mẫu – Phần 1: Hướng dẫn lập chương<br /> trình lấy mẫu và kỹ thuật lấy mẫu”, Trung tâm tiêu chuẩn đo lường chất lượng, Số 8,<br /> Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, 2011.<br /> [3]. Nguyễn Văn Đức, Lê Thanh Hải, “Phương pháp kiểm tra thống kê sinh học”, Nhà<br /> xuất bản Khoa học kỹ thuật, (2012), tr 34-50.<br /> [4]. Trần Cao Sơn, “Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật học”,<br /> NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2015.<br /> [5]. Ngô Ngọc Trung, Lã Thị Huyền, Trần Thị Bích Đào, Lê Quang Huấn, “Nghiên cứu<br /> sàng lọc aptamer đặc hiệu độc tố ricin”, Tạp chí Nghiên cứu khoa học và công nghệ<br /> quân sự, số 55, tháng 6/2018, Tr. 160-168.<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 159<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> [6]. Lubelli, C,. Chatgilialoglu, A. Bolognesi, P. Strocchi, M. Colombatti, and F. Stirpe,<br /> “Detection of ricin and other ribosome –inactivating proteins by an immune-<br /> polymerase chain reaction assay”, Analytical Biochemistry, Vol 355, issue 1,<br /> (2006), pp. 102-109.<br /> [7]. Xiaohua He et al, “Development of a Novel Immuno-PCR Assay for Detection of<br /> Ricin in Ground Beef, Liquid Chicken Egg, and Milk”, Journal of Food Protection,<br /> Vol 73, No 4 (2010), pp. 695-700.<br /> [8]. Xiaohua He et al, “Detection of Castor Contamination by Real-Time Polymerase<br /> Chain Reaction”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 55, (2007), pp.<br /> 545-550.<br /> [9]. Eva Felder, “Simultaneous Detection of Ricin and Abrin DNA by Real-Time PCR<br /> (qPCR)”, Toxins, Vol 4, (2012), 633-642.<br /> [10]. Kortepeter MG, Parker GW, “Potential biological weapons threats”, Emerging<br /> Infection Disease, (1999), pp. 523–527.<br /> [11]. Manashi Bagchi, Shirley Zafra-Stone, Francis C.Lau, and Bebasis Bagchi, “Ricin<br /> and Abrin, Handbook of Toxicology of Chemical Warfare Agents”, Publish by<br /> Elsevier, (2009), pp 681-720.<br /> ABSTRACT<br /> DEVELOPMENT OF RICIN DETECTION METHOD IN WATER SAMPLES<br /> USING THE APTAMER AND REAL-TIME PCR<br /> Ricin is a kind of plan lectin which is found in Castor bean. Ricin is toxic to<br /> animal cells by replacing a single adenine base on the sarcin-ricin ring structure<br /> (SRL), thereby altering the structure of the large rRNA 28S subunit and inhibiting<br /> protein synthesis in the cell. As such, ricin is classified as a dangerous biological<br /> weapon used in warfare or terrorism. In this study, we developed an analytical<br /> method for ricin detection using the real-time PCR based on ricin-specific aptamer<br /> Ar5.9. The result showed that ricin in water could be detected at the limit of<br /> quantitative 1,32 ng, the sensitivity for underground and surface water is 98%, for<br /> domestic water is 99% and the specificity is 98%.<br /> Keywords: Ricin; Real-time PCR detection of ricin; Ricin-specific aptamer.<br /> <br /> Nhận bài ngày 21 tháng 12 năm 2018<br /> Hoàn thiện ngày 12 tháng 02 năm 2019<br /> Chấp nhận đăng ngày 19 tháng 02 năm 2019<br /> <br /> Địa chỉ: 1Viện Hóa học Môi trường quân Sự/Bộ tư lệnh Hóa học;<br /> 2<br /> Viện Công nghệ sinh học/ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.<br /> *<br /> Email: trungbio@gmail.com.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 160 N. N. Trung, …, L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện … với real-time PCR.”<br />