Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus

Chia sẻ: Lynh Kalynn | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:2

Thêm vào BST

Báo xấu

209
lượt xem 45
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus: Phương pháp trực tiếp Elisa đã được chứng minh là rất phổ biến để chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm nhất như...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus

. Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus: Phương pháp trực tiếp Elisa đã được chứng minh là rất phổ biến để chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm nhất như: ở người viêm gan siêu vi, HIV … và ở động vật như: viêm vú, nhiễm khuẩn xuất huyết…(Nickerson và các cộng sự, 1989. Rehmant et al, 2002).  Vật liệu và phương pháp: + Chuẩn bị các KN: S. aureus được nuôi cấy trên môi trường Staph.110 ủ ở 37 0C trong 24h. Thu chủng vi khuẩn với nước muối đệm phosphate (pH 6.8) có chứa formalin 0.3% và đun nóng ở 100 0C trong 1h (Heddleston et al, 1972; Zia và cộng sự, 2000). + Sản xuất KT: ba con thỏ được tiêm dịch huyền phù nói trên ở dưới da với l ượng 0.5;1;1.5 và 2ml khoảng 4 ngày. Sau 7 ngày tiếp tục tiêm 1ml S.aureus được nuôi cấy trong môi trường canh thịt vào thỏ. Sau đó 14 ngày tiêm môi trường giống như trên, thu nhận máu và huy ết thanh khi gi ết th ỏ (Relman và cộng sự, 2002). + Tinh chế và ước lượng Protein: KT thỏ được phân lập và tinh khiết một phần thông qua phương pháp kết tủa ammonium sulfate (Hudson và Hay, 1980) và hàm lượng protein đã đ ược ước tinh bằng phương pháp Biuret sau khi tiêu bản theo đường chuẩn của huyết thanh bò albumin (Zia và cộng sự, 2001). + Sự tiếp hợp: Enzyme peroxidase từ đậu tương (10mg) đã được tiếp hợp với một phần KT tinh khiết của thỏ, sử dụng bước hai trong phương pháp glutaradehyde (Zia và cộng sự, 2000). + Lớp vỏ KT: 100µl KT thỏ (pha loãng 1/10 trong dung dịch đệm phủ) đ ược đổ vào từng gi ếng, polystyrene, tấm microtitration gồm 96 giếng ủ ở 40C trong 24h. Sau đó, tấm được rửa năm lần với đệm rửa. Các tấm được giữ cố định bởi 100µl PSB đổ vào từng giếng và ủ ở 37 0C trong 24h. Sau khi ủ, tấm đã được rửa sạch bằng đệm rửa (Horadagoda et al, 1993)  Elisa trực tiếp: + Elisa trực tiếp được thực hiện để phát hiện KT tiếp hợp enzyme. Các tiếp hợp enzyme này pha loãng trong PBS là 1:100; 1:200; 1:400 và 1: 800. 100µl PBS được thêm vào mỗi giếng. Huyết thanh thỏ được pha loãng trong PBS ở tỷ lệ 1:10. + Đó là 2 lần tuần tự pha loãng từ 2 lên đến 11 giếng, như 100µl được thêm vào. Giếng 12 được sử dụng để kiểm soát. Các đĩa được ủ ở 37 0C trong 2h. Sau đó rửa lại 5 lần bằng dung dịch rửa. Tiếp tục pha loãng 100µl ở mỗi hàng, đầu tiên pha loãng A+B, thứ 2 là pha loãng C+D, thứ 3 là pha loãng E+F, thứ 4 là Pha loãng G+H trên tấm microtitration. Ủ ở 37 0 C trong 2h. Sau khi ủ rửa lại 5 lần bằng dung dịch rữa. Sau đó thêm 100µl guaiaclo (guaicol + H2O2) và ủ ở 370C trong 20 phút. Tiếp tục thêm 50µl H2SO4 1M (thuốc dừng) vào mỗi giếng. O.D đã được ghi lại ngay lập tức trong cùng vi đĩa đọc Elisa, đọc ở bước sóng 450nm (Kemney và Challacombe, 1989). + Phân tích thống kê: các dữ liệu được phân tích qua Duncan’s Multiple Range (DMR) ki ểm tra hoàn toàn theo thiết kế ngẫu nhiên (CRD) (Steel và Torrie,1984).  Kết quả và thảo luận: + Các xét nghiệm huyết thanh khác nhau đã được sử dụng cho các KN phát hi ện nh ư là th ử nghiệm nhanh chóng làm ngưng kết, thử nghiệm agar gel phát hiện, nhưng tốt nhất là phương pháp ELISA để phát hiện KN. Nề tảng của phương pháp ELISA là dựa trên sự thay đổi màu sắc, có l ợi th ế hơn các xét nghiệm khác như ngưng kết, huỳnh quang hoặc phóng xạ trong phản ứng KN-KT có th ể được đo đều đặn khách quan trong sắc độ kế đơn giản. Ngoài ra, sử dụng các tấm microtitre ELISA cho phép một số lượng lớn phản ứng để được đọc trong thời gian ngắn (Dawkins et al,1990). + Có nhiều enzyme khác nhau được sử dụng trong phương pháp ELISA nhưng peroxidase được ưu tiên hơn những loại khác bởi sự tinh khiết, hoạt tính đặc hiệu, nhạy cảm của chất nền thăm dò, dễ tiếp hợp, tính hiệu quả khi tiếp hợp và sự ổn định về sự tiếp hợp (Kemeny và Challacombe, 1989). Peroxidase là một chất oxy hóa sinh học quan trọng và phổ biến trong các vật liệu từ thực v ật. Trong 1
thực vật thì nó có mặt trong cà chua (Zia et al,2001), cải ngựa, đậu tương (Ambreen et al, 2001), khoai tây, củ cải, cà rốt, lúa mì, lê, chuối (Reed và cộng sự, 1975). + Peroxidase được chiết xuất từ đậu tương do tính hoạt động cao và dễ dàng tìm, ki ếm. Hoạt động của peroxidase thô đã được chứng tỏ 146.12U/ml. Đậu tương là một nguồn phong phú của peroxidase được báo cáo bởi Ambreen et al, 2000. Sau đó peroxidase một phần được tinh khiết bằng cách sử dụng phương pháp làm kết tủa ammonium sulfate. Kỹ thuật này sử dụng vì nó phổ biến nhất, s ử dụng thuốc thử có muối trong các protein, độ hòa tan cao và độ phân giải ion cao (Voet et al, 1999). KT được sản xuất bằng cách tiêm các KN S. aureus vào thỏ và sử dụng phương pháp kết t ủa ammonium (Hudson và Hay, 1980). Lượng protein đã được ước tính bằng cách sử dụng phương pháp biuret cũng như phương pháp U.V. và kết quả của hai phương pháp đã được ghi trong bảng . Bảng : Dự đoán protein của mẫu thỏ: Sample Biuret Method (mg/ml) UV Method (mg/ml) A 1.6 1.544 B 1.024 0.917 C 1.0791 0.932 + Có nhiều phương pháp khác nhau để tiếp hợp giống như phương pháp meleimide, phương pháp oxy hóa preiodate, bước một của phương pháp glutaraldehyde và bước hai của phương pháp glutaraldehyde nhưng bước hai được ưa chuộng hơn các phương pháp khác vì kết quả của việc tiếp hợp áp dụng hai phương pháp glutaraldehyde, cho kết quả đáng tin cậy và hiệu quả hơn (Baker, 1989). Kháng thể được kết hợp với 10mg của peroxidase và sự kết hợp đã được thử nghiệm thông qua ELISA trực tiếp. Các kết quả chỉ ra rằng trong pha loãng 1:100 của OD mẫu A dao động từ 1,18-0,972. Trong 1:200 OD pha loãng trong khoảng 0,97-0,93. Trong 1:400 giá trị OD dao động 0,714-0,72. Trong 1:800 giá trị pha loãng được hấp thụ là 0,5-0,6. + Trong trường hợp mẫu B, pha loãng ở 1:100 OD từ 1,406-1,205 trong khi pha loãng ở 1:200 OD dao động từ 1,185-1,103. Trong 1:400 OD dao động từ 0,714-0,72. Trong 1:800 giá tr ị pha loãng đ ược hấp thụ từ 0,99-0,93. Mẫu C, tỷ lệ 1:100 OD pha loãng từ 1,74-1,61. Trong pha lõang 1:200 OD từ 1,36-1,23. + Trong 1:400 OD từ 1,21-1,40. Trong 1:800 giá trị pha loãng hấp thụ là 1,26-1,39. Có một sự giảm đáng kể của mẫu về giá trị OD ở độ pha loãng 1:100 so với dung dịch pha loãng 1:200, 1:400 và 1:800 là pha loãng 1:100 cho kết quả tốt nhất. + Kết luận và kiến nghị: 1:100 là tôt nhất cho ELISA trực tiếp chống lại S.aureus. Kết luận tương tự đã được rút ra khi thống kê phân tích thông qua thử nghiệm DRM theo thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên 2