Sản xuất chế phẩm bào tử Bacillus albus NNK24 hỗ trợ tăng trưởng cây đậu phộng

Chia sẻ: Mộ Dung Vân Thư | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu "Sản xuất chế phẩm bào tử Bacillus albus NNK24 hỗ trợ tăng trưởng cây đậu phộng" hướng đến việc khảo khả năng tạo bào tử của Bacillus albus NNK24 và ứng dụng chế phẩm bào tử này trong hỗ trợ tăng trưởng cây đậu phộng. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sản xuất chế phẩm bào tử Bacillus albus NNK24 hỗ trợ tăng trưởng cây đậu phộng

SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ Bacillus albus NNK24 HỖ TRỢ TĂNG TRƯỞNG CÂY ĐẬU PHỘNG Lê Kim Ngọc*, Nguyễn Ngọc Trúc Nghi Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương TÓM TẮT Bacillus albus NNK24 là vi khuẩn nội sinh cây đậu phộng có hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng và ức chế mầm bệnh trên cây trồng, được sử dụng nghiên cứu khả năng tạo bào tử và ứng dụng bào tử trong hỗ trợ tăng trưởng cây đậu phộng. Kết quả cho thấy môi trường NB bổ sung khoáng làm cho mật độ bào tử tăng lên đến 1.2 x 109 CFU/mL, gấp 7 lần khi môi trường không bổ sung khoáng. Bào tử B. albus NNK24 giúp nâng cao tỉ lệ nảy mầm, độ khỏe mầm (vigour index), chiều dài và khối lượng cây so với đối chứng âm (không xử lý) và đối chứng dương là xử lý bằng thuốc hóa học. Điều này gợi mở tiềm năng tương lai ứng dụng bào tử B. albus NNK24 trong tạo chế phẩm hỗ trợ tăng trưởng cây đậu phộng giúp duy trì tính ổn định chế phẩm lâu dài. Từ khóa:vi khuẩn nội sinh; mật độ bào tử; ứng dụng bào tử. 1. TỔNG QUAN Hiện nay, Bacillus đã được báo cáo rằng có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật vì có khả năng ngăn chặn mầm bệnh và thúc đẩy sự phát triển của thực vật bằng cách tiết ra các hợp chất thúc đẩy sự phát triển của cây trồng (Sansinenea et al, 2019). Đặc biệt, khả năng hình thành nội bào tử và sống sót của chi Bacillus được xem là quá trình tuyệt vời giúp chúng bảo vệ khỏi môi trường khắc nghiệt như: nhiệt, bức xạ và hóa chất độc hại. Gặp môi trường thuận lợi, bào tử Bacillus có thể nảy mầm thành các tế bào sinh dưỡng mới và tiếp tục phát triển (Mongkolthanaruk et al, 2012). Tạo chế phẩm sinh học chứa bào tử Bacillus dùng cho nhiều mục đích khác nhau đặc biệt lĩnh vực nông nghiệp đang được quan tâm vì tính ổn định, thời hạn sử dụng lên đến 1 đến 3 năm ( Ji et al, 2021). Chính vì các lý do trên, mục đích của nghiên cứu này hướng đến việc khảo khả năng tạo bào tử của Bacillus albus NNK24 và ứng dụng chế phẩm bào tử này trong hỗ trợ tăng trưởng cây đậu phộng. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu - Chủng vi khuẩn Bacillus albus NNK24 phân lập từ rễ cây đậu phộng trong nghiên cứu được thực hiện bởi Trinh et al, (2022). - Môi trường lên men: Nutrient broth và Nutrient broth có bổ sung chất khoáng gồm có MnSO4; CaCl2; ZnSO4; KCl. - Giống đậu phộng L14. 588
- Thuốc xử lý hạt giống Cruiser plus 312.5fs (Công ty Syngenta). 2.2. Phương pháp 2.2.1. Kiểm tra chủng thuần khiết Vi khuẩn B. albus NNK24 được kiểm tra lại đặc điểm hình thái theo mô tả của Trinh et al, (2022). Khả năng lên men đường manitol và sinh enzyme lecithinase được kiểm tra bằng cách cấy đơn bào tử trên môi trường MYP theo mô tả của Perales et al, (2003). 2.2.2. Khảo sát đường cong tăng trưởng vi khuẩn B. albus NNK24 Chủng khuẩn B. albus NNK24 được hoạt hóa trên môi trường thạch NA trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Các khuẩn lạc đặc trưng được tăng sinh trong môi trường NB, lắc 150v/p trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. 5% dịch tăng sinh vi khuẩn (mật độ 109 CFU/ml) được bổ sung vào 50 ml môi NB trong 2 ngày, lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng. Mật độ vi khuẩn được theo dõi ở 0, 2, 4, 6, 8, 24, 26, 28, 48 giờ bằng phương pháp xác định sinh khối vi khuẩn ở bước sóng 600 nm (Amatulloh et al, 2021). 2.2.3. Khảo sát khả năng tạo bào tử của vi khuẩn dưới tác động của hỗn hợp khoáng Chủng vi khuẩn được cấy vào môi trường lên men (nutrient broth và nutrient broth có bổ sung khoáng) với tỷ lệ 5% và nuôi cấy tại các nhiệt độ 27 ± 2oC, lắc 180 v/p, trong 72 giờ. 10 ml dịch sau lên men được gia nhiệt 80oC, trong 15 phút, sau đó pha loãng và cấy trang trên môi trường MYP để kiểm tra tổng số bào tử trong môi trường lên men (EN 15784:2009; ISO - ISO 7932:2004). 2.2.4. Khảo sát khả năng hỗ trợ tăng trưởng cây đậu phộng của dịch lên men bào tử vi khuẩn (in-planta) Hạt giống đậu phộng (20 hạt) được làm sạch bằng bằng cồn 70% và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Các hạt đậu phộng đã khử trùng bề mặt được ngâm trong nước trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng. Hạt đậu phộng sau các quá trình trên được ngâm trong các nghiệm thức gồm có đối chứng âm, đối chứng dương (thuốc hóa học Cruiser plus 312.5fs) và dịch lên men vi khuẩn B. albus NNK24 (1.2 x 109 bào tử/ml) trong 30 phút. Các hạt đậu phộng đã được xử lý được chuyển vào hộp nhựa đã được khử trùng bề mặt. Theo dõi sự phát triển của cây đậu phộng, ghi nhận tỉ lệ nảy mầm, độ khỏe mầm, chiều dài và khối lượng cây trong 5 và 10 ngày sau khi xử lý (Trinh et al, 2023). Tỉ lệ nảy mầm (%) = (Tổng số hạt nảy mầm sau 5 ngày ÷ Tổng số hạt) × 100. Độ khỏe mầm (VI) được tính theo công thức: Vigour Index (VI) = Tỉ lệ nảy mầm (%) x tổng chiều dài cây (cm) 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hình thái, sinh lý, sinh hóa Chủng vi khuẩn Bacillus albus NNK24 được khảo sát hình thái khuẩn lạc và tế bào (hình 1) cho kết quả tương đồng với mô tả của. Trên môi trường MYP (hình 2), môi trường ngả sang màu vàng do khả năng lên men mannitol sinh acid làm chuyển màu phenol red từ đỏ sang vàng. Khả năng sinh enzyme lecithinase được thể hiện bằng khả năng sinh vòng trắng đục xung quanh khuẩn lạc hình thành. 589
Hình1. Khuẩn lạc và tế bào Bacillus albus NNK24 Hình 2. Khuẩn lạc Bacillus albus NNK24 trên môi trường MYP 3.2 Đường cong tăng trưởng của B. albus NNK24 Vi khuẩn B. albus NNK24 sinh trưởng trong môi trường NB ở nhiệt độ phòng trong 2 - 4 giờ được thấy như là khoảng thời gian thích nghi của chúng được trình bày ở hình 2. Từ khoảng thời gian 10 giờ trở đi cho thấy vi khuẩn bắt đầu tăng trưởng mạnh kéo dài đến 48 giờ và vẫn chưa có dấu hiệu chuyển thành pha suy vong. Trong một số nghiên cứu đã cho thấy khả năng sinh trưởng tối ưu của các loài Bacillus khi được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm có thể kéo dài lên đến 72 giờ (Jayani et al, 2010; Singh et al, 2015). Mặc dù kết quả nghiên cứu này đã cho thấy được sự tăng trưởng của B. albus NNK24 trong 48 giờ, nhưng vẫn chưa xác định được khoảng thời gian mà chúng đi vào pha suy vong, chính vì vậy trong nghiên cứu tiếp theo chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu thêm nhiều mốc thời gian tăng trưởng của B. albus NNK24 để xác định pha suy vong. Hình 3: Đường cong tăng trưởng chủng Bacillus albus NNK24 3.3. Khả năng tạo bào tử của vi khuẩn dưới tác động của hỗn hợp khoáng 590
Hình 4: Các bình nuôi cấy B. albus NNK 24 trong A: môi trường không khoáng B: môi trường có khoáng Dịch lên men từ môi trường không bổ sung khoáng của NNK24 có màu vàng nhạt, đục, trong khi dịch lên men từ môi trường có bổ sung khoáng màu vàng cam, đục đậm hơn (hình 4). Mật độ bào từ hai môi trường trên được xác định bằng phương pháp cấy trang trên môi trường MYP, từ dịch lên men đã được gia nhiệt ở 80oC trong 15 phút. Kết quả mật độ trên môi trường NB không bổ sung khoáng là 1,7 x108 (bào tử/ml) và môi trường lên men có bổ sung khoáng là 1,2 x 109 (bào tử/ml). Như vậy mật độ bào tử từ môi trường NB có bổ sung khoáng cao gấp 7.05 lần so với môi trường NB thông thường. Dịch lên men này tiếp tục được sử dụng để phân tích khả năng hỗ trợ tăng trưởng của bào tử B. albus NNK24. 3.4. Khả năng hỗ trợ tăng trưởng cây đậu phộng của dịch lên men vi khuẩn in-planta Kết quả trên hình 5, hình 6 cho thấy trong khoảng thời gian ở giai đoạn cây con (5 ngày), cây đậu phộng được xử lý bằng dịch nuôi cấy bào từ B. albus NNK24 có tỉ lệ nảy mầm trên 70% và có sự khác biệt rõ rệt so với đối chứng âm là nước cất (P < 0.05), tuy nhiên khi so với đối chứng dương là xử lý bằng thuốc hóa học lại không có sự khác biệt (P > 0.05). Tuy nhiên độ khỏe mầm của cây đậu phộng xử lý bằng dịch bào tử chủng NNK24 có giá trị lớn hơn 800 có sự khác biệt rất lớn khi so với đối chứng âm (P < 0.0001) và (P < 0.001) khi so với đối chứng dương, trong khi đối chứng dương chỉ lớn hơn có sự khác biệt P < 0.01 khi so với đối chứng âm. Tương tự vậy, chiều dài của cây đậu phộng 15 ngày tuổi ở nghiệm thức xử lý bằng NNK24 có chiều dài trên 10 cm có sự khác biệt (P < 0.001) khi so với đối chứng âm và (P < 0.01) khi so với chứng dương, trong khi đối chứng âm và đối chứng dương lại không có sự khác biệt thống kê (P > 0.05). Tuy nhiên khối lượng của cây đậu phộng ở cả ba nghiệm thức đều có khối lượng không có sự khác biệt thống kê (P > 0.05) mặc dù NNK24 cho khối lượng nặng hơn gấp 1.83 lần khi so với đối chứng âm và 1.57 lần khi so với đối chứng dương. So với nghiên cứu được thực hiện trước đó trong nghiên cứu ứng dụng tế bào sinh dưỡng của B. albus NNK24 trong ức chế bệnh Aspergillus flavus được thực hiện bởi Trinh et al, (2023), đã cho thấy kết quả về tỉ lệ nảy mầm, độ khỏe mầm, chiều dài và khối lượng cây đều có các khoảng giá trị gần giống kết quả nghiên cứu này; mặc dù khảo sát cây đậu phộng trong điều kiện nhiễm bệnh mốc vàng A.flavus, nhưng chủng NNK24 vẫn giữ được khả năng hỗ trợ tăng trưởng vốn có của mình. Điều này chứng tỏ chủng NNK24 là vi khuẩn nội sinh cây đậu phộng và biểu hiện tốt các đặc tính hỗ trợ tăng trưởng bền vững trên cây đậu phộng, kể cả ứng dụng trong điều kiện bào tử hoặc tế bào sinh dưỡng. 591
Hình 5: Tỷ lệ nảy mầm, độ khỏe mầm, chiều dài mầm và khối lượng mầm Chú thích: ĐC âm: xử lý nước; ĐC dương: xử lý với thuốc hóa học Cruiser plus 312.5fs; Vigour Index: độ khỏe mầm Hình 6: Mầm cây sau 10 ngày trồng ra đất 5. KẾT LUẬN Môi trường NB có bổ sung khoáng giúp Bacillus albus NNK24 có khả năng tạo bào tử nhiều hơn so với môi trường NB thông thường, điều này kiến nghị tiếp tục sử dụng môi trường NB bổ sung khoáng trong các nghiên cứu tạo chế phẩm trong tương lai. Bào tử được tạo ra từ trong môi trường này có khả năng hỗ trợ tăng trưởng tốt hơn khi so với đối chứng âm (không xử lý) và đối chứng dương là thuốc hóa học, làm tăng các giá trị đo lường như là tỉ lệ nảy mầm, độ khỏe mầm (vigour index), chiều dài và khối lượng cây, đặc biệt giá trị độ khỏe mầm có sự khác biệt lớn so với không xử lý. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amatulloh, Z., Mulyani, Y., Dewanti, L. P., & Haetami, K. (2021). Growth characteristics and tracing antagonistic properties of Bacillus flexus and Bacillus subtilis as antibacterials to overcome the attack of Aeromonas hydrophila bacteria on fish. World Scientific News, 158, 91-104. 2. EN 15784:2009 - Animal feeding stuffs - Isolation and enumeration of presumptive Bacillus spp. 592
3. (n.d.). Retrieved September 3, 2022. 4. ISO - ISO 7932:2004 - Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for 5. the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C. (n.d.). Retrieved September 3, 2022. 6. Ji, C., Zhang, M., Kong, Z., Chen, X., Wang, X., Ding, W., ... & Guo, Q. (2021). Genomic analysis reveals potential mechanisms underlying promotion of tomato plant growth and antagonism of soilborne pathogens by Bacillus amyloliquefaciens Ba13. Microbiology Spectrum, 9(3), e01615-21. 7. Jayani, R. S., Shukla, S. K., & Gupta, R. (2010). Screening of bacterial strains for polygalacturonase activity: its production by Bacillus sphaericus (MTCC 7542). Enzyme research, 2010. 8. Mongkolthanaruk, W. (2012). Classification of Bacillus beneficial substances related to plants, humans and animals. Journal of microbiology and biotechnology, 22(12), 1597-1604. 9. Perales, I., Corry, J. E. L., Curtis, G. D. W., & Baird, R. M. (2003). Handbook of culture media for food microbiology. 10. Sansinenea, E. (2019). Bacillus spp.: As plant growth-promoting bacteria. Secondary metabolites of plant growth promoting rhizomicroorganisms: Discovery and applications, 225-237. 11. Singh, P., Rani, A., & Chaudhary, N. (2015). Isolation and characterization of protease producing Bacillus sp from soil. International Journal of Pharma Sciences and Research, 6(4), 633- 639. 12. Trinh, L. L., Le Nguyen, A. M., & Nguyen, H. H. (2022). Beneficial endophytic and epiphytic bacteria from peanut root microbiome possessing plant-growth-promoting traits and antifungal activity against aflatoxin-producing Aspergillus flavus CDP2. Proceedings of Vietnam National Conference on Biotechnology 2022, 638–644. 13. Trinh, L. L., Le Nguyen, A. M., & Nguyen, H. H. (2023). Root-associated bacteria Bacillus albus and Bacillus proteolyticus promote the growth of peanut seedlings and protect them from the aflatoxigenic Aspergillus flavus CDP2. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 47, 102582. 593