Sử dụng phương pháp cắt đốt và trồng trực tiếp ra vườn ươm cây lan hài hồng (Paphiopedilum Delenatii)

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 272-276<br /> <br /> <br /> <br /> SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CẮT ĐỐT VÀ TRỒNG TRỰC TIẾP RA VƯỜN ƯƠM<br /> CÂY LAN HÀI HỒNG (Paphiopedilum delenatii)<br /> <br /> Vũ Quốc Luận1, Nguyễn Phúc Huy1, Đỗ Khắc Thịnh2, Dương Tấn Nhựt1*<br /> 1<br /> Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam,<br /> *duongtannhut@gmail.com<br /> 2<br /> Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam<br /> <br /> TÓM TẮT: Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) là một trong những loài hoa lan rất khó thực hiện<br /> nhân giống vô tính, việc tìm ra một phương pháp mới, đơn giản để tạo ra một số lượng lớn cây giống<br /> trong thời gian ngắn hết sức cần thiết. Trong nghiên cứu này, các chồi non lan hài hồng có 4 lá được cấy<br /> vào môi trường SH có bổ sung 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than<br /> hoạt tính và được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các đốt thân; sau đó<br /> được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp diệp lục tố và các năng lượng cần thiết cho<br /> cây. Kết quả cho thấy, các chồi non được kéo dài trung bình 10,50 cm, với số lá mới hình thành trung bình<br /> 5 lá/chồi, tương ứng với 5 đốt/chồi thu được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối. Sau đó, các chồi được<br /> đưa sang điều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá mới, tuy nhiên, không nhận<br /> thấy có sự phân đốt. Sau 180 ngày nuôi cấy, các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt với 1 lá và 1 rễ, riêng<br /> phần đỉnh chồi được giữ nguyên với 3 lá và 2 rễ. Cuối cùng, các đốt thân được trồng trên giá thể dớn Đài<br /> Loan thu được kết quả cao nhất ở vị trí đốt thân số 1 với tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng.<br /> Từ khóa: Paphiopedilum delenatii, nhân giống vô tính, phương pháp cắt đốt.<br /> <br /> MỞ ĐẦU non để kích thích tạo chồi bên và tạo cây hoàn<br /> Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) là chỉnh. Để giảm chi phí trong quá trình nhân<br /> một trong những loài lan đặc hữu của Việt Nam. nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh. Trong nghiên<br /> Lan hài hồng không chỉ cho hoa đẹp, quí, có cứu này, chúng tôi đã kéo dài chồi in vitro trong<br /> hương thơm khi nở nên được nhiều người ưa điều kiện tối trong 4 tháng và được đưa ra điều<br /> chuộng [8]. Hiện nay, lan hài hồng đã được xếp kiện chiếu sáng thêm 2 tháng. Sau đó, sử dụng<br /> vào một trong những loài lan bị đe dọa có nguy phương pháp cắt đốt và trồng trực tiếp ra ngoài<br /> cơ tuyệt chủng [1]. Cho tới nay, đã có một số vườn ươm.<br /> báo cáo về nghiên cứu nhân giống vô tính lan VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> hài hồng: phương pháp gây viết thương [6],<br /> phương pháp kéo dài đốt thân in vitro cây con Vật liệu nghiên cứu là những chồi non in<br /> lan hài hồng có nguồn gốc từ hạt để gia tăng hệ vitro lan hài hồng có chiều dài lá khoảng 3 cm<br /> số nhân chồi [5]. Luan et al. (2012) [2] đã chiếu và có số lá trung bình 4 lá/chồi được nuôi cấy<br /> xạ các PLB có nguồn gốc từ hạt và tạo giống tại Phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống<br /> đột biến trên đối tượng lan hài hồng. Luan et al. cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây<br /> (2012) [4] đã sử dụng chồi non 2 tháng tuổi ex Nguyên. Những chồi này được đưa vào điều<br /> vitro phục vụ cho quá trình tạo mẫu ban đầu và kiện tối trong 4 tháng nhằm kéo dài chồi và tạo<br /> sử dụng phương pháp hủy đỉnh để nhân nhanh thành các đốt riêng biệt. Sau đó, chúng được<br /> cây con và tạo cây hoàn chỉnh in vitro. Để khắc đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá<br /> phục những khó khăn trong quá trình tạo mẫu tổng hợp chất diệp lục và năng lượng cần thiết.<br /> và tăng số mẫu cấy ban đầu, Luan et al. (2012) Cuối cùng, chúng được cắt thành từng đốt riêng<br /> [3] đã sử dụng ánh sáng đơn sắc để kéo dài chồi biệt và trồng ra điều kiện vườn ươm.<br /> lan hài hồng ex vitro nhằm tạo điều kiện thuận Kéo dài chồi in vitro lan hài hồng trong điều<br /> lợi cho quá trình thu mẫu và khử trùng mẫu kiện che tối hoàn toàn<br /> phục vụ cho quá trình tạo mẫu ban đầu. Sau đó, Các chồi non có 4 lá được cấy vào môi<br /> sử dụng phương pháp gây vết thương các chồi trường SH (Schenk & Hildebrandt, 1972) [7] có<br /> <br /> 272<br />  Vu Quoc Luan et al.<br /> <br /> bổ sung 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l với giá thể dớn Đài Loan sau 12 tháng.<br /> đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính Xử lý số liệu<br /> và được đưa vào điều kiện che tối hoàn toàn<br /> trong 4 tháng nhằm khảo sát ảnh hưởng của Đối với công thức kéo dài chồi in vitro<br /> điều kiện che tối hoàn toàn lên khả năng kéo dài trong điều kiện che tối hoàn toàn, mỗi lần xử lý<br /> chồi in vitro. với 5 bình, mỗi bình có 5 chồi non và trong thí<br /> nghiệm cắt đốt và trồng ra vườn ươm mỗi lần<br /> Khảo sát khả năng sống sót của các đốt thân xử lý 25 đốt với 5 đốt thân/chậu. Thí nghiệm<br /> ngoài vườn ươm được lặp lại 4 lần, các số liệu được xử lý bằng<br /> Các chồi in vitro được đặt trong điều kiện cách sử dụng phần mềm phân tích thống kê<br /> che tối 4 tháng, sau đó, được đưa ra điều kiện SPSS 16.0 theo phương pháp Ducan test với<br /> chiếu sáng đèn huỳnh quang với cường độ chiếu α=0,05.<br /> sáng 2.500-3.000 lux và thời gian chiếu sáng<br /> 16/8 giờ (sáng/tối) trong 2 tháng tiếp theo ở nhiệt KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> độ phòng 25±3ºC. Cuối cùng các chồi được cắt Khảo sát sự kéo dài chồi in vitro lan hài hồng<br /> thành từng đốt riêng biệt và trồng ra vườn ươm trong điều kiện che tối hoàn toàn<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của điều kiện che tối lên sự kéo dài chồi in vitro lan hài hồng<br /> Chiều dài Chiều Số rễ<br /> Thời gian Chiều cao<br /> Số lá lá rộng lá hình<br /> che tối chồi Màu sắc lá<br /> mới /chồi mới mới thành/<br /> (ngày) (cm)<br /> (cm) (cm) đốt<br /> Đối chứng<br /> 120 ngày 4,25d 3,00c 4,95a 3,37a 0,00c Chồi xanh đậm<br /> sáng<br /> Lá non hình thành<br /> 30 4,37d 1,00e 3,80b 1,65b 0,00c<br /> có màu xanh nhạt<br /> Lá gốc màu vàng,<br /> 60 5,65c 2,42d 3,00c 1,45bc 0,00c lá non có màu xanh<br /> trắng<br /> Lá gốc màu vàng,<br /> 90 7,12b 3,75b 2,22d 1,15c 1,82b lá non có màu xanh<br /> trắng<br /> Lá gốc màu nâu, lá<br /> 120 10,50a 5,00a 2,00d 1,12c 3,37a non có màu xanh<br /> trắng<br /> <br /> Ảnh hưởng của điều kiện che tối hoàn toàn ngắn lại và không nhận thấy có sự xuất hiện rễ<br /> lên khả năng kéo dài đốt thân sau 120 ngày trên các mắt đốt. Kết quả thu nhận sau 90 ngày<br /> được chỉ ra ở bảng 1. Các chồi non được đặt nuôi cấy cho thấy, chiều dài chồi đã đạt 7,12 cm<br /> trong điều kiện che tối hoàn toàn cho thấy sự và sự kéo dài của đốt lóng thân có thể đạt từ 1-<br /> khác biệt rõ rệt về chiều cao sau 30, 60, 90 và 1,5 cm, chiều dài lá ngắn và chiều rộng tiếp tục<br /> 120 ngày nuôi cấy (hình 1a-e). Trong nghiên được thu hẹp còn 1,15 cm (bảng 1), lá non có<br /> cứu này, sau 30 ngày nuôi cấy, phần đốt đầu màu gần như trắng, lá gần gốc nhất bắt dầu ngả<br /> tiên đã bắt đầu kéo dài, lá non có màu xanh sang màu vàng. Trong khi đó, rễ bắt đầu xuất<br /> nhạt, phần gốc lá có màu trắng do thiếu ánh hiện tại các mắt thân với 1 rễ/mắt (hình 1c). Sau<br /> sáng để tổng hợp diệp lục tố. Sau 60 ngày nuôi 120 ngày nuôi cấy, chiều cao chồi đã đạt 10,50<br /> cấy, chiều cao chồi đã tăng rõ rệt, đốt lóng thứ 2 cm với 5 lá mới được hình thành, chiều dài và<br /> đã vượt ra khỏi phần tầng lá cũ, chiều dài lá chiều rộng lá thu hẹp, lá có màu gần như trắng<br /> <br /> 273<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 272-276<br /> <br /> hoàn toàn do thiếu diệp lục tố và phần đỉnh chồi dưới điều kiện chiếu sáng đèn LED và trong<br /> đã cao tới miệng của bình nuôi cấy (hình 1e), lá điều kiện tối và thu được chiều cao chồi trung<br /> gốc chuyển sang giai đoạn hóa nâu và hoại tử. bình 11 cm trong điều kiện chiếu sáng 100%<br /> Các rễ non tiếp tục dài ra và hình thành thêm LED xanh với 5,75 lá/chồi. Trong điều kiện tối<br /> các rễ mới, trung bình 3,37 rễ/chồi ở các mắt với chiều cao trung bình đạt 8,87 cm và<br /> thân non. Kết quả nghiên cứu khác về kéo dài 5 lá/chồi, chiều rộng lá trung bình trong điều<br /> chồi in vitro dưới hệ thống chiếu sáng đơn sắc kiện LED xanh và trong tối giảm dần chỉ đạt<br /> LED phục vụ cho quá trình nhân giống trên đối 1,35-1,60 cm, chiều dài lá trung bình cũng chỉ<br /> tượng lan hài hồng và kết quả thu được cây con đạt 5,75-6,12 cm. Trong nghiên cứu này của<br /> có chiều cao trung bình 10 cm trong điều kiện chúng tôi, sự kéo dài chồi trong điều kiện tối<br /> 100% LED đỏ và dưới ánh sáng đèn huỳnh hoàn toàn sau 120 ngày nuôi cấy đạt chiều cao<br /> quang cường độ thấp [6]. Luan et al. (2012) [3] 10,50 cm với số lá mới hình thành trung bình<br /> kéo dài chồi ex vitro trên đối tượng lan hài hồng 5 lá/chồi.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. a. Đối chứng 120 ngày nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng; b. Nuôi cấy 30 ngày trong tối;<br /> c. Nuôi cấy 60 ngày trong tối; d. Nuôi cấy 90 ngày trong tối; e. Nuôi cấy 120 ngày trong tối;<br /> f. Nuôi cấy 180 ngày; g. Cắt thành từng đốt riêng biệt; h. Trồng từng đốt riêng biệt trên giá thể dớn<br /> Đài Loan; i, j. Cây con ở vị trí đốt thân số 1 sinh trưởng ngoài vườn ươm sau 12 tháng;<br /> k. Cây con hình thành ở từng vị trí đốt thân sau 12 tháng ngoài vườn ươm.<br /> <br /> <br /> 274<br />  Vu Quoc Luan et al.<br /> <br /> Khảo sát khả năng sống sót của các vị trí đốt và 4 đã có sự hình thành chồi bên trung bình<br /> thân ngoài vườn ươm sau 12 tháng tương ứng 0,75-0,72 chồi/mẫu (bảng 2) và phát<br /> Các chồi in vitro được kéo dài đốt thân trong triển thành cây hoàn chỉnh với số lá mới hình<br /> điều kiện tối và chuyển sang điều kiện chiếu sáng thành trung bình 2,50-3,12 lá/chồi (hình 1k-3,4).<br /> sau 180 ngày được cắt thành từng đốt riêng biệt Ở vị trí số 5 (tương ứng với đốt gốc), kết quả cho<br /> và trồng trực tiếp ra vườn ươm trên giá thể dớn thấy khả năng sống sót (56,25%) và hình thành<br /> Đài Loan (hình 1h). Kết quả thu nhận sau 12 chồi mới tương đối thấp (0,53 chồi/mẫu) (bảng<br /> tháng cho thấy, khả năng sống sót cũng như quá 2). Kết quả này có thể giải thích là do phần gốc<br /> trình sinh trưởng và phát triển có sự khác biệt ở đã bị già hóa, khi trồng ra vườn ươm, lá trên các<br /> các vị trí đốt thân. Ở vị trí số 1 (tương ứng với mắt đốt bắt đầu chuyển sang giai đoạn lão suy và<br /> chồi đỉnh) cho tỷ lệ sống sót 100% và các chồi mất khả năng quang hợp, do đó, khả năng kích<br /> đỉnh tiếp tục có sự gia tăng về tất cả các chỉ tiêu thích hình thành chồi bên đã bị giảm. Phương<br /> theo dõi (bảng 2) (hình 1ij). Tỷ lệ sống sót cao pháp cắt đốt và tạo cây hoàn chỉnh in vitro trên<br /> cũng có thể được giải thích là do vị trí đỉnh chồi đối tượng lan hài hồng đã được mô tả bởi Nhut et<br /> khi trồng ra vườn ươm đã có trung bình 3 lá và 2 al. (2007) [5] với kết quả đạt được 75% tạo cây<br /> rễ, điều này gia tăng khả năng quang hợp và hút hoàn chỉnh. Trong khi đó, Luan et al. (2012) [3]<br /> nước cho cây là rất tốt (hình 1g1). Trong khi đó, cũng sử dụng phương pháp cắt đốt các chồi ex<br /> ở vị trí đốt thân số 2, khả năng sống sót thấp vitro lan Hài hồng phục vụ cho quá trình tái sinh<br /> (23,75%) cũng như số mẫu chết cao và không có in vitro với tỷ lệ đạt 33,50%. Ngoài ra, phương<br /> sự hình thành chồi bên có thể là do mắt đốt thân pháp cắt hom và kết hợp xử lý phân bón lá để<br /> còn non nên khi trồng ra vườn ươm chúng đã bị kích thích tạo chồi bên trên đối tượng lan Mokara<br /> thối hoàn toàn. Ở ví trí đốt thân số 3 và 4 cũng đã được báo cáo bởi Dương Hoa Xô (2007) [9]<br /> cho tỷ lệ sống sót thấp lần lượt là 33,75 và với kết quả thu được 4,5-5 chồi/cây. Trong<br /> 32,50% là do khi cắt các đốt thân, đã tạo ra các nghiên cứu này, chồi đỉnh cho tỷ lệ sống sót<br /> vết thương và khi trồng trên giá thể có độ ẩm cao 100%, từ 1 chồi non ban đầu sau khi được kéo<br /> đã tạo điều kiện cho vi sinh vật tấn công vào vết dài đốt thân đã tạo được (1+0,75+0,72+0,53<br /> thương làm cho mẫu bị thối, do đó, tỷ lệ sống sót chồi/mẫu) 3 cây hoàn chỉnh từ 5 đốt thân.<br /> giảm. Tuy nhiên, các mẫu sống sót ở vị trí số 3<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của vị trí đốt thân lên khả năng sống sót và phát triển ngoài vườn ươm sau 12 tháng<br /> Tỷ lệ Tỷ lệ<br /> Vị trí Số chồi mới Số lá mới Chiều<br /> mẫu mẫu<br /> đốt hình hình rộng lá Hình thái chồi<br /> sống chết<br /> thân thành/mẫu thành (cm)<br /> (%) (%)<br /> 1 100,00a 0,00d 1,00a 3,87a 3,07a Chồi to, khỏe<br /> d a d d<br /> 2 23,75 76,25 0,00 0,00 0,00d Không tạo chồi<br /> 3 33,75c 66,25b 0,75b 2,50c 1,42c Chồi yếu, xanh nhạt<br /> c b b b c<br /> 4 32,50 67,50 0,72 3,12 1,45 Chồi yếu, xanh nhạt<br /> 5 56,25b 43,75c 0,53c 4,12a 2,12b Chồi to, xanh đậm<br /> <br /> KẾT LUẬN năng sống sót và sinh trưởng tốt nhất ở giai<br /> đoạn vườn ươm với tỷ lệ 100% trên giá thể dớn<br /> Chồi sinh trưởng kéo dài trong điều kiện tối Đài Loan thu được ở vị trí đốt số 1 với số lá mới<br /> sau 120 ngày nuôi cấy cho chiều cao tương ứng hình thành trung bình 3,87 lá/chồi với chiều<br /> 10,50 cm và tạo ra số đốt trung bình cao nhất 5 rộng của lá 3,07 cm. Như vậy, từ 1 chồi in vitro<br /> đốt/chồi. Chồi tiếp tục được nuôi cấy dưới điều ban đầu sau khi kéo dài đốt thân sau 180 ngày,<br /> kiện chiếu sáng đèn huỳnh quang sau 60 ngày cắt đốt trồng trên giá thể dớn Đài Loan đã tạo<br /> với cường độ chiếu sáng 2.500-3.000 lux và được 3 cây hoàn chỉnh (1+0,75+0,73+0,53<br /> thời gian chiếu sáng 16/8 giờ (sáng/tối). Khả chồi/mẫu ) ngoài vườn ươm sau 12 tháng.<br /> <br /> 275<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 272-276<br /> <br /> Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm delenatii. J. Scitechnol. (Accepted).<br /> ơn Quỹ Nafosted, mã số 106.16-2012.32 và 5. Nhut D. T., Thuy D. T. T., Don N. T., Luan<br /> Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã tạo V. Q., Hai N. T., Tran Thanh Van K.,<br /> điều kiện cho chúng tôi hoàn thành nghiên cứu Chinnappa C. C., 2007. Stem elongation of<br /> này. Paphiopedilum delenatii Guillaumin and<br /> shoot regeneration via stem node culture.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Prop Orn Plant., 7(1): 29-36.<br /> 1. Convention on International Trade in 6. Nhut D. T., Trang P. T. T., Vu N. H., Thuy<br /> Endangered Species of Wild Fauna and D. T. T., Khiem D. V., Tran Thanh Van K.,<br /> Flora Appendices. I, II and III. Geneva, 2005. A wounding method and liquid culture<br /> Switzerland, 2008. Available at: in Paphiopedilum delenatii propagation.<br /> http://www.cites.org/eng/news/SG/2011/20 Prop Orn Plant., 5(3): 158-163.<br /> 110512_SG_CIC.php.<br /> 7. Schenk R. U., Hildebrandt A. C., 1972.<br /> 2. Luan Q. L., Uyen N. H. P., Ha V. T. T., Medium and techniques for induction and<br /> 2012. In vitro mutation breeding of growth of monocotyledonous and dicotyle-<br /> Paphiopedilum by ionization radiation. Sci donous plant cell cultures. Canadian Bot.,<br /> Hort., 144: 1-9. 50: 199-204.<br /> 3. Luan Q. V., Huy N. P., Tra L. T. T., Thinh 8. Nguyễn Thiện Tịch, 2001. Lan Việt Nam,<br /> D. K., Nhut D. T., 2012. Light-emitting Nxb. Nông nghiệp, tp. Hồ Chí Minh.<br /> diodes (LEDS) for ex vitro shoot elongation<br /> an shoot regeneration of paphiopedilum 9. Dương Hoa Xô, 2007. Ứng dụng một số<br /> delenatii. J. Biotechnol., 10(4A): 961-968. tiến bộ kỹ thuật mới trong việc nhân giống<br /> và cải thiện chất lượng cành hoa nhóm hoa<br /> 4. Luan V. Q., Huy N. P., Thinh D. K., Nhut lan cắt cành Mokara. Hội nghị khoa học<br /> D. T., 2014. Utilizing the technique of Công nghệ sinh học thực vật trong công tác<br /> wounding the shoot apex in nhân giống và chọn tạo giống hoa. Nxb.<br /> micropropagation of Paphiopedilum Nông nghiệp, 341-347.<br /> <br /> USING IN VITRO STEM NODE CUTTING METHOD<br /> IN PROPAGATION OF Paphiopedilum delenatii<br /> <br /> Vu Quoc Luan1, Nguyen Phuc Huy1, Do Khac Thinh2, Duong Tan Nhut1<br /> 1<br /> Tay Nguyen Institute for Scientific Research, VAST<br /> 2<br /> Institute of Agricultural Science for Southern Vietnam, VAGS<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Paphiopedilum delenatii is recalcitrant to micropropagation. Lack of high efficient method for massive<br /> production of seedlings has existed for many years. In this paper, young shoots with 4 leaves were cultured on<br /> SH medium containing 0.5 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 9 g/l agar and 1 g/l activated charcoal and<br /> maintained under total darkness for 4 months before transferred into fluorescent light at a PPFD of 45 µmol<br /> m−2s-1 for 2 months. After 4 months cultured under darkness, the shoots were extended for an average of 10.5<br /> cm, with 5 leaves/ shoot, equivalent to 5 nodes/ shoot. After the next 2 months under fluorescent light, leaf<br /> formation was obtained but no stem node induction was observed. Shoots were then excised into 5 single<br /> nodes with 1 leaf and 1 root per node, and the apical shoots developed with 3 leaves and 2 roots each. Finally,<br /> nodes with well-developed root and leaf systems were grown in sphagnum moss (Taiwan) and gave the<br /> survival rate of 100% after 12 months.<br /> Keywords: Paphiopedilum delenatii, cutting method, stem node, propagation.<br /> Ngày nhận bài: 15-7-2013<br /> <br /> <br /> 276<br />