Tách các neurotoxin từ nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia)

T¹p chÝ Hãa häc, T. 45 (§B), Tr. 21 - 24, 2007<br /> <br /> <br /> T¸ch c¸c neurotoxin tõ näc r¾n hæ ®Êt<br /> (Naja kaouthia)<br /> §Õn Tßa so¹n 15-11-2007<br /> TrÇn Ngäc T©n , Tr ¬ng Nam H¶i1, Ho ng Ngäc Anh2<br /> 1<br /> <br /> 1<br /> ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Khoa häc v( C«ng nghÖ ViÖt Nam<br /> 2<br /> ViÖn Khoa häc VËt liÖu øng dông, ViÖn Khoa häc v( C«ng nghÖ ViÖt Nam<br /> <br /> <br /> Summary<br /> The first time, two neurotoxins were isolated and characterized from Vietnamese N. kaouthia<br /> snake venom. These neurotoxins were isolated using a reverse-phase HPLC on semipreparative<br /> column Supelcosil C18 and on analytic column Kromasil C18. The toxicity of isolated toxins was<br /> determined by injection it on the C57BL/6 mice. These isolated toxins have the masses of peak 4.6<br /> and 4.7 are related to 6448 and 6129 Da neurotoxins.<br /> <br /> <br /> I - më ®Çu xin tr×nh b y viÖc t¸ch c¸c neurotoxin tõ näc r¾n<br /> hæ ®Êt ViÖt Nam (N. kaouthia) víi môc ®Ých t×m<br /> R¾n hæ ®Êt (N. kaouthia) l lo¹i r¾n ®éc phæ kiÕm c¸c toxin míi ®Ó øng dông v o ®iÒu trÞ c¸c<br /> biÕn nhiÒu ë Ch©u ¸ [1]. Tõ näc r¾n hæ ®Êt bÖnh vÒ thÇn kinh.<br /> Trung Quèc ng%êi ta ®( t¸ch c¸c cobrotoxin b<br /> v cobrotoxin c, ®ã l c¸c neurotoxin ng¾n cã II – nguyªn liÖu v ph ¬ng ph¸p<br /> kÝch th%íc ph©n tö l 62 gèc axit amin [2]. Cßn nghiªn cøu<br /> tõ näc r¾n hæ ®Êt Th¸i Lan ng%êi ta ®( t¸ch ra<br /> ®%îc c¸c toxin, cÊu t¹o tõ 65 gèc axit amin víi 1. Nguyªn liÖu<br /> cÊu tróc bËc mét cña toxin n y t%¬ng tù nh% c¸c Näc ®%îc thu tõ r¾n N. kaouthia nu«i ë tr¹i<br /> muscarinic toxin t¸ch tõ näc r¾n lôc Ch©u Phi r¾n §ång T©m, TiÒn Giang. Näc ®%îc tiÕt ra<br /> [3]. C¸c muscarinic toxin n y lÇn ®Çu tiªn ®%îc b»ng c¸ch xoa bãp r¾n b»ng tay, sau ®ã ®em<br /> t¸ch ra tõ näc r¾n lôc Ch©u Phi (Denroapis ®«ng kh« v gi÷ ë 4oC ®Õn khi dïng. M¸y HPLC<br /> angusticeps), chóng gåm 65 hoÆc 66 gèc axit cña h(ng Shimazu (NhËt B¶n) ®%îc sö dông ®Ó<br /> amin [4]. VÒ cÊu tróc, c¸c muscarinic toxin cã t¸ch c¸c neurotoxin cña näc r¾n. C¸c hãa chÊt<br /> cÊu tróc kh«ng gian gièng cÊu tróc cña c¸c dïng trong ph©n tÝch ®%îc mua tõ h(ng Merck<br /> neurotoxin näc r¾n (cÊu tróc ba ngãn tay), (§øc).<br /> nh%ng cÊu tróc bËc mét cña chóng th× kh¸c cÊu<br /> tróc bËc mét cña c¸c alpha-neurotoxin nªn dÉn 2. Ph ¬ng ph¸p t¸ch c¸c neurotoxin tõ näc<br /> ®Õn sù kh¸c biÖt vÒ chøc n¨ng. HiÖn nay c¸c r¾n N. kaouthia<br /> muscarinic toxin ®%îc sö dông ®Ó nghiªn cøu C¸c ph©n ®o¹n chøa toxin ®%îc t¸ch tõ näc<br /> thô thÓ víi muscarinic v ®Æc biÖt chóng ®%îc th« b»ng ph%¬ng ph¸p s¾c ký láng cao ¸p víi<br /> sö dung ®Ó ®iÒu trÞ bÖnh Pakingson [5]. cét b¸n ®iÒu chÕ Supelcosil C18 (10 × 250 mm;<br /> TiÕp theo viÖc kh¶o s¸t c¸c th nh phÇn cña 5 µm), tèc ®é ch¹y cét 5 ml/phót. Cét s¾c ký<br /> näc r¾n hæ ®Êt [6] trong b i b¸o n y chóng t«i ®%îc ch¹y víi gradient tuyÕn tÝnh cña c¸c dung<br /> <br /> 21<br /> dÞch sau: A l 0,1% TFA trong n%íc v B l Khèi l%îng ph©n tö cña c¸c toxin ®%îc x¸c<br /> 0,1% TFA trong 60% acetonitril trong n%íc. ®Þnh b»ng ph%¬ng ph¸p ®iÖn di theo Osterman<br /> Ch%¬ng tr×nh ch¹y cét: 0 - 40% B trong 5 phót [8].<br /> v 40-100% B trong 25 phót. L%îng näc th« ®%a<br /> lªn cét mçi lÇn l 6 mg. III - kÕt qu¶ v th¶o luËn<br /> C¸c neurotoxin näc r¾n tiÕp tôc ®%îc t¸ch v<br /> tinh s¹ch tõ ph©n ®o¹n ®éc b»ng ph%¬ng ph¸p 1. T¸ch c¸c ph©n ®o¹n chøa toxin tõ näc r¾n<br /> s¾c ký láng cao ¸p víi cét ph©n tÝch Kromasil hæ ®Êt N. kaouthia<br /> C18 (4,6 × 250 mm, 10 µm), tèc ®é röa cét 1 Trong nghiªn cøu näc r¨n hæ ®Êt (N.<br /> ml/phót. Cét s¾c ký ®%îc röa b»ng gradient kaothia) chóng t«i ®( sö dông ph%¬ng ph¸p s¾c<br /> tuyÕn tÝnh cña c¸c dung dÞch sau: A l 0,1% ký láng cao ¸p ®Ó t¸ch c¸c ph©n ®o¹n chøa toxin<br /> TFA trong n%íc v B l 0,1% TFA trong 60% tr%c tiÕp tõ näc th« [6].<br /> axetonitril trong n%íc. Ch%¬ng tr×nh röa cét: 0 -<br /> 30% B trong 10 phót, 30% - 100% B trong 60 B»ng ph%¬ng ph¸p n y tõ näc th« chóng t«i<br /> phót, v 100% B trong 70 phót. L%îng näc mçi ®( t¸ch ®%îc 8 ph©n ®o¹n (xem h×nh 1). Kh¶o<br /> lÇn ®%a lªn cét kho¶ng 50 - 100 µg. Sù cã mÆt s¸t ®éc tÝnh cña c¸c ph©n ®o¹n t¸ch ra trªn<br /> cña protein trong c¸c ph©n ®o¹n s¾c ký ®%îc chuét cho thÊy cã 6 ph©n ®o¹n cã ®éc tÝnh.<br /> ph¸t hiÖn b»ng quang phæ tö ngo¹i t¹i b%íc sãng Trong sè c¸c ph©n ®o¹n ®éc th× c¸c ph©n ®o¹n<br /> 254 nm. 4, 5 v 7 chøa c¸c protein cã khèi l%îng ph©n tö<br /> n»m trong vïng 6-8 kDa t%¬ng ®%¬ng víi khèi<br /> C¸c ph©n ®o¹n ®%îc thu, ®«ng kh« v thö l%îng ph©n tö cña c¸c neurotoxin näc r¾n, ®Æc<br /> ®éc tÝnh lªn chuét C57BL/6 (18 - 20 g) b»ng biÖt ph©n ®o¹n 4 l ph©n ®o¹n ®éc nhÊt v cã<br /> c¸ch tiªm b¾p. L%îng protein trong mçi lÇn tiªm h m l%îng ®ñ ®Ó t¸ch c¸c neurotoxin tiÕp theo.<br /> v o chuét l 0,2 mg [7]. §éc tÝnh cña c¸c ph©n V× vËy, chóng t«i ®( sö dông ph©n ®o¹n 4 ®Ó<br /> ®o¹n tiªm v o chuét ®%îc quan s¸t trong 24 giê. tiÕp tôc ph©n t¸ch ra c¸c neurotoxin.<br /> <br /> <br /> <br /> 6<br /> 7<br /> <br /> <br /> <br /> 4 8<br /> <br /> 5<br /> <br /> <br /> 3<br /> 1 2<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> H×nh 1: S¾c ký láng cao ¸p näc r¾n hæ ®Êt N. kaouthia trªn cét C18 b¸n ®iÒu chÕ<br /> <br /> <br /> <br /> 22<br /> 2. T¸ch v& kh¶o s¸t c¸c neurotoxin tõ ph©n Qua kh¶o s¸t cho thÊy, c¸c ph©n ®o¹n ®éc<br /> ®o¹n 4 ®%îc röa ra khái cét trong thêi gian tõ 11 phót<br /> ®Õn 29 phót. Trong c¸c ph©n ®o¹n ®éc kÓ trªn<br /> §Ó t¸ch v l m s¹ch c¸c neurotoxin tõ ph©n th× ®éc nhÊt l ph©n ®o¹n 4.6, sau khi tiªm ph©n<br /> ®o¹n 4 chóng t«i ®( sö dông ph%¬ng ph¸p s¾c ®o¹n n y, chuét co giËt v chÕt sau 8 phót. §éc<br /> ký láng cao ¸p trªn cét ph©n tÝch Kromasil C18. tiÕp l ph©n ®o¹n 4.7, sau khi tiªm ph©n ®o¹n<br /> Chän ®iÒu kiÖn röa cét víi gradient cña c¸c n y, chuét liÖt v chÕt sau 12 phót (xem b¶ng).<br /> dung dÞch A v B nh% ®( tr×nh b y trong phÇn TiÕp theo l m s¾c ký l¹i c¸c ph©n ®o¹n n y ®Ó<br /> ph%¬ng ph¸p. Tõ ph©n ®o¹n 5 chóng t«i ®( t¸ch thu c¸c toxin s¹ch x¸c ®Þnh khèi l%îng ph©n tö<br /> ®%îc mét lo¹t ph©n ®o¹n protein thø cÊp kh¸c cña toxin 4.6 v 4.7 b»ng ph%¬ng ph¸p ®iÖn di<br /> nhau (h×nh 2). cã mÆt SDS v theo ph%¬ng ph¸p cña Osterman.<br /> Thö ®éc tÝnh cña c¸c ph©n ®o¹n thø cÊp t¸ch KÕt qu¶ cho thÊy toxin 4.6 cã khèi l%îng ph©n<br /> ra trªn chuét cho thÊy c¸c ph©n ®o¹n 4.3, 4.4, tö 6448 Da cßn toxin 4.7 cã khèi l%îng ph©n tö<br /> 4.5, 4.6 v 4.7 cã ®éc tÝnh. 6129 Da.<br /> <br /> B¶ng: Thö ®éc tÝnh lªn chuét cña c¸c ph©n ®o¹n thø cÊp t¸ch ra tõ ph©n ®o¹n 4<br /> Sè ph©n ®o¹n Quan s¸t trªn chuét sau khi tiªm c¸c ph©n ®o¹n t¸ch ra NhËn xÐt<br /> 4.3 Chuét liÖt, yÕu v chÕt sau 3 giê §éc g©y chÕt<br /> 4.4 Chuét liÖt, yÕu v chÕt sau 23 phót §éc g©y chÕt<br /> 4.5 Chuét liÖt v chÕt sau 15 phót §éc g©y chÕt<br /> 4.6 Chuét co giËt v chÕt sau 8 phót §éc g©y chÕt<br /> 4.7 Chuét liÖt, yÕu v chÕt sau 12 phót §éc g©y chÕt<br /> Näc th« Chuét co giËt v chÕt sau 8 phót §éc g©y chÕt<br /> N%íc cÊt Chuét b×nh th%êng Kh«ng ®éc<br /> mA U(x100) %<br /> 1.3 254nm,4nm (1.00)<br /> B.Conc.(Method)<br /> <br /> 1.2 4.4 95.0<br /> <br /> 90.0<br /> 1.1<br /> 85.0<br /> <br /> 1.0 80.0<br /> <br /> 75.0<br /> 0.9<br /> 70.0<br /> 0.8<br /> 65.0<br /> <br /> 0.7 4.6 60.0<br /> <br /> <br /> 0.6 55.0<br /> <br /> 50.0<br /> 0.5 4.7<br /> 45.0<br /> 0.4<br /> 40.0<br /> <br /> 0.3 35.0<br /> <br /> 30.0<br /> 0.2<br /> 25.0<br /> 4.5<br /> 0.1 4.3 20.0<br /> <br /> 0.0 15.0<br /> <br /> <br /> -0.1 10.0<br /> <br /> 5.0<br /> -0.2<br /> 0.0<br /> 0 10 20 30 40 50 60 70 min<br /> <br /> H×nh 2: S¾c ký láng cao ¸p ph©n ®o¹n 4 näc r¾n hæ ®Êt N. kaouthia trªn<br /> cét ph©n tÝch Kromasil C18<br /> <br /> 23<br />  Nh% vËy tõ ph©n ®o¹n 4, b»ng ph%¬ng ph¸p 2. Q. X. Meng, W. Y. Wang, Q. M. Lu, Y. Jin,<br /> s¾c ký láng cao ¸p trªn cét ph©n tÝch Kromasil J. F. Wei, S. W. Zhu, Y. L. Xiong..<br /> C18, ®( t¸ch ®%îc n¨m toxin (xem b¶ng), trong Comparative Biochemistry and Physiology<br /> ®ã ®( x¸c ®Þnh ®%îc khèi l%îng ph©n tö cña Part C, Vol. 132, P. 113 - 121 (2002).<br /> toxin 4.6 v 4.7 l c¸c toxin ®éc nhÊt cña ph©n 3. V. V. Kukhtina, C. Weise, T. A. Muranova,<br /> ®o¹n n y. V. G. Starkov, P. Franke, F. Hucho, S.<br /> Wnendt, C. Gillen, V. I. Tsetlin, Y. N.<br /> Iv – kÕt luËn Utkin. Eur. J. Biochem. Vol. 267, P. 6784 -<br /> 6789 (2000).<br /> 1. B»ng hai b%íc s¾c ký láng cao ¸p trªn:<br /> 4. D. Jerusalinsky, A. L. Harvey. Trends<br /> cét b¸n ®iÒu chÕ Supelcosil C18 v cét ph©n tÝch<br /> Pharmacol. Sci. Vol. 15, P. 424 - 430<br /> Kromasil C18 lÇn ®Çu tiªn ®( t¸ch v l m s¹ch<br /> (1994).<br /> n¨m toxin tõ näc r¾n hæ ®Êt ViÖt Nam (N.<br /> kaouthia). 5. K. W. Bradby. Pharmacology &<br /> Therapeutics, V. 85, P. 87 - 109 (2000).<br /> 2. Trong sè c¸c toxin t¸ch ra ®( x¸c ®Þnh<br /> khèi l%îng ph©n tö cña hai toxin. §ã l c¸c 6. NguyÔn Hång Thanh, NguyÔn Kim TÊn,<br /> toxin 4.6 v 4.7 víi khèi l%îng ph©n tö 6448 v Ho ng Ngäc Anh, Tr%¬ng Nam H¶i. Héi<br /> 6129 Da t%¬ng øng. C¸c toxin n y cã khèi nghÞ KH&CN Ho¸ h÷u c¬ to n quèc lÇn thø<br /> l%îng ph©n tö nhá h¬n víi c¸c toxin cña näc r¾n IV, Tr. 887 - 891 (2007).<br /> hæ ®Êt Th¸i Lan. 7. Ho ng Ngäc Anh, Bïi Thanh Xu©n, §Æng<br /> TrÇn Ho ng, Tr%¬ng Nam H¶i. T¹p chÝ Ho¸<br /> T i liÖu tham kh¶o häc, T. 44, sè 4, Tr. 449 - 453 (2006).<br /> 8. Osterman L.A. Methods of Protein and<br /> 1. M. J. Cox. Herpetological Review, Vol. 26, Nucleic Acid Research, Springer-Verlag,<br /> P. 156 - 157 (1995). Berlin and New York, Vol. 1 (1984).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 24<br />