Tách các neurotoxin từ nọc rắn hổ mang Việt Nam (naja naja)

T¹p chÝ Hãa häc, T. 44 (4), Tr. 449 - 453, 2006<br /> <br /> <br /> T¸ch c¸c neurotoxin tõ näc r¾n hæ mang ViÖt nam<br /> (naja naja)<br /> §Õn Tßa so¹n 8-9-2005<br /> Ho ng Ngäc Anh , Bïi Thanh Xu©n1, §Æng TrÇn Ho ng2, Tr ¬ng Nam H¶i2<br /> 1<br /> <br /> 1<br /> ViÖn Hãa häc, ViÖn Khoa häc v% C«ng nghÖ ViÖt Nam<br /> 2<br /> ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Khoa häc v% C«ng nghÖ ViÖt Nam<br /> <br /> <br /> Summary<br /> The results of our study show that the Vietnamese cobra (N. naja) venom contains two groups<br /> of neurotoxins with different molecular weights. Three neurotoxins were isolated from this venom<br /> using the combination of chromatography on a Sephacryl S-100 column and a reverse-phase<br /> HPLC column. The toxicity of isolated toxins was determined by injection it on the C57BL/6 mice.<br /> These isolated toxins have the masses of 5920.13 Da, 5798.26 Da, 6677.28 Da and are<br /> structurally related to short-chain neurotoxins from other elapids. These toxins are different from<br /> known Taiwan cobra toxins. In further these toxins will be studied for use in medicine.<br /> <br /> <br /> I - Më ®Çu c¸c -neurotoxin näc r¾n l kh«ng cã cÊu tróc<br /> xo¾n , trong khi ®ã sè l îng cÊu tróc chiÕm<br /> Cho ®Õn nay tõ näc nhiÒu lo i r¾n kh¸c nhau kho¶ng 40% v t¹o th nh ba vßng I, II, III t ¬ng<br /> ng êi ta ® t¸ch ra v x¸c ®Þnh tr×nh tù axit øng d¹ng ba ngãn tay [1, 4]. Nghiªn cøu -<br /> amine cña h¬n mét tr¨m -neurotoxin. Nh÷ng neurotoxin cho thÊy c¸c vßng I v II ®ãng vai<br /> toxin n y cã kh¶ n¨ng ng¨n chÆn sù dÉn truyÒn trß chÝnh trong liªn kÕt víi thô thÓ axetylcholin<br /> thÇn kinh b»ng c¸ch liªn kÕt ®Æc biÖt víi thô thÓ [5, 6].<br /> nicotinic axetylcholin trªn postsynaptic R¾n hæ mang (N. naja) phæ biÕn ë nhiÒu ®Þa<br /> membrane cña khung c¬ hay c¸c neuron [1]. ph ¬ng cña ViÖt Nam. Nh÷ng nghiªn cøu gÇn<br /> Dùa trªn tr×nh tù axit amin c¸c neurotoxin n y<br /> ®©y cho thÊy th nh phÇn c¸c -neurotoxin trong<br /> ® îc chia ra l m hai lo¹i ng¾n v d i. C¸c<br /> näc r¾n kh«ng nh÷ng chØ phô thuéc v o lo i,<br /> neurotoxin ng¾n chøa 57 - 64 gèc axit amin víi<br /> gièng r¾n m cßn phô thuéc v o ®iÒu kiÖn ®Þa<br /> bèn cÇu disulfit cßn c¸c neurotoxin d i chøa 66<br /> lý, nguån thøc ¨n. VÝ dô cïng mét lo i r¾n N.<br /> - 79 gèc axit amin víi n¨m cÇu disulfit [2].<br /> Nh÷ng toxin n y cã cÊu tróc kh«ng gian gièng naja ph©n bè ë ba vïng gÇn nhau cña Ên §é cã<br /> nhau (cÊu tróc d¹ng ba ngãn tay), mÆc dï cÊu th nh phÇn näc kh¸c nhau [7, 8]. ë ViÖt Nam<br /> tróc bËc mét cña chóng rÊt kh¸c nhau. C¸c tr íc ®©y ® cã nh÷ng nghiªn cøu vÒ th nh phÇn<br /> neurotoxin d i liªn kÕt m¹nh víi c¶ hai lo¹i thô toxin cña näc r¾n hæ mang nh ng do ®iÒu kiÖn<br /> thÓ nicotinic axetylcholin (AChR) cña khung c¬ kü thuËt ch a cho phÐp nªn nh÷ng nghiªn cøu<br /> v tÕ b o thÇn kinh, trong khi ®ã c¸c neurotoxin n y chØ dõng ë t¸ch näc r¾n qua gel sephadex<br /> ng¾n chØ t¸c dông m¹nh víi thô thÓ AChR cña G-75 v ®«ng kh« ph©n ®o¹n cã ®éc tÝnh [9]. V×<br /> khung c¬ [3]. vËy viÖc t¸ch, l m s¹ch v kh¶o s¸t c¸c -<br /> §Æc ®iÓm chung cÊu tróc kh«ng gian cña neurotoxin näc r¾n hæ mang ViÖt Nam l cÇn<br /> <br /> <br /> 449<br /> thiÕt. ® a v o cét mçi lÇn l 5 µg (ho trong 50 µl<br /> TiÕp theo c«ng tr×nh tr íc, trong b i b¸o n y dung dÞch A).<br /> chóng t«i tr×nh b y viÖc t¸ch, l m s¹ch v kh¶o C¸c -neurotoxin cña näc r¾n t¸c dông víi<br /> s¸t ®éc tÝnh cña mét sè ph©n ®o¹n tõ näc r¾n hæ kªnh Na+ nªn ®éc tÝnh cña nã dÔ x¸c ®Þnh b»ng<br /> mang ViÖt Nam. c¸ch tiªm chóng v o chuét. §éc tÝnh cña c¸c<br /> ph©n ®o¹n t¸ch ra ® îc thö trªn chuét b¹ch<br /> II - Nguyªn liÖu v ph ¬ng ph¸p C57BL/6 c¶ hai gièng (18-20 g) b»ng c¸ch tiªm<br /> nghiªn cøu b¾p, l îng protein tiªm v o chuét l kho¶ng 0,2<br /> mg [10] . Sö dông ba møc ®é ®Ó x¸c ®Þnh ®é ®éc<br /> 1. Nguyªn liÖu cña c¸c ph©n ®o¹n t¸ch ra. Ph©n ®o¹n kh«ng ®éc<br /> l sau khi tiªm c¸c ph©n ®o¹n n y chuét kh«ng<br /> Näc ® îc thu tõ r¾n N. naja nu«i ë vïng thÓ hiÖn dÊu hiÖu ®éc (gièng nh khi tiªm n íc<br /> VÜnh S¬n, VÜnh Phó. M¸y s¾c ký FPLC cña cÊt). Ph©n ®o¹n ®éc l sau khi tiªm, chuét thÓ<br /> h ng Amersham (Mü) v HPLC cña h ng hiÖn mét trong sè c¸c dÊu hiÖu sau: bÞ kÝch<br /> Shimazu (NhËt B¶n) ® îc sö dông ®Ó ph©n tÝch ®éng, ch¶y n íc miÕng, ng¹t thë, liÖt chi (nh ng<br /> näc r¾n. C¸c hãa chÊt dïng trong ph©n tÝch cña phôc håi trong 24 giê sau khi tiªm). Ph©n ®o¹n<br /> h ng Merck (§øc). ®éc g©y chÕt l ph©n ®o¹n l m chuét chÕt sau<br /> 2. Ph ¬ng ph¸p t¸ch c¸c neurotoxin tõ näc khi thÓ hiÖn mét hoÆc v i dÊu hiÖu ®éc kÓ trªn.<br /> r¾n N. naja Khèi l îng ph©n tö cña c¸c toxin ® îc x¸c<br /> C¸c ph©n ®o¹n chøa toxin ® îc t¸ch qua cét ®Þnh trªn m¸y Mass-spectrum QSTAR XL<br /> gel Sephacryl S-100 (2,6 × 60 cm) b»ng ®Öm MS/MS system (Applied Biosystem).<br /> ammoni axetat 0,1 M (pH 6,2), l îng näc th«<br /> ch¹y mçi lÇn 70 - 100 mg, tèc ®é röa cét 0,8 III - kÕt qu¶ v th¶o luËn<br /> ml/phót.<br /> 1. T¸ch c¸c ph©n ®o¹n chøa toxin tõ näc r¾n<br /> C¸c neurotoxin näc r¾n ® îc tinh s¹ch tõ hæ mang N. naja<br /> ph©n ®o¹n ®éc b»ng ph ¬ng ph¸p s¾c ký láng<br /> cao ¸p trªn m¸y cña h ng Shimazu víi cét ph©n Trªn c¬ së näc r¾n chøa hai lo¹i -<br /> tÝch RP-HPLC C18 (4,6 × 150 mm, 5 µm), tèc neurotoxin kh¸c nhau vÒ khèi l îng ph©n tö,<br /> ®é röa cét 1 ml/phót. Cét s¾c ký ® îc röa b»ng chóng t«i ® sö dông ph ¬ng ph¸p s¾c ký läc<br /> gradient tuyÕn tÝnh cña c¸c dung dÞch sau: A l qua gel ®Ó t¸ch c¸c nhãm toxin n y tõ näc th«.<br /> 0,1% TFA trong n íc v B l 0,1% TFA trong Trong b íc n y näc r¾n hæ mang N. naja t¸ch<br /> 60% axetonitril trong n íc. Ch ¬ng tr×nh röa ra l m b¶y ph©n ®o¹n s¬ cÊp (h×nh 1) cã khèi<br /> cét: 0-20% B trong 5 phót, 20 - 60% B trong 45 l îng ph©n tö v ®éc tÝnh kh¸c nhau. Thö ®éc<br /> phót v 60 - 100% B trong 80 phót. L îng chÊt tÝnh c¸c ph©n ®o¹n t¸ch ra trªn chuét cho thÊy<br /> Thutructiep011:1_UV Thutructiep011:1_Logbook<br /> <br /> mAU<br /> 4 56<br /> <br /> 254.0<br /> <br /> <br /> <br /> 7<br /> 252.0<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> H×nh 1: T¸ch c¸c ph©n ®o¹n 5<br /> 250.0<br /> v 6 tõ näc r¾n hæ mang N. naja<br /> 3 trªn cét víi gel Sephacryl S-100<br /> 2<br /> 248.0 1<br /> <br /> <br /> 0 50 100 150 200 250<br /> <br /> 450<br /> ®éc nhÊt l c¸c ph©n ®o¹n 5 v 6, cho kÕt luËn Thö ®éc tÝnh cña c¸c ph©n ®o¹n thø cÊp t¸ch<br /> ®ã l c¸c ph©n ®o¹n chøa c¸c neurotoxin. ra trªn chuét cho thÊy c¸c ph©n ®o¹n 5.6; 5.7;<br /> 5.8; 5.10 v 5.13 cã ®éc tÝnh.<br /> 2. T¸ch v& kh¶o s¸t c¸c neurotoxin tõ ph©n<br /> ®o¹n 5 Qua kh¶o s¸t cho thÊy, c¸c ph©n ®o¹n ®éc<br /> ® îc röa ra khái cét trong thêi gian tõ 34 phót<br /> § sö dông ph ¬ng ph¸p s¾c ký láng cao ¸p ®Õn 48 phót. Trong c¸c ph©n ®o¹n ®éc kÓ trªn<br /> ®¶o pha (RP-HPLC) trªn cét C18 ®Ó t¸ch v l m th× ®éc nhÊt l ph©n ®o¹n 5.6, chuét chÕt sau khi<br /> s¹ch c¸c neurotoxin cña ph©n ®o¹n 5 chóng t«i tiªm ph©n ®o¹n n y 3 giê (xem b¶ng 1). TiÕp<br /> ® dïng. Chän ®iÒu kiÖn röa cét víi gradient cña theo l m s¾c ký l¹i c¸c ph©n ®o¹n n y ®Ó thu<br /> c¸c dung dÞch A v B nh tr×nh b y trong phÇn c¸c toxin s¹ch, v trong c¸c toxin t¸ch ra ® x¸c<br /> ph ¬ng ph¸p, tõ ph©n ®o¹n 5 chóng t«i ® t¸ch ®Þnh khèi l îng ph©n tö cña toxin 5.6 trªn m¸y<br /> ® îc mét lo¹t ph©n ®o¹n protein thø cÊp kh¸c khèi phæ. KÕt qu¶ cho thÊy toxin 5.6 cã khèi<br /> nhau (h×nh 2). l îng ph©n tö 6677, 28 Da.<br /> mAU(x10)<br /> 254nm,4nm (1.00)<br /> 9.0<br /> <br /> <br /> <br /> 8.0<br /> <br /> <br /> <br /> 7.0<br /> <br /> <br /> <br /> 6.0<br /> 5.7<br /> 5.0<br /> <br /> <br /> <br /> 4.0<br /> 5.10<br /> 5.13<br /> 3.0<br /> <br /> <br /> <br /> 2.0 5.8<br /> <br /> 1.0 5.6<br /> <br /> 0.0<br /> <br /> <br /> <br /> -1.0<br /> <br /> <br /> 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 min<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> H×nh 2: S¾c ký láng cao ¸p ph©n ®o¹n 5 näc r¾n hæ mang ViÖt Nam N. naja trªn cét C18<br /> <br /> B¶ng 1: Thö ®éc tÝnh lªn chuét cña c¸c ph©n ®o¹n thø cÊp t¸ch ra tõ ph©n ®o¹n 5<br /> Sè ph©n Quan s¸t trªn chuét sau khi tiªm c¸c ph©n ®o¹n<br /> NhËn xÐt<br /> ®o¹n t¸ch ra<br /> 5.6 Chuét run, co giËt v chÕt sau 3 giê §éc g©y chÕt<br /> 5.7 Chuét run, co giËt v phôc håi sau 2 giê §éc m¹nh<br /> 5.8 Chuét run, co giËt v phôc håi sau 1 giê §éc kh¸ m¹nh<br /> 5.10 Chuét co giËt v phôc håi sau 30 phót §éc nhÑ<br /> 5.13 Chuét run v phôc håi sau 1 giê §éc kh¸ m¹nh<br /> <br /> Nh vËy tõ ph©n ®o¹n 5, b»ng ph ¬ng ph¸p § sö dông ph ¬ng ph¸p s¾c ký láng cao ¸p<br /> s¾c ký láng cao ¸p trªn cét C18, ® t¸ch ® îc ®¶o pha trªn cét C18 ®Ó t¸ch v l m s¹ch c¸c<br /> n¨m toxin (xem b¶ng 1), trong ®ã ® x¸c ®Þnh neurotoxin cña ph©n ®o¹n 6. B»ng ph ¬ng ph¸p<br /> ® îc khèi l îng ph©n tö cña toxin 5.6 l toxin n y tõ ph©n ®o¹n 6 ® t¸ch ra c¸c ph©n ®o¹n<br /> ®éc nhÊt cña ph©n ®o¹n n y. protein thø cÊp (h×nh 3).<br /> 3. T¸ch v& kh¶o s¸t c¸c neurotoxin tõ ph©n Thö ®éc tÝnh cña c¸c ph©n ®o¹n thø cÊp t¸ch<br /> ®o¹n 6 ra tõ ph©n ®o¹n 6 trªn chuét cho thÊy c¸c ph©n<br /> <br /> 451<br /> ®o¹n: 6.8; 6.9; 6.10; 6.11; 6.12; 6.13; 6.14 v trong vßng 30 phót ®Õn 1 giê sau khi tiªm (xem<br /> 6.15 cã ®éc tÝnh, trong ®ã c¸c ph©n ®o¹n 6.9; b¶ng 2). C¸c toxin ® îc röa ra khái cét trong<br /> 6.10; 6.11; 6.13 v 6.15 l ®éc nhÊt, chuét chÕt kho¶ng tõ 27 - 33 phót.<br /> mAU(x1,000)<br /> 0.030 254nm,4nm (1.00)<br /> <br /> <br /> 0.028<br /> <br /> <br /> 0.025<br /> <br /> <br /> 0.022<br /> <br /> 6.11<br /> 0.020<br /> <br /> <br /> 0.018<br /> <br /> <br /> 0.015<br /> <br /> <br /> 0.013 6.10<br /> 0.010<br /> 6.12<br /> 0.007<br /> 6.13<br /> 0.005<br /> 6.9 6.14<br /> 0.003 6.8 6.15<br /> <br /> 0.000<br /> <br /> <br /> -0.003<br /> <br /> <br /> <br /> 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 min<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> H×nh 3: S¾c ký láng cao ¸p ph©n ®o¹n 6 näc r¾n hæ mang ViÖt Nam N. naja trªn cét C18<br /> <br /> B¶ng 2: Thö ®éc tÝnh lªn chuét cña c¸c ph©n ®o¹n thø cÊp t¸ch ra tõ ph©n ®o¹n 6<br /> Sè ph©n Quan s¸t trªn chuét sau khi tiªm c¸c ph©n ®o¹n<br /> NhËn xÐt<br /> ®o¹n t¸ch ra<br /> 6.8 Chuét run v phôc håi sau 1 giê §éc m¹nh<br /> 6.9 Chuét run, yÕu v chÕt sau 30 phót §éc g©y chÕt<br /> 6.10 Chuét run, yÕu v chÕt sau 30 phót §éc g©y chÕt<br /> 6.11 Chuét run, yÕu v chÕt sau 30 phót §éc g©y chÕt<br /> 6.12 Chuét run v phôc håi sau 30 phót §éc nhÑ<br /> 6.13 Chuét run v chÕt sau 40 phót §éc g©y chÕt<br /> 6.14 Chuét d ng l«ng v phôc håi sau 1 giê §éc m¹nh<br /> 6.15 Chuét run m¹nh v chÕt sau 60 phót §éc g©y chÕt<br /> <br /> TiÕp theo l m s¾c ký l¹i c¸c ph©n ®o¹n n y qua gel v s¾c ký láng cao ¸p tõ näc r¾n hæ<br /> ®Ó thu c¸c toxin s¹ch. Trong sè c¸c toxin n y ® mang ViÖt Nam ® t¸ch ® îc hai nhãm toxin<br /> x¸c ®Þnh ® îc khèi l îng ph©n tö cña toxin 6.10 kh¸c nhau vÒ khèi l îng ph©n tö. Trong c¸c<br /> v 6.15 l 5920,13 Da v 5798,26 Da. Theo khèi toxin ®ã ® x¸c ®Þnh khèi l îng ph©n tö cña ba<br /> l îng ph©n tö th× ®©y l c¸c toxin ng¾n cña näc toxin thuéc hai nhãm kh¸c nhau. So s¸nh khèi<br /> r¾n. Nh÷ng nghiªn cøu s¬ bé cho thÊy ph©n l îng ph©n tö cña c¸c toxin n y víi c¸c toxin<br /> ®o¹n 6 chøa nhiÒu lo¹i toxin h¬n v c¸c toxin näc r¾n hæ mang § i Loan N. naja atra<br /> n y ®éc h¬n c¸c toxin t¸ch ra tõ ph©n ®o¹n 5. So (cardiotoxin: 6747,29 Da v cobrotoxin:<br /> s¸nh khèi l îng ph©n tö cña c¸c toxin t¸ch ra tõ 6956,64 Da) cho thÊy chóng cã khèi l îng ph©n<br /> ph©n ®o¹n 5 víi c¸c toxin t¸ch ra tõ ph©n ®o¹n 6 tö nhá h¬n khèi l îng ph©n tö cña c¸c toxin näc<br /> cho thÊy c¸c toxin cña ph©n ®o¹n 6 cã khèi r¾n hæ mang § i Loan.<br /> l îng ph©n tö thÊp h¬n c¸c toxin cña ph©n ®o¹n Trong nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo chóng t«i<br /> 5 theo s¾c ký läc qua gel v theo khèi phæ. sÏ tiÕn h nh x¸c ®Þnh cÊu tróc c¸c toxin n y v<br /> Nh vËy kÕt hîp ph ¬ng ph¸p s¾c ký läc t×m kiÕm h íng øng dông chóng trong thùc tÕ.<br /> 452<br />  iv - kÕt luËn Chem. Vol. 274, P. 34851 - 34858 (1999).<br /> 4. Menez A. Toxicon, Vol. 36, P. 1557 - 1572<br /> 1. KÕt hîp s¾c ký läc qua gel trªn cét (1998).<br /> Sephacryl S-100 v s¾c ký láng cao ¸p ®¶o pha 5. H. J. Kreienkamp, Yu. N. Utkin, C. Weise,<br /> trªn cét C18 lÇn ®Çu tiªn ® t¸ch v l m s¹ch hai J. Machold, V. I. Tsetlin, F. Hucho.<br /> nhãm neurotoxin tõ näc r¾n hæ mang ViÖt Nam. Biochem., Vol. 31, P. 8239 - 8244 (1992).<br /> 2. Tõ hai ph©n ®o¹n ®éc trªn ® t¸ch, l m 6. O. Tremeau, C. Lemaire, P. Drevet, S.<br /> s¹ch v x¸c ®Þnh khèi l îng ph©n tö cña 3 Pinkasfeld, F. Ducancel, J. C. Boulain, A.<br /> neurotoxin. §ã l c¸c toxin 5.6, 6.10 v 6.15 víi Menez. J. Biol. Chem., Vol. 270, P. 9362 -<br /> khèi l îng ph©n tö 6677,28 Da, 5920,13 Da v 9369 (1995).<br /> 5798,26 Da t ¬ng øng. C¸c toxin n y cã khèi 7. A. K. Mukherjee, C. R. Maity. Comp.<br /> l îng ph©n tö kh«ng gièng víi c¸c toxin cña Biochem. Physiol B Biochem. Mol. Biol.,<br /> näc r¾n hæ mang § i Loan. Vol. 131, P. 125 - 132 (2002).<br /> 8. A. K. Mukherjee, C. R. Maity. Comp<br /> T i liÖu tham kh¶o Biochem Physiol A Mol. Integr. Physiol, V.<br /> 119, P. 621 - 627 (1998).<br /> 1. V. Tsetlin. Eur. J. Biochem., V. 264, P. 281<br /> 9. Lª V¨n TruyÒn, NguyÔn Danh MËu,<br /> - 286 (1999).<br /> NguyÔn §øc B«n. T¹p chÝ D îc häc, sè 2,<br /> 2. N. Gong, A. Armugan, P. Mirtschin, K. Tr. 22 - 25 (1979).<br /> Yeaseelan. Biochem. J., V. 358, P. 647 -<br /> 10. Ho ng Ngäc Anh, V. B. Piskarev, B. B.<br /> 656 (2001).<br /> Berezin, I. A. Yamskov. T¹p chÝ Sinh häc,<br /> 3. S. Antil, D. Servent, A. Menez. J. Biol. T. 24, Tr. 43 - 46 (2002).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 453<br />