Tách dòng Gen LTP (Lipid transfer protein) của cây đậu xanh

52(4): 94 - 98<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 4 - 2009<br /> <br /> TÁCH DÒNG GEN LTP (Lipid transfer protein) CỦA CÂY ĐẬU XANH<br /> (Vigna radiata L. Wilczek)<br /> Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên),<br /> Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trần Thúy Liên, Nguyễn Thị Mai Lan<br /> (Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên)<br /> <br /> I. Mở đầu<br /> Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilcrek) là cây<br /> trồng cạn có vai trò quan trọng bởi hạt đậu xanh là<br /> thực phẩm giàu protein và trồng đậu xanh có tác<br /> dụng cải tạo đất. Với các điều kiện khí hậu khắc<br /> nghiệt như hạn hán, nóng nắng kéo dài làm cho<br /> cây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng suy<br /> giảm khả năng sinh trưởng, phát triển và có thể<br /> cây bị chết, dẫn đến giảm năng suất, chất lượng<br /> hạt đậu xanh. Chính vì vậy, vấn đề tìm kiếm các<br /> chỉ thị phân tử của tính chống hạn và nghiên cứu<br /> ứng dụng công nghệ gen nhằm tạo cây chuyển gen<br /> chịu hạn là rất cần thiết.<br /> Các nghiên cứu đều cho rằng khi cây gặp hạn<br /> có hiện tượng tăng lên về hàm lượng ABA, hàm<br /> lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axit<br /> hữu cơ,... giảm phức hợp CO2, protein và các axit<br /> nucleic [1], [2]. Sự tổng hợp và tích luỹ các chất<br /> trên diễn ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước, với<br /> hai chức năng là (i) sự điều chỉnh áp suất thẩm<br /> thấu nhờ khả năng giữ nước và lấy nước vào tế<br /> bào và (ii) ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na + của<br /> các chất đó. Chúng có thể thay thế vị trí nước nơi<br /> xảy ra các phản ứng hóa sinh, tương tác với lipid<br /> hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy<br /> màng và các phức protein trong màng. Như vậy khả<br /> năng giữ nước của tế bào liên quan đến sự tăng áp<br /> suất thẩm thấu và độ bền vững của màng tế bào.<br /> LTP (Lipid transfer proteins) thuộc họ gen<br /> pathogenesis - relate, có khả năng tổng hợp protein<br /> thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid tới<br /> màng. LTP còn hỗ trợ việc tạo ra lớp sáp hoặc lớp<br /> biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng<br /> lại những thay đổi của môi trường [5], [10].<br /> Nghiên cứu gần đây cho thấy sự mở rộng in vitro<br /> các hợp tử cellulose xyloglucan của thành tế bào<br /> thực vật có thể được gây ra do các LTP; Mặc dù<br /> chưa có bằng chứng in vivo song khám phá này<br /> chắc chắn sẽ đem lại các câu hỏi thú vị về cơ chế<br /> mở rộng thành tế bào thực vật [7].<br /> Những phân tử protein do gen LTP tổng hợp<br /> thường có nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng<br /> <br /> điện cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa, và<br /> với sự có mặt của 8 phân tử cysteine làm nhiệm vụ<br /> tạo ra 4 cầu nối disulfide [11]. Khi gặp những điều<br /> kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như<br /> hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường<br /> truyền tín hiệu … sẽ điều khiển gen LTP hoạt<br /> động và tăng tổng hợp nên các sản phẩm protein<br /> tăng cường vận chuyển phospholipid tới màng,<br /> tăng khả năng giữ nước của màng tế bào nhằm<br /> giúp cho cây tăng khả năng chống stress hạn.<br /> Trong những năm gần đây, đã có một số công<br /> trình nghiên cứu về gen LTP ở các đối tượng thực<br /> vật, như Solanales lycopersicum L. [11], Zea mays<br /> L. [8], Papper [4], Triticum L. [6], Daucus carota<br /> L. [9], và Oryza satyva L. [12]. Trong bài báo này,<br /> chúng tôi công bố kết quả tách dòng gen LTP<br /> khuếch đại từ ADN hệ gen của một số giống đậu<br /> xanh có khả năng chịu hạn khác nhau.<br /> II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> Vật liệu nghiên cứu<br /> Bảy giống đậu xanh do Trung tâm Nghiên cứu<br /> và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực và<br /> Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt<br /> Nam cung cấp được sử dụng làm vật liệu nghiên<br /> cứu (Bảng 1).<br /> Bảng 1. Một số đặc điểm hình thái của 7 giống đậu<br /> xanh nghiên cứu<br /> Màu<br /> vỏ hạt<br /> <br /> Khối lượng<br /> 1000 hạt (g)<br /> <br /> DX208<br /> Đỗ Quế<br /> DX14<br /> <br /> Màu<br /> thân<br /> mầm<br /> Xanh<br /> Xanh<br /> Xanh<br /> <br /> Xanh bóng<br /> Xanh mốc<br /> Xanh mốc<br /> <br /> 75,30±0,015<br /> 44,20±0,025<br /> 65,86±0,040<br /> <br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> <br /> DX04<br /> V123<br /> T135<br /> <br /> Xanh<br /> Xanh<br /> Xanh<br /> <br /> Xanh bóng<br /> Xanh bóng<br /> Xanh mốc<br /> <br /> 66,31±0,015<br /> 63,95±0,020<br /> 50,54±0,032<br /> <br /> 7<br /> <br /> PAEC3<br /> <br /> Tím<br /> <br /> Vàng bóng<br /> <br /> 60,75±0,010<br /> <br /> S<br /> TT<br /> <br /> Tên<br /> giống<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 52(4): 94 - 98<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Cặp mồi nhân gen LTP được chúng tôi thiết kế<br /> và đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen có trình tự<br /> trình bày ở bảng 2.<br /> Bảng 2. Trình từ cặp mồi nhân gen LTP<br /> <br /> Mồi<br /> LTPF<br /> <br /> Trình tự mồi (5’-3’)<br /> ATGGCTAGCCTGAAGGTTGC<br /> <br /> LTPR<br /> <br /> TTACTTGATGTTAGCGCAGTT<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> - ADN tổng số được tách chiết theo phương<br /> pháp Gawel và Jarnet (1991) [3].<br /> - Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm<br /> PCR nhân gen LTP được kiểm tra bằng điện di<br /> trên gel agarose 1% trong TAE 1X.<br /> - Sản phẩm PCR của gen LTP được kiểm tra<br /> bằng điện di trên gel agarose 1%. Gen được làm<br /> sạch bằng bộ Kit của hãng Bioneer và gắn trực tiếp<br /> vào vector pBT, sau đó được biến nạp vào tế bào<br /> khả biến E. coli chủng DH5. Tách plasmid mang<br /> gen LTP phục vụ cho đọc trình tự gen bằng bộ Kit<br /> AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer.<br /> <br /> Để nhân được đoạn gen này, chúng tôi đã tiến<br /> hành tách chiết DNA tổng số. Tối ưu nhiệt độ và<br /> thành phần của phản ứng PCR (Bảng 3). Nhiệt độ<br /> gắn mồi thích hợp nhất cho nhân gen LTP là 560C.<br /> Bảng 3. Thành phần của phản ứng PCR nhân gen LTP<br /> <br /> Do chưa có trình tự nucleotide của gen LTP<br /> phân lập từ DNA tổng số nên chúng tôi dựa vào<br /> cơ sở dữ liệu khai thác từ ngân hàng gen quốc tế<br /> (NCBI) với mã số AY300807 để thiết kế cặp<br /> mồi đặc hiệu cho việc nhân và phát hiện sự có<br /> mặt của gen LTP ở các giống đậu xanh phục vụ<br /> cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống đậu<br /> xanh có khả năng chống chịu với điều kiện bất<br /> lợi của môi trường.<br /> <br /> Thành phần<br /> <br /> STT<br /> <br /> Thể tích (µl)<br /> <br /> 1<br /> <br /> H2O khử ion<br /> <br /> 12,5<br /> <br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> <br /> Buffer PCR (10X)<br /> Mg+2 (25 mM)<br /> dNTP (25 mM)<br /> Mồi xuôi (10 pMol)<br /> Mồi ngược (10 pMol)<br /> Taq polymerase (5 U/l)<br /> DNA mẫu (50 ng)<br /> Tổng<br /> <br /> 2,5<br /> 2,5<br /> 2,0<br /> 2,0<br /> 2,0<br /> 0,5<br /> 1,0<br /> 25,0<br /> <br /> Đoạn gen LTP của 7 giống đậu xanh được nhân<br /> từ DNA tổng số bằng phương pháp PCR. Sản phẩm<br /> PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose<br /> (Hình 1). Hình 1 cho thấy, mỗi giống nhận được<br /> một đoạn DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 350<br /> bp, hàm lượng của sản phẩm đủ lớn để thực hiện<br /> cho các nghiên cứu tiếp theo.<br /> M<br /> <br /> III. Kết quả và thảo luận<br /> 1. Kết quả nhân gen LTP từ các giống đậu xanh<br /> Các giống đậu xanh trên đã được đánh giá khả<br /> năng chịu hạn kết quả cho thấy chỉ số chịu hạn<br /> tương đối giảm dần ở các giống như sau: DX208 ><br /> DX04 > T135> V123 > DX14 > Đỗ Quế > PaEC3.<br /> Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở trên,<br /> chúng tôi tiếp tục nhân gen để kiểm tra sự có mặt<br /> của gen LTP ở các giống đậu xanh này và đọc<br /> trình tự cũng như so sánh để tìm chỉ thị phân tử<br /> gen LTP cho đăc tính chịu hạn của cây đậu xanh.<br /> <br /> 4 - 2009<br /> <br /> 250 bp<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 350bp<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh điện di kết qủa nhân gen LTP của 7<br /> giống đậu xanh Ký hiệu: M. Marker 1kb<br /> 1.DX208; 2. Đỗ Quế; 3. DX14; 4. DX04; 5. V123; 6.<br /> T135; 7. PAEC3<br /> <br /> Từ kết quả nhân gen ở trên chúng tôi lựa chọn<br /> 2 giống đậu xanh có chỉ số chịu hạn cao (DX208<br /> và DX04) và hai giống đậu xanh có chỉ số chịu<br /> hạn thấp nhất (Đỗ Quế và PaEC3) để tiếp tục tách<br /> dòng gen.<br /> <br /> 95<br /> <br /> 52(4): 94 - 98<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 2. Kết quả tách dòng gen LTP<br /> Quá trình tách dòng được thực hiện theo các<br /> bước: (1) Gắn sản phẩm PCR sau khi được tinh<br /> sạch vào vector tách dòng pBT (Hình 2); (2) Biến<br /> nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.<br /> Sau khi biến nạp chủng E. coli DH5α được cấy<br /> trải trên môi trường LB đặc (pepton, cao nấm<br /> men, NaCl và agar) có kháng sinh ampixilin<br /> (100mg/ml), IPTG (0,1 mM) và X - gal<br /> <br /> 4 - 2009<br /> <br /> (40mg/ml), ủ hộp lồng petri ở 370C trong 16 h. Kết<br /> quả thu được có cả khuẩn lạc màu xanh và màu<br /> trắng (Hình 3). Chọn khuẩn lạc có màu trắng<br /> chuyển sang nuôi ở môi trường có LB lỏng (có bổ<br /> sung ampixilin 100mg/ml) qua đêm. Lấy dịch nuôi<br /> chứa vi khuẩn đem kiểm tra sản phảm chọn dòng<br /> bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi pUC18, để xác<br /> định khuẩn lạc chứa mang gen mong muốn.<br /> <br /> Hình 2. Cấu trúc của vector tách dòng pBT<br /> <br /> 96<br /> <br /> 52(4): 3 - 12<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 4 - 2009<br /> <br /> Hình 3. Hình ảnh khuẩn lạc mang gen LTP<br /> <br /> Sản phẩm colony - PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm<br /> gel trong ethidium bromit 1 % và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím (Hình 4).<br /> Mồi pUC được thiết kế chung cho các vector tách dòng, nên khi kiểm tra sản phẩm PCR vừa<br /> <br /> Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm colony - PCR<br /> M. Marker 1 Kb<br /> <br /> dòng hóa thì kích thước của đoạn gen sẽ cao hơn 124 bp.<br /> Điều này có nghĩa là kích thước của đoạn gen vừa nhân khoảng 474 bp. Kết quả điện di ở hình 4<br /> cho thấy, sản phẩm colony - PCR từ những khuẩn lạc màu trắng đều cho kết quả dương tính với cả 4<br /> băng và đều đúng kích thước dự đoán. Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, chúng tôi tiếp tục ti ến<br /> hành tách plasmid. Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 0,8 % trong<br /> đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromit 1 % và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím (Hình<br /> 5). Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lượng và số lượng phục vụ<br /> cho việc xác định trình tự nucleotit.<br /> <br /> Hình 5. Kết quả điện di tách plasmid mang gen LTP<br /> <br /> IV. Kết luận<br /> <br /> 4<br /> <br /> 52(4): 3 - 12<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 4 - 2009<br /> <br /> - Đã thiết kế được cặp mồi đặc hiệu nhân gen LTP, tối ưu hóa thành phần của phản ứng PCR và nhiệt độ<br /> gắn mồi nhân đoạn gen LTP.<br /> - Đã khuếch đại thành công gen LTP bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên cơ sở<br /> dữ liệu khai thác tại Ngân hàng gen Quốc tế. Sản phẩm PCR được dòng hoá nhờ vector pBT.<br /> - Chọn được dòng vi khuẩn E. coli DH5α chứa vector tái tổ hợp và tách được plasmid mang đoạn gen<br /> LTP phục vụ việc xác định trình tự nucleotit.<br /> Tài liệu tham khảo<br /> [1]. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại<br /> học Quốc gia, Hà Nội.<br /> [2]. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), “Mối tương<br /> quan giữa hàm lượng proline và tính chống chịu ở cây lúa”, Tạp chí Công nghệ sinh học 1(1), tr. 85-95<br /> [3].<br /> Gawel<br /> T.J,<br /> Jarret<br /> R.L.<br /> (1991),<br /> Geneomic<br /> DNA<br /> isolation,<br /> http://www.weihenstephan.de/pbpz/bambra/html/dna.htmn.<br /> [4]. Jung H.W., Hwang B.K. (2000), Isolation partial sequencing, and expression of pathogensis-related cDNA<br /> genes from pepper leaves infected by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Molecular Plant-Microbe<br /> Interactions 13, pp. 136-214.<br /> [5].Kader J.C. (1996), Lipid trans protein in plants, Annual Review of Plant Molercular Biology 47, pp. 627-654.<br /> [6]. Monia A., Garcia O.F. (1993), Developmetal and pathogen induced expression of three barley genes encoding<br /> lipid transfer protein, The Plant Journal, 4: 983-991.<br /> [7]. Nieuwland J., Feron R., Huisman BA., Fasolino A., Hilbers CW., Derksen J., Mariani C. (2005), Lipid transfer<br /> proteins enhance cell wall extension in tobacco. Plant Cell. ;17(7):2009-2019.<br /> [8] Sossountzov L., Ruiz A.L., Vignols F., Jolliot A., Aroundel V., Tchang F., Grosbois M., Guerbette F., Miginiac<br /> E., Delseny M. (1991), Spatial and temporal expression of a maize lipid transfer protein gene. The Plant Cell, 3, pp.<br /> 923-933.<br /> [9]. Sterk P., Booij H., Schellekens G.A., Van Kammen A, De Vries S.C. (1991), Cell-speciffic expession of the<br /> carrot EP2 lipid transfer protein gene, The Plant Cell , 3: 907-921.<br /> [10]. Tassin S., Broekaert W.F., Marion D., Acland D.P., Ptak M., Vovelle F., Sonado P. (1998), Solution structure<br /> of Ace AMP1, a potent anti-microbial protein extraction from onion seeds. Structural analogies with plant<br /> nonspeciffic lipid transfer protein, Biochemistry, 37, pp. 3623-3637.<br /> [11]. Terres Schumann S., Godoy J.A., Pintor-Toro J.A. (1992), A probable lipid transfer protein is induced by NaCl<br /> in stems of tomato plants, Plant Molecular Biology, 105, pp.749-757.<br /> [12]. Vignols F., Lund G., Pammi S., Tremousaygue D., Grellet F., Kader J.C., Puigdomenech P., Delseny M.<br /> (1994), Characterizarion of a rice gene coding for a lipid transfer protein, Gene, 142, pp. 420-426.<br /> <br /> 5<br /> <br />