Tách và xác định thành phần các polysaccharide tan trong nước từ rong nâu Sargassum crassifolium ở vịnh Nha Trang

Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một  Số 3(38)­2018<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CÁC POLYSACCHARIDE <br /> TAN TRONG NƯỚC TỪ RONG NÂU SARGASSUM CRASSIFOLIUM <br /> Ở VỊNH NHA TRANG<br /> Bùi Văn Nguyên(1), Lê Công Hoan(1), Phạm Đức Thịnh(2), Trần Thị Thanh Vân(2)<br /> (1) Trường Đại học Khánh Hòa, (2) Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang<br /> Ngày nhận bài 15/06/2018; Ngày gửi phản biện 20/06/2018; Chấp nhận đăng 08/07/2018<br /> Email: buivannguyen@ukh.edu.vn<br /> <br /> <br /> Tóm tắt<br /> Bài báo này trình bày kết quả  nghiên cứu về  thành phần polysaccharide từ  rong nâu  <br /> Sargassum crassifolium thu thập ở Vịnh Nha Trang. Kết quả cho thấy hàm lượng alginate lớn  <br /> nhất chiếm 25%, fucoidan 1,4% và laminaran  0,09%. Bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion  <br /> fucoidan thô được tách thành 3 phân đoạn trên cột sắc ký DEAE­cellulose. Kết quả phân tích  <br /> thành phần monosaccharide cho thấy trong fucoidan thành phần chủ yếu là fucose và galactose.  <br /> Từ khóa: rong nâu, tan trong nước, thành phần, Vịnh Nha Trang<br /> Abstract<br /> ISOLATION AND CHEMICAL COMPOSITION OF WATER­SOLUBLE <br /> POLYSACCHARIDES FROM BROWN SEAWEED SARGASSUM <br /> CRASSIFOLIUM IN NHA TRANG BAY<br /> Water­soluble   polysaccharides   such   as   fucoidans,   alginates   and   laminarans   were  <br /> isolated from brown seaweed Sargassum crassifolium. The yield of polysaccharides studied  <br /> seaweeds was alginate 25%, laminaran 0.09% and fucoidan 1.4%. Three fractions of sulfate  <br /> polysaccharide   (fucoidan)   extracted   from   the   brown   alga   Sargassum   crassifolium   were  <br /> fractionated   by  using  anion   –  exchange  chromatography  on  DEAE­cenlulose   column.  All  <br /> fucoidans were sulfated polysaccharides. The main components of fucoidans were fucose and  <br /> galactose along with small amounts of xylose, mannose, rhamnose and glucose. <br /> <br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Trong đa dạng vô tận của thảm thực vật đại dương, rong Nâu là một trong số  các  <br /> loài thực vật biển có thể  tự  tái tạo đáng được lưu ý nhất mà loài người đã phát hiện ra.  <br /> Rong Nâu chứa rất nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao.  <br /> Đó là các đường (galactose, mannose, xylose); axit amin; axit béo nhiều nối đôi; chất khoáng <br /> dưới dạng keo; các vitamin cần thiết cho cơ  thể sống; các polyphenol có hoạt tính chống <br /> oxi hóa mạnh bảo vệ  cơ  thể  loại trừ  các gốc tự  do nguy hại; fucoidan có khả  năng kích <br /> thích hệ miễn dịch, chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư đồng thời làm tăng chỉ số chức  <br /> <br /> 93<br /> Bùi Văn Nguyên...  Tách và xác định thành phần các polysaccharide tan trong nước...<br /> <br /> năng gan; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu; alginat là chất giải độc thiên nhiên  <br /> và laminaran là chất chống đông cục máu và ung thư  [3, 4, 5, 11]. Fucoidan là một sulfate  <br /> polysaccharide có cấu trúc hóa học phức tạp. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại  <br /> đường, chủ  yếu là fucose và một số  các loại khác như  galactose, glucose, manose..., ngoài <br /> ra còn có axít uronic. Fucoidan được biết đến là một chất có nhiều hoạt tính sinh học quí <br /> báu như hoạt tính chống u, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chông đông tu mau và<br /> ́ ̣ ́  <br /> kháng virus như HIV. Ngoài ra fucoidan con đ<br /> ̀ ược mô ta co nhiêu tac dung sinh hoc khac nh<br /> ̉ ́ ̀ ́ ̣ ̣ ́ ư <br /> ́ ̣ ̣ ̉<br /> tac dung ha cholesterol, giam m ỡ mau... Do có các tính ch<br /> ́ ất quí báu như  vậy nên fucoidan  <br /> thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới [3, 4, 5, 11]. <br /> Nước ta có hơn 3600 km bờ biển với nguồn tài nguyên rong biển rất phong phú, rong <br /> nâu là nguồn lợi rong biển tự  nhiên lớn nhất , trong đó chi rong có trữ  lượng lớn nhất   là <br /> sargassum[8]. Các nghiên cứu về  polysaccharide từ chi sargassum mới được nghiên cứu rất <br /> ít. Đặc biệt là rong nâu sargassum crassifolium lần đầu tiên được chúng tôi tiếp cận nghiên  <br /> cứu.   Kết  quả   nghiên  cứu  thành  phần  polysaccharide   tách   chiết   từ   rong   nâu  sargassum  <br /> crassifolium thu thập  ở  Vịnh Nha Trang giúp định hướng nghiên cứu công nghệ  cũng như <br /> nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và hoạt tính, cho biết hàm lượng dinh dưỡng và sử dung lam ̣ ̀  <br /> dược liêu hoăc th<br /> ̣ ̣ ực phâm ch<br /> ̉ ưc năng. T<br /> ́ ừ đo lam nên tang c<br /> ́ ̀ ̀ ̉ ơ  sở  cho sự  phát triển và sử  <br /> dụng nguôn tài nguyên rong nâu môt cach hiêu qua <br /> ̀ ̣ ́ ̣ ̉ ở Khánh Hòa. <br /> 2. THỰC NGHIỆM<br /> Mẫu rong: Rong  được thu thập tại Vịnh Nha Trang vào tháng 6/2017 và định danh  <br /> bởi TS. Lê Như Hậu (Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang). Mẫu rong sau  <br /> khi thu thập được rửa sạch tạp chất (rác, cát, mùn,...) bằng nước ngọt, đem phơi khô  ở <br /> nhiệt độ thường trong không khí và được cắt nhỏ.<br /> Hóa   chất   và   thiết   bị:  Hóa   chất:  rượu  etylic   (C2H5OH),   axeton   (CH3COCH3),   axít <br /> clohyđric (HCl), nước cất (H2O), natri hiđrocacbonat (NaHCO3), natri cacbonat (Na2CO3), <br /> nhựa   DEAE­cellulose,   natri   clorua   (NaCl),   trifloaxetic  TFA  (CF 3COOH),   amoniac  (NH3), <br /> natrihiđroxit (NaOH), các hóa chất chuẩn bao gồm: fucose, galactose, mannose, rhamnose,  <br /> glucose và xylose tất cả của hãnh Sigma (Mỹ). Thiết bị:  Máy phân tích cacbonhyđrat (ICS <br /> 3000 của hãng Dionex Mỹ), máy cô quay chân không, máy ly tâm, máy đông khô, máy phân <br /> tích UV­VIS, máy đo pH.  <br /> Tách fucoidan:  Rong khô xử  lý với cồn và axeton để  loại các hợp chất béo, chất  <br /> màu,... Mẫu rong thu được sử  dụng để  chiết polysaccharide.   Lấy 500 gam rong khô đem <br /> chiết bằng dung dịch HCl 0,02M (pH = 2­3) (t ỉ l ệ rong khô : dịch chiết = 1:10) ở nhiệt độ <br /> 60oC trong thời gian 2 giờ, lọc tách bã rong qua  một lớp vải lọc mịn và đem chiết lại  hai <br /> lần với điều kiện tương tự. Dịch chiết chứa các polysaccharide tan trong nước của 3 lần  <br /> chiết được gộp lại và được trung hòa bằng dung dịch NaHCO 3  8% đến pH = 6­7. Dịch  <br /> chiết được cô quay chân không ở nhiệt độ 50oC đến còn 1/5 thể tích ban đầu. Sau đó được <br /> tiến hành chạy thẩm tách qua màng 10kDa trong 48h, cuối cùng đông khô để chuyển thành  <br /> dạng bột. Kết quả ta thu được hỗn hợp polysaccharide có thành phần chính là fucoidan [9,  <br /> 10, 11, 14].<br /> <br /> <br /> 94<br /> Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một  Số 3(38)­2018<br /> <br /> Tách alginate: Bã rong còn lại sau khi chiết fucoidan được phơi khô và tiếp tục chiết <br /> alginat. Chiết alginat (50g rong khô) tiến hành chiết với 2,5 lít dung dịch Na 2CO3 3% trong 3 <br /> giờ tại 60oC (lặp lại 2 lần), sau đó chiết thêm với 2 lít dung dịch Na2CO3 3%  nữa và để qua <br /> đêm. Dịch chiết alginat natri được tách khỏi bã rong bằng cách lọc thô qua lớp vải lọc mịn,  <br /> dịch lọc được cô chân không đến 1/5 thể tích ban đầu và thẩm tách với màng 10kDa. Sau đó, <br /> dung dịch HCl 0,1M được thêm vào đến pH = 2 và để yên 12 giờ để kết tủa hoàn toàn  axit  <br /> alginic. Ly tâm tách tủa khỏi dung dịch, rửa lại tủa 3 lần bằng dung dịch HCl 0,1M (hoặc  <br /> dung dịch axit alginic được tủa trong cồn 960 theo tỷ lệ 1:2). Sau đó tủa axit alginic được hòa <br /> tan lại bằng dung dịch NaOH 1M, đem thẩm tách và tủa lại bằng 2 thể tích cồn 85%. Li tâm, <br /> tách tủa và rửa lại 3 lần với dung dịch cồn 85% đem sấy chân không ta thu được alginat natri <br /> dạng thô [6,13].<br /> Tách laminaran:  Bột  fucoidan  thô thu được có chứa  thành phần chính là  fucoidan <br /> lượng ít laminaran và axit alginic. Cân 0,5g mẫu đem hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, <br /> đặt vào máy khuấy trộn để  hòa tan, sau đó ly tâm ở  15oC với tốc độ  10.000 (v/p) trong 10 <br /> phút.   Phần   dịch   được   đưa   lên   cột   DEAE­Cellulose   (4x24   cm),   phần   không   tan   là <br /> polymanuronic. Sau đó, lần lượt rửa giải với  dung dịch  HCl 0,04N. Phân đoạn laminaran <br /> tách ra được cô chân không đến thể  tích nhỏ  nhất có thể  (10ml) và được thẩm tách để  ở <br /> 4oC (2­3 ngày) sau đó đem đông khô ta thu được bột laminaran [9, 10, 11, 14].<br /> Tách phân đoạn fucoidan thô: Sau khi tách laminaran  ở trên tiếp tục rửa giải với các <br /> dung dịch NaCl có nồng độ tăng dần  0,5N; 1,0N; 2,0N. Mỗi một lần như vậy cột được rửa  <br /> cho   đến   khi   dung  dịch   giải   hấp   không  còn   thấy   xuất   hiện   phản   ứng   dương  tính   của <br /> carbohydrate với phenol và axit sulfuric đậm đặc [7]. Tất cả  các phân đoạn thu được đem <br /> thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu được 3 phân đoạn ký hiệu F1, F2, F3 [9].<br /> Phân tích thành phần monosaccharide của fucoidan :  Thủy phân fucoidan sử  dụng <br /> TFA 4N  ở 100ºC trong 6h, sau đó để nguội cô quay gần đến khô thêm tiếp NH3(2,5%) cô <br /> quay tiếp (lập lại 3 lần), mẫu thu được hòa tan lại trong H 2O cất, ly tâm lấy dịch trong đem <br /> phân   tích   thành   phần   monosaccharide[1,   6].   Xác   định   thành   phần  monosaccharide  bằng <br /> phương   pháp   HPAE­PAD   (High   performance   anion   exchange   –   pulsed   amperometric  <br /> detection) trên hệ thống ICS 3000 tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.  <br /> Chương trình chạy: rửa isocratic với hệ  dung môi: H2O:NaOH 10mM = 99:01, tốc độ  rửa <br /> giải 0,1ml/min, thời gian chạy 25min, nhiệt độ 300C trên cột CarboPac PA20 (3x150mm). <br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Thành phần polysaccharide chủ  yếu trong rong nâu bao gồm alginate, laminaran  và <br /> fucoidan. Trong mẫu rong nâu  Sargassum crassifolium  nghiên cứu có chứa alginate 25%, <br /> laminaran     0,09%   và   fucoidan   1,4%.   So   sánh   với   kết   quả   phân   tích   hàm   lượng  <br /> polysaccharide   trong   một   số   loài   rong   nâu   trên   thế   giới[12]   thì   loài   rong   Sargassum  <br /> crassifolium ở Vịnh Nha Trang có hàm lượng laminaran  thấp hơn, fucoidan là tương tương  <br /> và hàm lượng alginate tương đối cao. Điều này một lần nữa khẳng định các yếu tố  địa lý  <br /> nơi cây rong sinh trưởng như ánh sáng, nhiệt độ, độ  muối, ... đã ảnh hưởng đến quá trình <br /> sinh   tổng   hợp   polysaccharide   của   rong   .   Nghiên   cứu   fucoidan   từ   rong   nâu  sargassum  <br /> <br /> <br /> 95<br /> Bùi Văn Nguyên...  Tách và xác định thành phần các polysaccharide tan trong nước...<br /> <br /> crassifolium kết quả tách phân đoạn thu được 3 phân đoạn khác nhau F1, F2 và F3 như miêu <br /> tả Hình 3.1. <br /> Kết quả xác định thành phần hóa học monosaccharide của fucoidan được đưa ra trên  <br /> Bảng 3.1. Giống như  các fucoidan khác, fucoidan từ  rong nâu   Sargassum crassifolium  có <br /> thành phần bao gồm nhiều loại đường với tỉ lệ khác nhau, fucoidan từ rong nâu sargassum  <br /> crassifolium  thì hai thành phần chủ  yếu là fucose và galactose. Ngoài ra còn có các thành  <br /> phần khác như  xylose, mannose, glucose và rhamnose. Riêng chỉ  phân đoạn F 3 là đơn giản <br /> nhất ngoài hai thành phần chính là fucose và galactose còn có rất ít rhamnose và không có  <br /> thành phần xylose, mannose và glucose.<br /> Hình 1. Phân đoạn  0,3 2<br /> Absorbance, 490nm<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> F2<br /> fucoidan bằng sắc  0,25<br /> 1,75<br /> <br /> <br /> <br /> ký trao đổi ion trên  0,2<br /> F1<br /> F3<br /> 1,5<br /> <br /> <br /> <br /> cột DEAE­Cellulose 1,25<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NaCl, M<br /> 0,15 1<br /> <br /> <br /> 0,75<br /> 0,1<br /> <br /> 0,5<br /> <br /> 0,05<br /> 0,25<br /> <br /> <br /> 0 0<br /> 0 100 200 300 400 500<br /> <br /> Fraction, V (ml)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Bảng 1. Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan<br /> Thành phần monosaccharide (%mol)<br /> Phân đoạn<br /> Fucose Galactose Xylose Manose Glucose Rhamnose<br /> F1 80,00 15,10 1,00 1,30 1,10 1,50<br /> F2 69,50 25,59 1,20 1,30 1,01 1,40<br /> F3 86,25 12,05 0,00 0,00 0,00 1,70<br /> 18.00 CHUAN MONO-111013 #13 F1-S.s crasifolium ED_1_Total<br /> <br /> 12.300 CHUAN MONO-111013 #6 [modified by computer, 4 peaks manually assigned] ED_1_Total nC<br /> <br /> nC<br />   1 - Fuc - 8.550 17.00<br /> 1 - fucose - 8.384<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 12.125 2 - Gal - 12.667 6 - Man - 18.000 16.00<br /> <br /> <br />   3 - Rham - 13.117<br /> 3 - Galactose - 12.367<br /> 15.00<br /> 12.000<br /> 4 - Glc - 14.634<br /> <br /> 5 - Xyl - 16.500<br /> 14.00<br /> <br /> 11.875<br /> <br /> 13.00<br /> 4 - Rhamnose - 13.000<br /> 11.750<br /> <br /> 12.00 CHUAN MONO-111013 #16<br /> 12.40<br /> F3-S.scrasifolium ED_1_Total<br /> nC<br /> 14.50 CHUAN MONO-111013 #14 F2-S.s cras ifolium ED_1_Total<br /> nC<br /> 1 - fucose - 8.334<br /> 11.625 6 - Xylose - 16.267<br /> 12.20 5 - Glucose - 14.400<br /> 11.00 2 - 10.900 7 - Manose - 17.867<br /> 1 - fucose - 8.384<br /> 14.00<br /> <br /> 12.00<br /> min<br /> 11.500 3 - Galactose - 12.350 m in<br /> 13.50 10.00<br /> 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0<br /> 11.80 3 - Galactose - 12.284<br /> <br /> <br /> <br /> 13.00<br /> 11.60<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 12.50 11.40<br /> 4 - Rhamnose - 12.967 4 - 12.850<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 11.20<br /> 12.00<br /> <br /> <br /> 11.00<br /> <br /> 11.50<br /> 2 - 10.800<br /> <br /> 10.80<br /> <br /> <br /> 11.00<br /> 2 - 10.884<br /> <br /> 6 - Xylose - 16.217<br /> 5 - Glucose - 14.334<br /> 96<br /> 10.60<br /> 7 - Manose - 17.800<br /> <br /> <br /> 10.50<br /> 10.40<br /> <br /> <br /> <br /> min min<br /> 10.00 10.20<br /> 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0<br /> Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một  Số 3(38)­2018<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Sắc ký đồ của chuẩn và mẫu<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Nghiên   cứu   tách   và   xác   định   thành   phần   polysaccharide   từ   rong   Nâu  Sargassum <br /> Crassifolium  thu thập  ở  Vịnh Nha Trang cho thấy hàm lượng alginate lớn nhất chiếm 25%,  <br /> fucoidan 1,4% và laminaran   0,09%. Kết quả  phân tích thành phần monosaccharide cho thấy  <br /> trong fucoidan thành phần chủ yếu là fucose và galactose. Kết quả giúp định hướng nghiên cứu  <br /> công nghệ  cũng như  nghiên cứu cơ  bản về  cấu trúc và hoạt tính, cho biết hàm lượng dinh  <br /> dưỡng và sử dung lam d<br /> ̣ ̀ ược liêu hoăc th<br /> ̣ ̣ ực phâm ch̉ ưc năng. T<br /> ́ ừ đo lam nên tang c<br /> ́ ̀ ̀ ̉ ơ sở cho sự <br /> phát triển và sử dụng nguôn tài nguyên rong nâu môt cach hiêu qua <br /> ̀ ̣ ́ ̣ ̉ ở Khánh Hòa. Đây là công  <br /> trình đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học của monosaccharide từ  rong nâu  Sargassum <br /> crassifolium, những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sẽ công bố trong những bài báo khoa học  <br /> sau. <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1] S. D. Anastyuk, N. M. Shevchenko, E. L. Nazarenko, P. S. Dmitrenok, and, T. N. Zvyagintseva <br /> (2009). Structural analysis of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens by MALDI­TOF <br /> and tandem ESI mass spectrometry. Carbohydrate Research, 344 (6), 779­787.<br /> [2] M. I. Bilan, A. A. Grachev, N. E. Ustuzhamina, A. S. Shashkov, N. E. Nifantiev, A. I. Usov <br /> (2002). A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. <br /> Carbohydrate Research, 337, 719­730.<br /> [3] B. Li, F. Lu, X. Wei and R. Zhao (2008), Fucoidan: Structure and Bioactivity, Molecules, 13, <br /> 1671­1695.<br /> [4] W. A. P. Black, E. T. Dewar, F. N. Woodward (1952). Manufacture of algal chemicals. IV.­<br /> Laboratory­scale isolation of fucoidin from brown marine algae, J. Sci. Food Agric., 3, 122­129.<br /> [5] Bui Minh Ly<br /> ̀ ́ ̣ ̣<br /> ́ (2010). Đanh gia hiên trang va Nghiên c<br /> ́ ̀ ứu giai phap bao vê nguôn l<br /> ̉ ́ ̉ ̣ ̀ ợi rong Mơ  <br /> ̣<br /> (Sargassum) tai Khanh Hoa<br /> ́ ̀ . Sở Khoa học và Công nghệ tinh Khanh Hoa.<br /> ̉ ́ ̀<br /> [6] D. Choosawad, U. Leggat, C. Dechsukhum,  A. Phonggdara and W. Chotigeat (2005). Anti­<br /> tumour     activities     of     fucoidan     from     the     aquatic     plant     Utricularia   aurea   lour. <br /> Songklanakarin J. Sci. Technol., 27 (3), 799­807. <br /> [7] M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, and F. Smith  (1956), Colorimetric, <br /> method for determination of sugars and related substances, Anal Chem, 28, 350­6.<br /> 97<br /> Bùi Văn Nguyên...  Tách và xác định thành phần các polysaccharide tan trong nước...<br /> <br /> [8] Huynh Q. N and Nguyen H. D (1998). The seaweed resources of Vietnam, A.T Critchley, M.  <br /> Ohno. Seaweed resources of the World, Japan, 62­69.<br /> [9] O. S. Vishchuk, S. P. Ermakova, T. N. Zvyagintseva (2011). Sunphated polysaccharides from <br /> brown   seaweeds   Saccharina   japonica   and   Undaria   pinnatifida:   isolation,   structural <br /> characteristics, and antitumor activity. Carbohydrate Research, 346, 2769­2776.<br /> [10] E. G. V. Percival and A. G. Ross (1950), Fucoidin. Part I. The isolation and purification of <br /> fucoidin from brown seaweeds. Journal of the Chemical Society, 717­720. <br /> [11] M. S. Pereira, F. R. Melo and P. A. S. Mourão (2002). Is there a correlation between structure <br /> and anticoagulant action of sunphated galactans and sunphated fucans?. Glycobiology, 12(10), <br /> 573­580.<br /> [12]P. Ruperes (2002). Mineral  content  of  edible  marine  seaweeds. Food  chemistry, 79, 23­26. <br /> [13]P.   Vauchel,   R.   Kaas,   A.   Arhaliass,   R.   Baron   and   J.   Legrand   (2008).   A   new   process   for <br /> extracting   alginates    from    Laminaria   digitata,    Reactive    Extrusion.     Food Bioprocess  <br /> Technol, 1, 297­300. <br /> [14] T.   N.   Zvyagintseva,   N.   M.   Shevchenko,   I.   B.   Popivnich  (1999).   A   new   procedure   for   the <br /> separation of water­soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr. Res, 322, 32­39. <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 98<br />