zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Y Tế - Sức Khoẻ

» Y khoa - Dược

Tạo dòng và sản xuất protein tái tổ hợp của Toxocara canis

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Tạo dòng và sản xuất protein tái tổ hợp của Toxocara canis trình bày việc tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp TES120 của Toxocara canis để tạo nguồn kháng nguyên chủ động và ứng dụng vào kỹ thuật ELISA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tạo dòng và sản xuất protein tái tổ hợp của Toxocara canis

Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 146-152 INSTITUTE OF COMMUNITY HEALTH CLONING AND EXPRESSION OF A RECOMBINANT PROTEIN OF TOXOCARA CANIS Dang Trinh Minh Anh*, Nguyen Thi Van Anh, Pham Nguyen Thuy Vy, Nguyen Thi Minh Chau, Tran Minh Qui, Tran Thi Khanh Quynh, Ngo Thi Hong Phuong, Nguyen Thi My Duyen, Nguyen Ho Quynh Ngan, Vo Huynh Minh Hien, Doan Binh Minh, Le Thanh Dong Ho Chi Minh City Institute of malariology, Parasitology and Entomology - 685 Tran Hung Dao, 1 ward, 5 district, Ho Chi Minh City, Vietnam Received 09/12/2022 Revised 13/01/2023; Accepted 10/02/2023 ABSTRACT Background: Human toxocariasis is a worldwide disease and it is caused by zoonotic roundworm species Toxocara canis and Toxocara cati. Diagnosis of human toxocariasis is based on the combination of clinical, epidemiological criteria, as well as serology tests that detect anti-Toxocara antibodies. Notwithstanding, serology is the key evidence to support a conclusive diagnosis. TES- ELISA is the most widely used serological test for diagnosis. However, insufficience of sources and cross-reaction of TES antigens with antibodies produced to other helminth antigens are major drawbacks for its application. Therefore, T. canis recombinant antigens have been decribed as an alternative to native TES for diagnosis. Objective: The aim is to clone and express the recombinant protein TES120 of Toxocara canis to produce an actively source of antigen and to apply to ELISA. Results: T. canis TES120 gene was isolated from T. canis adult worms (collected in Institute of Malariology, Parasitology and Entomology in Ho Chi Minh City) and expressed in E. coli expression system. TES120 gene had the size of 501 bp and was successfully inserted to pET28a. Then, plasmid pET28a-TES120 was transformed into E.coli BL21. Finally, TES120 recombinant protein was expressed at 37oC in 6h and had the size of 21 kDa. Conclusion: TES120 recombinant protein will be used as an antigen to develop ELISA test for toxocariasis. Keywords: TES120; Toxocariasis; Recombinant protein; IMPEHCM. *Corressponding author Email address: dangminhanh2484@gmail.com Phone number: (+84) 984 532 534 146
D.T.M. Anh et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 146-152 TẠO DÒNG VÀ SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP CỦA TOXOCARA CANIS Đặng Trịnh Minh Anh*, Nguyễn Thị Vân Anh, Phạm Nguyễn Thúy Vy, Nguyễn Thị Minh Châu, Trần Minh Quí, Trần Thị Khánh Quỳnh, Ngô Thị Hồng Phương, Nguyễn Thị Mỹ Duyên, Nguyễn Hồ Quỳnh Ngân, Võ Huỳnh Minh Hiền, Đoàn Bình Minh, Lê Thành Đồng Viện Sốt rét - Ký sinh trùng -Côn trùng TP. HCM - 685 Đ. Trần Hưng Đạo, phường 1, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Ngày nhận bài: 09 tháng 12 năm 2022 Chỉnh sửa ngày: 13 tháng 01 năm 2023; Ngày duyệt đăng: 10 tháng 02 năm 2023 TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh Toxocariasis là một bệnh giun sán phổ biến lây truyền từ động vật sang người do các loài giun tròn Toxocara canis and Toxocara cati gây ra. Để chẩn đoán bệnh Toxocariasis chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng, các yếu tố dịch tễ và huyết thanh học tìm kháng thể kháng Toxocara. Trong đó kết quả huyết thanh học của kỹ thuật ELISA được sử dụng chủ yếu để đưa ra kết luận chẩn đoán. Tuy nhiên kỹ thuật ELISA sử dụng nguồn kháng nguyên tiết mặc dù có độ nhạy cao nhưng bị hạn chế nguồn cung kháng nguyên và phản ứng chéo với kháng nguyên của các loài giun khác. Do đó để chủ động trong việc tạo ra nguồn kháng nguyên ổn định, có độ đặc hiệu cao sử dụng cho kỹ thuật ELISA thì protein tái tổ hợp là một lựa chọn thay thế. Mục tiêu: Tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp TES120 của Toxocara canis để tạo nguồn kháng nguyên chủ động và ứng dụng vào kỹ thuật ELISA Kết quả nghiên cứu: Đoạn gien mã hoá TES120 của Toxocara canis đã được phân lập từ mẫu T. canis trưởng thành thu thập tại Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TP. HCM và biểu hiện trên hệ thống vi khuẩn E. coli. Đoạn gien TES120 có kích thước 501 bp được khuếch đại sau đó ghép nối vào vector pET28a+ và được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21 để biểu hiện protein. Protein tái tổ hợp TES120 được biểu hiện ở 37oC trong 6 tiếng, có kích thước khoảng 21 kDa. Kết luận: Protein tái tổ hợp TES120 sẽ được sử dụng làm kháng nguyên cho việc phát triển test ELISA chẩn đoán bệnh giun đũa chó/mèo. Từ khóa: TES120; Bệnh giun đũa chó/mèo; Protein tái tổ hợp; IMPEHCM. *Tác giả liên hệ Email: dangminhanh2484@gmail.com Điện thoại: (+84) 984 532 534 147
D.T.M. Anh et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 146-152 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Chẩn đoán bệnh giun đũa chó dựa vào lấy sinh thiết nhưng phương pháp này khó thực hiện và tốn thời gian. Bệnh Toxocariasis là bệnh phổ biến lây truyền từ động Do đó việc chẩn đoán hiện nay chủ yếu dựa vào việc vật sang người do Toxocara canis hoặc Toxocara cati chẩn đoán huyết thanh và triệu trứng lâm sàng. Chẩn gây ra (1). Tỷ lệ huyết thanh dương tính với Toxocara đoán huyết thanh sử dụng kháng nguyên tiết thô từ ấu cao nhất ở các nước đang phát triển có điều kiện vệ trùng mắc dù có độ nhạy cao nhưng thường tốn thời sinh kém. Ở Châu Á và Nam Mỹ có đến 45-75% trẻ gian, không thể sản xuất số lượng lớn kháng nguyên và em ở vùng nông thôn có huyết thanh dương tính với độ đặc hiệu thường thấp do phản ứng chéo với các loại Toxocara (2-6). Ở Châu Âu có tỷ lệ huyết thanh dương giun truyền qua đất khác (7, 10, 11). với Toxocara từ 2-5% ở thành thị, 15-20% ở vùng Sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp trong việc phát triển ngoại thành và 35-42% ở vùng nông thôn (7). các xét nghiệm sẽ làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu so Người là ký chủ ngẫu nhiên, nhiễm do nuốt trứng có với các kháng nguyên thô. Do đó trong nghiên cứu này phôi của giun đũa chó/mèo. Ấu trùng thoát vỏ khỏi chúng tôi “Tạo dòng và sản xuất protein tái tổ hợp của trứng, xâm nhập thành ruột và được chuyên chở theo Toxoxara canis” để bước đầu chủ động trong việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp từ đó có thể ứng dụng đường máu đến gan, phổi và những cơ quan khác. Ở trong chuẩn đoán huyết thanh học giúp tăng độ nhạy và những cơ quan này, ấu trùng di chuyển hàng tuần hay độ đặc hiệu của phương pháp. hàng tháng hoặc nằm im, thành những vật lạ gây viêm và kích thích tạo ra u hạt thâm nhiễm bạch cầu ái toan. Sự tồn tại của ấu trùng và chất tiết của chúng trong cơ 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP thể người sẽ gây tổn thương thành mạch, mô mềm, hoại tử và xuất huyết. thể người sẽ đáp ứng lại bằng cách 2.1. Vật liệu tạo ra phản ứng miễn dịch học và các phản ứng bệnh Toxocara canis trưởng thành, cDNA của Toxocara lý. Mức độ bệnh không chỉ phụ thuộc vào số lượng ấu canis, chủng vi khuẩn E. coli (DH5α) và (BL21) trùng nhiễm vào cơ thể mà còn phụ thuộc vào mức độ các phản ứng dị ứng. Kết quả các biểu hiện bệnh lý trên Vector biểu hiện pET28a và hóa chất sử dụng từ các lâm sàng là từ sự viêm nhiễm gây ra bởi các phản ứng hãng Novagen, Bioline, Invitrogen… miễn dịch trực tiếp chống lại các kháng nguyên bài tiết Các cặp mồi sử dụng do Công ty Phù Sa (Việt Nam) của ấu trùng (9). tổng hợp. Bảng 1. Trình tự primer sử dụng khuếch đại đoạn gen TES120 Primer Trình tự (5’–3’) Chiều dài Tm TES120 - BamHI - F cGGATCCATGATGTCCAGTTC 21 56.7⁰C TES120 - XhoI - R cgCTCGAGTTACAGAAGCCGC 21 58.3⁰C 2.2. Phương pháp Trizol/Chloroform. 2.2.1. Phân tích đặc điểm kháng nguyên của gien 2.2.3. Tạo thư viện cDNA TES120 Mẫu RNA tổng số được sử dụng để tạo thư viện Đặc điểm kháng nguyên của protein TES120 được cDNA bằng bộ kit ProtoScript® II First Strand cDNA phân tích bằng phần mềm SignalP 6.0, DeepTMHMM. Synthesis. Thư viện cDNA được bảo quản đông lạnh 2.2.2. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô -80oC đến khi tiến hành thí nghiệm. Mẫu mô được thu từ giun trưởng thành Toxocara canis 2.2.4. Khuếch đại đoạn gien TES120 được bảo quản đông lạnh ở –80⁰C cho đến khi tiến hành Đoạn gien TES120 được khuếch đại từ thư viện cDNA tách chiết RNA. RNA tổng số được tách chiết sử dụng của Toxocara canis với cặp mồi đặc hiệu với chu kỳ 148
D.T.M. Anh et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 146-152 nhiệt: 94oC/10 phút, 35 chu kỳ (94oC/30 giây, 55oC/30 giải trình tự. giây, 72oC/1:30 phút và 72oC/7 phút. Sản phẩm PCR 2.2.6. Biểu hiện protein tái tổ hợp TES120 sau đó được điện di trên gel agarose 1.5%, ở hiệu điện thế 110V trong 40 phút, đọc kết quả dưới ánh sáng UV Plasmid tái tổ hợp pET28a-TES120 được biến nạp với thang chuẩn 100bp DNA. Sản phẩm PCR thành vào tế bào E. coli BL21 và nuôi cấy ở 37oC trong 6 công sẽ tiến hành tinh sạch bằng bộ kit GeneJET PCR giờ, có bổ sung isopropyl-thio-β-D-galactoside (IPTG) purification. nồng độ 1 mM và được điện di kiểm tra trên gel SDS 2.2.5. Tạo plasmid tái tổ hợp pET28a - TES120 – PAGE 12%. Trước khi tiến hành tạo plasmid tái tổ hợp, đoạn gien TES120 mục tiêu và vector pET28a được xử lý đồng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN thời với 2 loại enzyme cắt giới hạn BamHI/XhoI. Phản ứng được ủ trong 37°C trong 2 tiếng. Sản phẩm cắt 3.1. Phân tích đặc điểm kháng nguyên của TES120 sau đó được điện di trên gel agarose 1,5%, ở hiệu điện Kết quả kiểm tra bằng phần mềm SignalP cho thấy thế 110V trong 40 phút. Sản phẩm điện di được tiến TES120 có cắt của signal peptide ở vị trí amino acid thứ hành cắt gel và tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Gel 18 và 19 (tức là nucleotide thứ 54) vì vậy để loại bỏ đi Extraction. đoạn signal peptide thì trình tự của gien TES120 phải bỏ Sản phẩm pET28a và TES120 sau khi tinh sạch từ đi 54 nucleotide (Hình 1 A). Vùng signal peptide được gel được ghép nối bằng enzyme T4 DNA ligase ở loại bỏ đi vì đây là vùng mã hóa cho các polypeptide 16oC trong 16 tiếng. Sản phẩm nối được biến nạp vào đính trên màng nên tính kháng nguyên sẽ hạn chế và có tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và thể ảnh hường đến tính tan của protein tái tổ hợp. chọn lọc trên môi trường kanamycine 50 µg/ml. Các khuẩn lạc được kiểm tra có mang plasmid tái tổ hợp Kết quả kiểm tra bằng phần mềm DeepTMHMM cho thấy pET28a-TES120 hay không bằng PCR khuẩn lạc và protein TES120 không có vùng xuyên màng (Hình 1 B). Hình 1. Kết quả kiểm tra vị trí cắt signal peptide (A) và kết quả kiểm tra vùng protein xuyên màng (B) của TES120 3.2. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại gien mục được ở trong pha tan), cặp mồi có thêm vị trí nhận biết tiêu TES 120 BamHI và XhoI ở đầu 5’ sẽ giúp cho việc định hướng Gien mục tiêu TES120 được khuếch đại bằng phản ứng đoạn gien vào plasmid pET28a đúng chiều và có thể PCR với cặp mồi thiết kế (bảng 1) cho sản phẩm có phiên mã và dịch mã thành protein tái tổ hợp TES120. kích thước khoảng 501 bp tương ứng với kích thước Sản phẩm PCR này sẽ được sử dụng cho thí nghiệm lý thuyết là vùng mã hóa đoạn gien TES120 không có tiếp theo nối đoạn gien mục tiêu vào vector biểu hiện đoạn signal peptide (giúp cho protein có thể thu nhận pET28a. 149
D.T.M. Anh et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 146-152 Hình 2: Kết quả khuếch đại đoạn gien mục tiêu TES120 3.3. Tạo plasmid tái tổ hợp pET28a-TES120 Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường chọn lọc được Tiến hành xử lý đồng thời đoạn gien mục tiêu TES120 sàng lọc lại bằng cặp mồi TES120 – BamHI – F và và vector pET28a bằng 2 enzyme BamHI và XhoI và sản TES120 – XhoI – R. Kết quả điện di sản phẩm PCR phẩm là băng điện di của TES120 khoảng 486 bp (Hình cho thấy các khuẩn lạc được chọn đều cho băng DNA 3 A) và của vector pET28a là khoảng 5,3 kb (Hình 3 có kích thước khoảng 501 bp (Hình 3 C), đúng với B). Sản phẩm điện di được cắt gel và tinh sạch bằng bộ kích thước lý thuyết. Phản ứng cắt plasmide pET28a- kit Qiaquick gel extraction, sản phẩm sau tinh sạch sẽ TES120 bằng 2 enzyme BamHI và XhoI thu được 2 được sử dụng cho phản ứng nối. Phản ứng nối đoạn gien băng DNA trong đó 1 băng có kích thước khoảng 5,3kb TES120 vào vector pET28a được tiến hành bằng enzyme (vector pET28a) và 1 băng có kích thước khoảng 486 T4 DNA ligase sau đó biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli bp (TES120) (Hình 3 D). Kết quả thu được chứng tỏ đã DH5α, cấy trải trên đĩa thạch LB agar có bổ sung kháng nhân dòng thành công đoạn gien TES120 vào vector sinh kanamycin (50µg/ml) và nuôi qua đêm ở 37oC. pET28a. Hình 3. Kết quả cắt bằng enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI của pET28a, TES120 trước khi nối và plasmid pET28a-TES120 sau khi nối thành công A. Kết quả điện di sản phẩm của vector pET28a sau khi cắt bằng bằng 2 enzyme BamHI và XhoI. Giếng 1: thang 1kb; Giếng 2: pET28a sau cắt bằng enzyme cắt giới hạn. B. Kết quả điện di sản phẩm của TES120 sau khi cắt bằng bằng 2 enzyme BamHI và XhoI. Giếng 1: thang 100bp; Giếng 2: TES120 sau cắt bằng enzyme cắt giới hạn. C. Kết quả PCR chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid pET28a- TES120 sau khi nối. Giếng 1: thang 100bp; Giếng 2,3,4,5: các khuẩn lạc mang plasmid pET28a-TES120. D. Kết quả cắt plasmid pET28a-TES120 bằng 2 enzyme BamHI và XhoI. Giếng 1: thang 100bp; Giếng 2: plasmid pET28a-TES120 sau khi cắt. 3.4. Kết quả biểu hiện protein lạc mọc trên môi trường LB agar có bổ sung kháng Vector pET28a mang đoạn gien TES120 (plasmid sinh kanamycin được kiểm tra lại bằng phản ứng pET28a-TES120) được biến nạp lại vào tế bào vi PCR khuẩn lạc với cặp mồi TES120 – BamHI – F và khuẩn E. coli BL21 để biểu hiện protein. Các khuẩn TES120 – XhoI – R. Chọn khuẩn lạc dương nuôi để 150
D.T.M. Anh et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 146-152 biểu hiện protein TES120 tái tổ hợp trong môi trường protein SDS-PAGE. LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin, cảm ứng bởi Phân tích kết quả SDS – PAGE của protein tái tổ 1mM isopropyl-thio-β-D-galactoside (IPTG) ở điều hợp TES120 của T. canis cho thấy băng mục tiêu là kiện 37oC trong 6h. Dịch chiết tế bào được thu trước và khoảng 21 kDa (Hình 4). Kích thước băng mục tiêu là sau khi sử dụng cảm ứng IPTG để kiểm tra bằng điện di kích thước của protein mục tiêu TES120 và đoạn his-tag. Hình 4. Kết quả SDS-PAGE biểu hiện protein tái tổ hợp TES120 Giếng 1: Thang; Giếng 2: Dịch chiết tế bào trước khi cho cảm ứng IPTG; Giếng 3: Sau khi cho cảm ứng IPTG 6h. 4. KẾT LUẬN 2004;9:1312–1318. [4] Baboolal S, Rawlins SC, Seroprevalence of Đoạn gien TES120 chứa vùng mã hóa protein tái tổ hợp toxocariasis in school children in Trinidad. Trans TES120 đã được khuếch đại thành công từ thư viện R Soc Trop Med Hyg. 2002;96:139–143. cDNA của Toxocara canis và tách dòng vào vector pET28a để biểu hiện trên hệ thống vi khuẩn. [5] Radman NE, Archelli SM, Fonrouge RD et al., Human toxocariasis. Its seroprevalence in Protein tái tổ hợp TES120 đã được biểu hiện thành công the city of La Plata. MemInst Oswaldo Cruz. trong chủng vi khuẩn E. coli BL21 ở 37oC trong 6 tiếng. 2000;95:281–285. [6] Roldan WH, Espinoza YA, Huapaya PE et al., TÀI LIỆU THAM KHẢO Frequency of human toxocariasis in a rural population from Cajamarca, Peru determined by [1] Rubinsky-Elefant G, Hirata CE, Yamamoto JH DOT ELISA test. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. et al., Human toxocariasis: diagnosis, worldwide 2009;51:67–71. seroprevalences and clinical expression of the systemic and ocular forms. Ann Trop Med [7] Magnaval JF, Glickman LT, Dorchies P et al., Parasitol.2010;104:3–23. Highlights of human toxocariasis. Korean J Parasitol. 2001;39:1–11. [2] Hayashi E, Tuda J, Imada M et al., High prevalence of asymptomatic Toxocara infection among school [8] Kotłowski A, Kowalewska B, Rudzińska M, children in Manado, Indonesia. Southeast Asian J Toxocara eggs in children kindergartens in Tri- Trop Med Public Health.2005;36:1399–1406. City area and evaluation of interdependence quantification of invasion with frequency of [3] Fan CK, Hung CC, Du WY et al., Seroepidemiology antibodies incidence among population under of Toxocara canis infection among mountain study. Environ Med. 2011;14:45–50. aboriginal school children living in contaminated districts in eastern Taiwan. Trop Med Int Health. [9] Lassmann B, Tsigrelis C, Virk A, 33- year-old 151
D.T.M. Anh et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 146-152 woman with marked Eosinophillia. Mayo Clin [11] Romasanta A, Romero JL, Arias M et al., Diagnosis Proc, Vol. 82, No. 1, pp. 103-106, 2007. of parasitic zoonoses by immunoenzymatic assays – analysis of cross-reactivity among the [10] Jacquier B, Gottstein Y, Eckert J, Immunodiagnosis excretory/secretory antigens of Fasciola hepatica, of toxocariasis in humans: evaluation of a new Toxocara canis and Ascaris suum. Immunol enzyme-linked immunosorbent assay kit. J Clin Invest. 2003;32:131–142. Microbiol. 1991;29:1831–1835. 152

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.