Tạo que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae trong nguồn nước sinh hoạt

Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH<br /> Vibrio cholerae TRONG NGUỒN NƯỚC SINH HOẠT<br /> Trần Thị Thanh Quỳnh1*, Phạm Kiên Cường1, Nguyễn Khánh Hoàng Việt1,<br /> Phan Tuấn Nghĩa2, Nguyễn Thị Tâm Thư1<br /> Tóm tắt: Vibrio cholerae là một trong những tác nhân phổ biến gây bệnh nhiễm<br /> trùng tiêu chảy cấp hay còn gọi là bệnh tả. Vi khuẩn này lây lan nhanh chóng thông<br /> qua nguồn nước và thức ăn, thậm chí có khả năng bùng phát thành dịch bệnh trên<br /> diện rộng, trong thời gian ngắn. Hàng năm, trên thế giới ước tính có khoảng 3 - 5<br /> triệu trường hợp mắc bệnh và 100.000 - 120.000 trường hợp tử vong do dịch/ bệnh tả.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn môi trường phù hợp nhất để tăng sinh tế<br /> bào vi khuẩn và sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch để chế tạo que thử phát hiện Vibrio<br /> cholerae trong nguồn nước sinh hoạt. Kết quả cho thấy, trong 3 môi trường: pepton<br /> kiềm, canh thang kiềm và LB kiềm thì môi trường pepton kiềm có khả năng tăng sinh<br /> tế bào vi khuẩn Vibrio cholerae tốt nhất, có thể đạt 106-107 CFU/ml sau 6-8 giờ nuôi<br /> cấy. Que thử tạo ra gồm có màng nitrocellulose và màng thấm hút trên, 2 kháng thể<br /> được cố định trên màng nitrocelluse lần lượt là: kháng thể đơn dòng kháng Vibrio<br /> cholerae được gây trênchuột với nồng độ 0,3 µg/mm và kháng thể đa dòng kháng<br /> chuột gắn enzyme peroxidase củ cải ngựa- HRP với nồng độ 0,2 µg/mm. Kết quả chỉ<br /> ra rằng, que thử cho phép phát hiện Vibrio cholerae trong nước ở nồng độ ≥ 105<br /> CFU/ml trong thời gian 2-5 phút và có độ đặc hiệu là 94%.<br /> Từ khóa: Bệnh tả; Phát hiện nhanh; Que thử; Sắc ký miễn dịch; Vibrio cholerae.<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Vi khuẩn tả Vibrio cholerae được Robert Koch tìm ra năm 1884 ở Đức [7]. Thế kỷ<br /> XIX đã xảy ra 6 vụ dịch lớn ở châu Á, Âu, Phi, Mỹ làm hàng triệu người tử vong. Ở Việt<br /> Nam, bệnh tả cũng đã xuất hiện từ năm 1850 và bùng phát thành dịch ở nhiều tỉnh, thành<br /> trong nhiều năm khiến hàng trăm người tử vong. Năm 2007 dịch lại bùng phát ở 19<br /> tỉnh/thành phố phía Bắc và có hàng ngàn trường hợp mắc bệnh. Ngày nay, vi khuẩn này<br /> cũng là một trong những tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm và nước uống. Hàng năm,<br /> trên thế giới ước tính khoảng 3 - 5 triệu trường hợp mắc bệnh và 100.000 - 120.000 trường<br /> hợp tử vong do dịch/ bệnh tả [10]. Thời gian ủ bệnh ngắn khoảng từ 2 giờ đến 5 ngày,<br /> nhiều khả năng bùng phát dịch bệnh.<br /> Bệnh tả dễ truyền nhiễm qua phân và chất nôn của người bệnh hoặc từ các ổ chứa thiên<br /> nhiên như một số động vật thủy sinh, nhất là các loài nhuyễn thể (cá, cua, trai sò, ngao...) ở<br /> vùng cửa sông và ven biển. Vi khuẩn tả gây tiêu chảy cấp tính, nếu không phát hiện và chữa<br /> trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong. Vì vậy, việc phát hiện sự có mặt của vi khuẩn tả V.<br /> cholerae trong nguồn nước và thực phẩm là hết sức cần thiết.<br /> Hiện nay, ở Việt Nam cũng như trên thế giới có rất nhiều phương pháp phát hiện vi<br /> khuẩn tả như: soi tươi, phân lập vi khuẩn, xét nghiệm huyết thanh học, PCR, ELISA, sắc<br /> ký miễn dịch...[1, 2, 4, 5]. Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng. Trong đó<br /> phương pháp PCR là phương pháp được áp dụng khá phổ biến, có độ nhạy và độ đặc hiệu<br /> cao. Hiện nay, trên thị trường đã có các bộ kit phát hiện vi khuẩn tả V. cholerae bằng<br /> phương pháp PCR như bộ kit của hãng: VeTeKTM, Genesig. Tuy nhiên, phương pháp này<br /> đòi hỏi máy móc và trang thiết bị hiện đại, khó áp dụng ngoài hiện trường. Chính vì vậy,<br /> để có thể vừa đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao đồng thời đơn giản, dễ thao tác, thực<br /> hiện ngay tại hiện trường thì sắc ký miễn dịch là phương pháp phù hợp.<br /> <br /> <br /> 146 T.T.T. Quỳnh, …, N.T.T. Thư, “Tạo que thử phát hiện nhanh … nguồn nước sinh hoạt.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> Năm 2013, Charaborty đã nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện V. cholerae O1 và<br /> O139 trong các mẫu nước dựa trên phương pháp sắc ký miễn dịch [4]. Que thử cho phép<br /> phát hiện vi khuẩn ở nồng độ ≥10 CFU/ml với độ nhạy khoảng 90% và độ đặc hiệu 100%<br /> sau khi ủ mẫu trong môi trường peptone kiềm 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Debes và cộng sự<br /> [5] cũng đã sử dụng phương pháp này để phát hiện các mẫu phân và mẫu nước trong môi<br /> trường bị nhiễm V. cholerae O1 và O139 trong thời gian 5-8 giờ. Nhóm nghiên cứu đã sử<br /> dụng các kháng thể đặc hiệu với lipopolysaccharide (LPS) của V. cholerae O1 và O139.<br /> Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 10 ng LPS/ml với V. cholerae O1 (tương<br /> đương 106 CFU/ml) và 50 ng LPS/ml đối với V. cholerae O139 (tương đương 107<br /> CFU/ml).<br /> Với những lý do nêu trên, chúng tôi sử dụng nguyên lý sắc ký miễn dịch để tạo que thử<br /> phát hiện nhanh vi khuẩn tả V. cholerae trong nguồn nước sinh hoạt và thực phẩm.<br /> 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất<br /> - Nguyên vật liệu: Màng nitrocelluse Immumopore FP và màng thấm hút trên được<br /> mua từ hãng Whatman (Anh), đĩa ELISA được mua từ hãng Beckman Coulter (Mỹ)...<br /> - Hóa chất: Kháng thể đơn dòng kháng V.cholerae (ABIN1825015 _KT1), kháng thể<br /> đơn dòng kháng V.cholerae (ABIN1825014 _KT2) được mua từ hãng Antibodies (Anh),<br /> Goat-antimouse IgG h&HPR (ab6789_KT3) được mua từ hãng Abcam (Anh). Các hóa<br /> chất còn lại đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.<br /> 2.2. Thiết bị<br /> Các thiết bị chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Máy phun mẫu bán tự động<br /> Linomat5 được mua từ hãng Camag (Thụy Sĩ), tủ ấm được mua từ hãng Memmert (Đức),<br /> hệ thống ELISA được mua từ hãng Das (Ý), máy khuấy từ gia nhiệt và máy vortex được<br /> mua từ hãng Cole Palmer (Mỹ), máy short spin được mua từ hãng Hermle (Mỹ), máy ly tâm<br /> lạnh được mua từ hãng Orto alresa (Tây Ban Nha).<br /> 2.3. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.3.1. Phân lập vi khuẩn V. cholerae<br /> - Chuẩn bị môi trường chọn lọc (thạch TCBS): 8,8 g thạch TCBS được pha trong 100 ml<br /> cất, sau đó được đun sôi và đổ 15 ml vào đĩa Petri, để đông 15 phút ở nhiệt độ phòng [6].<br /> - Cấy trải phân lập vi khuẩn (nước đầm tôm Hải Phòng, nước thoát cống Hà Nội và<br /> dịch nuôi vi khuẩn chuẩn mua ở Viện 103 được ký hiện là Vibrio cholerae O1): 50 µl dịch<br /> chứa vi khuẩn được cấy trải đều lên đĩa thạch TCBS và nuôi cấy qua đêm ở 37 oC.<br /> 2.3.2. Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn phân lập được<br /> - Phản ứng PCR [6]: Từ mỗi đĩa vi khuẩn nuôi cấy, 1 khuẩn lạc được lựa chọn để nuôi<br /> cấy và tách genome. Sản phẩm genome được dùng như nguồn DNA làm khuôn cho phản<br /> ứng PCR. Thành phẩn của 1 phản ứng bao gồm: 12,5 µl Master mix 2X, 1 µl mồi 16S Fw<br /> 10 µmol, 1 µl mồi 16S Rv 10 µmol, 9,5 µl H2O và 1 µl khuôn.<br /> - Chu trình nhiệt: 94oC, 4 phút để khởi động nóng tiếp nối 30 chu kỳ của ba bước: 94<br /> o<br /> C, 30 giây; 54 oC, 45 giây; 72 oC, 1 phút 30 giây, sản phẩm PCR được ủ ở 72 oC, 7 phút<br /> và giữ ở 4 oC.<br /> - Điện di sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % ở 90 V,<br /> 45 phút.<br /> - Giải trình tự: Sau khi điện di thu được băng kích thước khoảng 1,5 kb tương đương<br /> với kích thước gen 16S rRNA của V. cholerae, sản phẩm PCR được giải trình tự bởi First<br /> Base Laboratories (Singapore).<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 55, 06 - 2018 147<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> 2.3.3. Xác định môi trường dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae<br /> - Chuẩn bị môi trường tăng sinh tế bào vi khuẩn: thành phần môi trường bao gồm 200<br /> ml pepton kiềm pH 8.5 (2 g pepton, 2 g NaCl), 200 ml canh thang kiềm pH 8.5 (1g cao<br /> thịt, 2 g pepton, 1 g NaCl), 200 ml LB kiềm pH 8.5 (1 g yeast extract, 2 g pepton, 2 g<br /> NaCl). Các môi trường được khử trùng ở 121 oC trong 20 phút.<br /> - Nuôi cấy để làm tăng sinh tế bào vi khuẩn: Một khuẩn lạc vi khuẩn V. cholerae được<br /> nuôi trong 5 ml môi trường pepton kiềm qua đêm ở 37oC. 100 µl dịch nuôi cấy được cho<br /> vào 4,5 ml H2O cất đã khử trùng, được pha loãng ra các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3,10-4, 10-<br /> 5<br /> .500 µl dịch vi khuẩn pha loãng ở các nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 được hút và cho vào các lọ<br /> chứa 10 ml môi trường chứa một trong 03 loại môi trường (LB kiềm, canh thang kiềm và<br /> pepton kiềm) và nuôi cấy ở 37 oC. Sau 4, 6, 8 giờ, 100 µl dịch nuôi cấy được pha loãng và<br /> cấy gạt trên đĩa thạch, tiếp tục nuôi cấy qua đêm ở 37 oC đến khi các khuẩn lạc hình thành<br /> rõ rệt. Các khuẩn lạc được đếm và kết quả được xử ý thống kê.<br /> 2.3.4. Đánh giá phản ứng giữa V. cholerae - kháng thể bằng phương pháp ELISA<br /> 100 µl poly L-lysine 0,01% được hút cho vào 03 giếng trong đĩa ELISA và được ủ ở 37<br /> o<br /> C trong 1 giờ. Sau đó, các giếng được rửa bằng 200 µl đệm rửa (PBS 0,01 M, pH7.4;<br /> Tween 20 0,05%), 100 µl vi khuẩn ở nồng độ 108 CFU/ml được bổ sung và ủ ở 4 oC qua<br /> đêm. 200 µl BSA 1% được bổ sung vào mỗi giếng chứa vi khuẩn nuôi cấy, ủ ở 37 oC trong<br /> 2 giờ. Tương tự, các giếng được rửa sạch bằng đệm rửa và được bổ sung lần lượt như sau:<br /> 100 µl đệm PBS 0,01 M, pH 7,4; 100 µl kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae gây trên<br /> chuột_KT1 nồng độ 5 µg/ml và 100 µl kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae gây trên<br /> chuột _KT2 nồng độ 5 µg/ml, ủ 37 oC trong 1 giờ. Đĩa được rửa bằng đệm rửa để loại bỏ<br /> các kháng thể gắn không đặc hiệu. 100 µl kháng thể đa dòng kháng chuột gắn enzyme<br /> peroxidase củ cải ngựa-HRP (KT3), nồng độ 0,2 µg/ml được bổ sung tiếp tục vào mỗi<br /> giếng, hỗn hợp được ủ ở 37 oC trong 1 giờ, sau đó các kháng thể gắn không đặc hiệu được<br /> rửa bằng đệm rửa. 50 µl cơ chất 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) được bổ sung vào<br /> mỗi giếng và hỗn hợp được ủ 30 phút ở 37 oC trong tối, HRP thủy phân cơ chất tạo sản<br /> phẩm màu xanh. 50 µl H2SO4 1 N được bổ sung để làm ngừng phản ứng, trong môi trường<br /> axit, sản phẩm phản ứng chuyển sang màu vàng, cường độ màu phản ánh khả năng bắt cặp<br /> của kháng nguyên và kháng thể được đo ở bước sóng A450.<br /> 2.3.5. Chế tạo que thử phát hiện vi khuẩn V. cholerae<br /> - Cố định các kháng thể lên màng nitrocellulose: 02 loại kháng thể (kháng thể KT3 và<br /> KT1 hoặc KT3 và KT2) được được phun trực tiếp lên màng nitrocellulose thành 2 vạch bằng<br /> thiết bị in phun kháng thể Linomat5 với nồng độ là 0,2 µg/mm, tốc độ phun 40 nl/s. Sau đó,<br /> màng nitrocellulose được làm khô tự nhiên qua đêm ở nhiệt độ phòng để các kháng thể gắn<br /> cố định lên màng. Màng được ngâm trong dung dịch BSA 1%, 10 phút và được rửa lại bằng<br /> đệm PBS 0,01 M, pH 7,4; SDS 0,05 %, tiếp tục được để khô ở nhiệt độ phòng qua đêm.<br /> Màng được cắt thành các que thử rộng 2 mm có gắn thêm màng thấm hút ở trên.<br /> - Cộng hợp hạt vàng vào kháng thể: Dung dịch hạt vàng có kích thước nano được<br /> chuẩn bị theo phương pháp Turkevich [9]: 20ml dung dịch HAuCl4 0,1 % được đun sôi kết<br /> hợp khuấy từ trong bình tam giác 250 ml. Sau đó, 2 ml Natri citrate 1% được bổ sung vào<br /> bình dung dịch tiếp tục được đun sôi khoảng 5 phút (dừng khi dung dịch chuyển từ màu<br /> vàng thành màu đỏ rượu vang). Sau đó, dung dịch hạt vàng được làm nguội ở nhiệt độ<br /> phòng và được bảo quản trong bình tối ở 4 oC. Các hạt vàng có kích thước khoảng 20 nm<br /> và giữ ổn định bởi Natri citrate trong 1 tháng. Để cộng hợp hạt vàng vào kháng thể, dung<br /> dịch hạt vàngđược chuẩn về pH 9 bằng đệm borate 0,1 M. Sau đó, 100 µl kháng thể đơn<br /> dòng kháng V. cholerae gây từ chuột nồng độ 100 µg/ml được bổ sung vào 1,5 ml dung<br /> dịch hạt vàng đã được chuẩn pH, lắc ở tốc độ 650 vòng/phút trong 20 phút. Tiếp đến, hỗn<br /> <br /> <br /> 148 T.T.T. Quỳnh, …, N.T.T. Thư, “Tạo que thử phát hiện nhanh … nguồn nước sinh hoạt.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> hợp dung dịch hạt vàng và kháng thể được ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút<br /> ở 4 oC. Dịch nổi được loại bỏ và thu lại kháng thể đã cộng hợp vàng ở đáy ống. và 500 µl<br /> đệm phosphat 0,01 M, pH 7.4 tiếp tục được bổ sung.<br /> 2.3.6. Phân tích mẫu bằng que thử<br /> Mỗi mẫu phân tích được nhiễm chủ động vi khuẩn V. cholerae với liều lượng khác<br /> nhau trong 100 µl pepton kiềm và được đưa vào giếng ELISA. Sau đó, kháng thể cộng<br /> hợp với hạt vàng được bổ sung một lượng nhất định và cắm que thử vào giếng. Kết quả<br /> phân tích được đánh giá dựa vào việc xuất hiện vạch trên que thử và được coi là dương<br /> tính nếu xuất hiện cả 2 vạch, là âm tính nếu chỉ xuất hiện vạch kiểm chứng và không có<br /> giá trị nếu chỉ xuất hiện vạch thử nghiệm hoặc không có vạch nào xuất hiện [3].<br /> 2.3.7. Xác định ngưỡng phát hiện của que thử<br /> Que thử được nhúng vào các dung dịch có chứa vi khuẩn V. cholerae với nồng độ khác<br /> nhau từ 104 -108 CFU/ml (sử dụng dịch nuôi V. cholerae pha loãng bằng nước cất đã khử<br /> trùng) và 10 µl kháng thể cộng hợp vàng 20 µg/ml. Giá trị thấp nhất mà que thử có thể phát<br /> hiện được chính là ngưỡng phát hiện của que thử. Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 03 lần.<br /> 2.3.8. Xác định độ đặc hiệu của que thử<br /> Đánh giá độ đặc hiệu với một số chủng vi khuẩn chuẩn gây bệnh khác như Samonella,<br /> Shigella, E. coli, Listeria, S. aureus, Klebsiella. Các mẫu vi khuẩn chuẩn được cấy trên<br /> môi trường dịch tương ứng đến nồng độ 106 – 107 CFU/ml. Que thử được nhúng vào 100<br /> l dịch nuôi mỗi loại vi khuẩn và 10 µl kháng thể cộng hợp vàng 20 µg/ml, đọc kết quả sau<br /> 5 phút. Mẫu thử được lặp lại 3 lần. Độ đặc hiệu của que thử được đánh giá thông qua tỷ lệ<br /> các mẫu âm tính đối với các vi khuẩn khác nhau [8].<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Phân lập V. cholerae<br /> Kết quả phân lập bằng môi trường chọn lọc TCBS (Hình 1) cho thấy, cả 3 đĩa thạch<br /> đều thu được khuẩn lạc màu vàng đặc trưng của vi khuẩn V. cholerae. Trong đó, 01 mẫu là<br /> vi khuẩn V. cholerae O1 và 02 mẫu được thu từ môi trường tự nhiên. Tuy nhiên, môi<br /> trường TCBS có cũng cho phép một số vi khuẩn khác phát triển như: Vibrio<br /> parahaemolyticus,Vibrio fischeri, Pseudomonas.... Vì vậy, để khẳng định chắc chắn chủng<br /> vi khuẩn đã được phân lập, khuẩn lạc riêng rẽ trên mỗi đĩa đã được chọn để tiến hành PCR<br /> với mồi 16S và giải trình tự định danh vi khuẩn. Đồng thời, khuẩn lạc cũng được cấy<br /> chuyển và nuôi lỏng trong môi trường pepton kiềm (Do vi khuẩn này chỉ tồn tại trên<br /> TCBS khoảng 1 tuần).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Sự phát triển của vi khuẩn V. cholerae trên môi trường thạch TCBS<br /> (A: Mẫu nước đầm tôm Hải Phòng; B: Mẫu nước thoát cống Hà Nội;<br /> C: Vi khuẩn V. cholerae chuẩn O1).<br /> 3.2. Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn phân lập được<br /> Sản phẩm PCR sau khi được điện di trên gel agarose 1 %, thu được các băng có kích<br /> thước khoảng 1,5 kb tương đương với kích thước gen 16S rRNA của vi khuẩn V. cholerae<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 55, 06 - 2018 149<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> (hình 2). Sau đó, sản phẩm PCR được xác định trình tự nucleotide và so sánh trình tự đó<br /> với dữ liệu trên ngân hàng gen (sử dụng phần mềm Blast của NCBI). Kết quả cho thấy, 2<br /> trong 3 mẫu phân lập được có độ tương là 99% so với<br /> trình tự gen 16S rRNA của V. cholerae trên ngân<br /> hàng gen (NR_044853.1). Trong khi đó, vi khuẩn<br /> được phân lập từ mẫu nước thoát chỉ tương đồng 65<br /> %.<br /> 3.3. Xác định môi trường dùng để tăng sinh tế bào<br /> vi khuẩn V. cholerae<br /> Theo các kết quả nghiên cứu trước đây, ngưỡng<br /> phát hiện của vi khuẩn bằng que thử là từ 106-107<br /> CFU/ml [4,5]. Tuy nhiên, trong các mẫu nước sinh<br /> hoạt, số lượng vi khuẩn tả bị nhiễm thường < 104<br /> CFU/ml. Do đó, để đáp ứng nhu cầu phát hiện vi<br /> khuẩn ngay tại điều kiện hiện trường cần phải nuôi<br /> cấy để tăng sinh số lượng tế bào vi khuẩn này.<br /> Kết quả nuôi tăng sinh cho thấy vi khuẩn này có<br /> Hình 2. Kết quả nhân bản gen<br /> thể phát triển tốt ở cả 03 loại môi trường: LB kiềm,<br /> 16S rRNA của vi khuẩn V.<br /> canh thang kiềm và pepton kiềm, sau 8 giờ nuôi cấy,<br /> cholera.<br /> lượng vi khuẩn V. cholerae trong cả 3 môi trường đều<br /> 6 7 M: Marker 1 kb; 1: Đối chứng<br /> đạt đến 10 -10 CFU/ml.<br /> âm; 2: Vi khuẩn phân lập từ<br /> Theo các nghiên cứu trước, đây là nồng độ mà que<br /> mẫu nước Đầm tôm Hải Phòng;<br /> thử có thể phát hiện được dựa trên nguyên lý sắc ký<br /> 3: Vi khuẩn phân lập từ mẫu<br /> miễn dịch [5]. Tuy nhiên, tại thời điểm 8 giờ, môi<br /> nước thoát Hà Nội; 4: Vibrio<br /> trường pepton kiềm là môi trường có số lượng tế bào<br /> cholerae O1.<br /> vi khuẩn nhiều nhất (hình 3). Trong một số công trình<br /> đã công bố, môi trường chủ yếu được lựa chọn để<br /> nuôi cấy vi khuẩn V. cholerae là cũng pepton kiềm do vi khuẩn này có thể phát triển tốt<br /> trong môi trường nghèo dinh dưỡng có pH từ 8,5-9 [4, 5]. Do đó, chúng tôi lựa chọn môi<br /> trường này để nuôi cấy V. cholerae trong các thử nghiệm tiếp theo.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Kết quả tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae<br /> 3.4. Đánh giá phản ứng giữa V. cholerae- kháng thể bằng phương pháp ELISA<br /> Kết quả phân tích phản ứng giữa V. cholerae - kháng thể bằng phương pháp ELISA<br /> cho thấy, cả hai giếng ủ V. cholerae với kháng thể đơn dòng đều xuất hiện màu vàng và có<br /> số đọc A450 tương ứng là 0,352 và 0,245 (hình 4), trong khi mẫu âm cho tín hiệu rất thấp.<br /> Điều này chứng tỏ, hai loại kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae là KT1 và KT2 đều có<br /> khả năng bắt cặp với vi khuẩn này và đồng thời bắt cặp với kháng thể KT3. Vì vậy, KT3<br /> <br /> <br /> 150 T.T.T. Quỳnh, …, N.T.T. Thư, “Tạo que thử phát hiện nhanh … nguồn nước sinh hoạt.”<br /> Nghiên ccứu<br /> ứu khoa học công nghệ<br /> <br /> có th<br /> thểể đđư<br /> ược<br /> ợc dùng<br /> dùng làm kháng th thểể kiểm chứ<br /> chứng.<br /> ng. Tuy nhiên, đđểể lựa chọn chính xác KT1 ddùng<br /> ùng<br /> làm kháng th thểể cộng hợp vvàà KT2 dùng làm kháng th thểể bắt giữ hoặc ng<br /> ngược<br /> ợc lại, chúng tôi đđãã<br /> tiến<br /> ến hhành<br /> ành đđồng<br /> ồng thời cả hai tr ờng hợp để kiểm tra.<br /> trường<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4.4 Kếtết quả ELISA<br /> ELISA..<br /> Gi<br /> Giếng<br /> ếng 1: Đối chứng âm; Giếng 2: Vibrio choleracholera-KT1<br /> KT1-KT3;<br /> KT1 KT3;<br /> Giếng<br /> Giếng 3: Vibrio cholerae-KT2<br /> cholerae KT2-KT3.<br /> KT2 KT3.<br /> 3.5. Ngưỡng<br /> Ngưỡng phát hiện của que thử<br /> Sau khi ttạo<br /> ạo đ<br /> đư<br /> ược<br /> ợc 2 loại que thử: Loại1 (d (dùng<br /> ùng KT1 làm kháng th thểể cộng hợp vvàà KT2 làm<br /> kháng thể<br /> thể bắt giữ) vvàà lo<br /> loại<br /> ại 2 (ngư<br /> (ngược<br /> ợc lại so với qque<br /> ue thử<br /> thử loại 1), chúng tôi đđãã tiến<br /> tiến hhành<br /> ành đánh<br /> khảả năng phát hiện vi khuẩn V. cholerae của<br /> giá kh ủa 2 loại que thử nnày.<br /> ày. Kết<br /> Kết quả cho thấy, cả<br /> hai loại que thử đều có khả năng phát hiện vi khuẩn V. cholerae<br /> loại cholerae.. Tuy nhiên, que th thử<br /> ử loại 1<br /> 5<br /> cho phép phát hi hiện<br /> ện ở ngngưỡng<br /> ỡng nồng độộ 10 CFU/ml ((h hình<br /> ình 5), trong khi que th ử loại 2 chỉ<br /> thử<br /> phát hi ện đến 106 CFU/ml, th<br /> hiện thời<br /> ời gian phát hiện từ 22-5 5 phút ((hình<br /> ình 6). Kếtết quả nnày<br /> ày phù hhợpợp<br /> với<br /> ới kết quả tăng sinh tế bbào khuẩn V. cholerae,<br /> ào vi khuẩn cholerae, sau 6-8<br /> 6 8 gi<br /> giờờ nuôi cấy số llượng<br /> ợng tế bbào<br /> ào đđạt<br /> ạt<br /> được từ 106-<br /> được 6<br /> 108 CFU/ml<br /> CFU/ml.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 55. Kết<br /> ết quả đánh giá ng<br /> ngưỡng<br /> ỡng phát hiện của que thử loại 1 ((dùng<br /> dùng KT1 làm kháng th<br /> thểể<br /> cộng<br /> ộng hợp vvà<br /> à KT2 làm kháng th<br /> thểể bắt giữ)<br /> giữ).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 66. Kết<br /> ết quả đánh giá ng<br /> ngưỡng<br /> ỡng phát hiện của que thử loại 2 ((dùng<br /> dùng KT2 làm kháng th thểể<br /> cộng<br /> ộng hợp vvà<br /> à KT1 làm kháng th<br /> thểể bắt giữ)<br /> giữ).<br /> ết quả phát triển que thử phát hiện nhanh vi khuẩn V. cholerae của<br /> Kết của chúng tôi cũng<br /> khá tương đđồng<br /> ồng với kết quả nghi<br /> nghiên<br /> ên của<br /> của khác, Chakraborty vvàà ccộng<br /> ộng sự, đđãã tạo<br /> tạo th<br /> thành<br /> ành công<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp<br /> ạp chí Nghi<br /> Nghiên<br /> ên cứu<br /> cứu KH&CN quân<br /> uân sự,<br /> sự, Sốố 555, 066 - 2018<br /> 2018 151<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> que thử có ngưỡng phát hiện là 107 CFU/ml sau 24 h nuôi cấy [4]; Amanda Debes và cộng<br /> sự đã tạo thành công que thử có ngưỡng phát hiện là 106 CFU/ml đối với chủng V.<br /> cholerae O1 và 107 CFU/ml đối với chủng V. cholerae O139 sau 5-8 giờ nuôi cấy, thời<br /> gian phát hiện 5-10 phút [5].<br /> 3.6. Độ đặc hiệu của que thử<br /> Độ đặc hiệu của que thử là khả năng có phản ứng chéo với các vi khuẩn khác. Các vi<br /> khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu của que thử là một số vi khuẩn<br /> gây bệnh như Salmonella, Shigella, Listeria, Klebsiella, S. aureus và E. coli. Kết quả về<br /> độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae được trình bày trên bảng 1 và hình 7.<br /> Bảng 1. Độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae.<br /> Số que thử dương tính (3 lần lặp lại) Sal Shi Lis Kleb E.coli Stap<br /> <br /> Chủng<br /> Salmonella<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Klebsiella<br /> <br /> <br /> S. aureus<br /> Shigella<br /> <br /> Listeria<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> E. coli<br /> <br /> <br /> Que thử V. 0/3 Hình 7. Kết quả đánh giá<br /> 0/3 0/3 0/3 1/3 0/3 độ đặc hiệu của que thử<br /> cholerae<br /> phát hiện V. cholera.<br /> Kết quả trình bày trên bảng 1 cho thấy với 18 que thử phát hiện V. cholerae về khả<br /> năng phản ứng chéo với các vi khuẩn khác (3 que/loại vi khuẩn), có 1 que cho kết quả<br /> dương tính với vi khuẩn Klebsiella, 17 que cho kết quả âm tính. Từ đó, có thể xác định độ<br /> đặc hiệu kỹ thuật của que thử trong thử nghiệm này là 17/18 = 0,94 tương đương 94%.<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được 01 chủng vi khuẩn V. cholerae từ mẫu<br /> nước đầm tôm ở Hải Phòng, lựa chọn được môi trường peton kiềm thích hợp cho việc tăng<br /> sinh của vi khuẩn V. cholerae sau 8 giờ nuôi cấy, số lượng tế bào vi khuẩn có thể lên đến<br /> 106-107 CFU/ml.Chúng tôi đã bước đầu chế tạo thành công que thử và đánh giá được<br /> ngưỡng phát hiện là 105 CFU/ml trong 2-5 phút. Độ đặc hiệu của que thử với một số vi<br /> khuẩn gây bệnh khác là 94%.<br /> Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu khoa<br /> học thuộc chương trình AN-QP Thành phố Hồ Chí Minh năm 2015: "Nghiên cứu chế tạo kit phát<br /> hiện nhanh một số vi sinh vật gây bệnh đường ruột trong nguồn nước sinh hoạt, ứng dụng cho bộ<br /> đội đóng quân trên đảo và lực lượng tàu ngầm".<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Hà Thị Quyến, (2006), “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc định typ vi<br /> khuẩn Vibrio cholerae phân lập ở Việt Nam”, Luận án tiến sĩ sinh học. Viện Công<br /> nghệ sinh học.<br /> [2]. Hà Thị Quyến, Dương Hồng Quân, Đinh Duy Kháng, Phùng Đắc Cam, (2005),<br /> “Nghiên cứu chế tạo bộ kit để phát hiện nhanh vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) trong<br /> nước”, Tạp chí Sinh học, 27(4), 57-60.<br /> [3]. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2015), “Nghiên cứu<br /> phát triển hệ thống sắc ký miễn dịch cạnh canh phát hiện các độc tố ruột tụ cầu<br /> trong sữa”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, ĐHQGHN.<br /> [4]. Chakraborty S., Alam M., Scobie H.M., Sack D.A. (2013), “Adaptation of a simple<br /> <br /> <br /> 152 T.T.T. Quỳnh, …, N.T.T. Thư, “Tạo que thử phát hiện nhanh … nguồn nước sinh hoạt.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> dipstick test detection of Vibrio cholerae O1 and O139 in environmental water”,<br /> Frontiers in Microbiology, 4(320), 1-3.<br /> [5]. Debes A., Chakraborty S., Ali M., Sack D.A.(2014), “Manual for detecting Vibrio<br /> cholerae O1 and O139 from Fecal sample and from environmental water using a<br /> dipstick assay” from the DOVE Project,based in the Department of International<br /> Health, JohnsHopkins Bloomberg School of Public Health.<br /> [6]. Huq A., Haley B.J., Taviani E., Chen A., Hasan N.A., Colwell R.R. (2012),<br /> “Detection, Isolation, and Identification of Vibrio cholerae from the<br /> Environment”, Current Protocols in Microbiology, chapter: Unit6A.5.<br /> [7]. Howard-Jones N. (1984), "Robert Koch and the cholera vibrio: a<br /> centenary". BMJ. 288 (6414): British Medical Journal. 288 (6414): 379-81.<br /> [8]. Sun Z., Bai X., Chen X., McCrae D., Saaki E. (2013), “A simple, specific and rapid<br /> lateral-flow immunochromatographic test method for detection of Legionella<br /> pneumophila in water samples”, International Conference on Biology Environment<br /> and Chemistry. IPCBEE vol 58, 125-130.<br /> [9]. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillie, J. (1951), “A study of the nucleation and<br /> growth processes in the synthesis of colloidal gold”, Discussion of the. Faraday<br /> Society, 55-75.<br /> [10]. http://www.wpro.who.int/mediacentre/factsheets/fs_28082012_Cholera/en/<br /> <br /> ABSTRACT<br /> PRODUCTION OF LATERAL TEST TRIPS<br /> FORDETECTION OF Vibrio cholerae IN WATER<br /> Vibrio cholerae also called cholera is one of the most common causes of acute<br /> diarrhea infection. This bacterium spreads rapidly through water and food, and<br /> even can cause disease outbreaks on wide areas in short time. Every year, there are<br /> about 3-5 millions infected cases and 100,000 to 120,000 deaths due to cholera<br /> attack in the world. In this study, we cultivated V. cholerae on three media including<br /> alkaline peptone, alkaline broth and alkaline LB and found that the alkaline peptone<br /> was the most suitable medium for growth of V. cholerae, up to 106-107 CFU/ml<br /> could be obtained after 6-8 hours. We also successfully made test strips for quick<br /> dectetion of V. cholerae. The strips consisted of nitrocellulose membrane and<br /> absorbent pad, mouse anti-Vibrio cholerae monoclonal IgG (as primary antibodies)<br /> at a concentration of 0.3 μg/mm and goat anti-mouse IgG conjugated with<br /> horseradish peroxidase (as secondary antibodies) at a concentration of 0.2 μg/mm.<br /> The obtained results showed that the test strips allowed to detect Vibrio cholerae in<br /> water at concentrations ≥ 105 CFU/ml for 2-5 minutes. The specificity of test trips<br /> was 94%.<br /> Keywords: Cholera; Immumochromatography; Quickly detect; Vibrio cholerae, Test trip.<br /> <br /> Nhận bài ngày 24 tháng 8 năm 2017<br /> Hoàn thiện ngày 25 tháng 12 năm 2017<br /> Chấp nhận đăng ngày 08 tháng 6 năm 2018<br /> 1<br /> Địa chỉ: Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học và công nghệ quân sự;<br /> 2<br /> Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.<br /> *<br /> Email: tranthithanhquynhk55b2@gmail.com.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 55, 06 - 2018 153<br />