Tạp chí khoa học: Dịch chiết Hồ tiêu (Piper nigrum L.) ức chế hoạt động của thụ thể neurokinin-1 (NK-1R) được kích thích bởi chất P (substance P) ở tế bào lympho chuột

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 13-17<br /> <br /> D ch chi t H tiêu (Piper nigrum L.) c ch ho t ng c a th th neurokinin-1 (NK-1R) ư c kích thích b i ch t P (substance P) t bào lympho chu t<br /> Tr nh T t Cư ng1,*, Giang Huy Di m2, Tr n Trung oàn2, Ph m Thanh Huy n3, inh oàn Long1,4<br /> Phòng thí nghi m tr ng i m Công ngh enzyme-protein, Trư ng i h c Khoa h c T nhiên, 334 Nguy n Trãi, Thanh Xuân, Hà N i, Vi t Nam 2 Khoa Sinh h c, Trư ng i h c Khoa h c T nhiên, 334 Nguy n Trãi, Thanh Xuân, Hà N i, Vi t Nam 3 Khoa Tài nguyên Dư c li u, Vi n Dư c Li u, 3B Quang Trung, Hoàn Ki m, Hà N i, Vi t Nam 4 Khoa Y Dư c, i h c Qu c Gia Hà N i, 144 Xuân Th y, C u Gi y, Hà N i, Vi t Nam<br /> Nh n ngày 01 tháng 12 năm 2013 Ch nh s a ngày 08 tháng 01 năm 2014; ch p nh n ăng ngày 24 tháng 3 năm 2014<br /> 1<br /> <br /> Tóm t t. Trong nghiên c u này, chúng tôi ch ng minh ch t P (SP), ph i t c hi u th th NK1R, thúc y t bào lympho chu t gi i phóng cytokine interferon-gamma (IFN-γ) trong i u ki n invitro. Ngoài ra, SP kích thích (ho c ít nh t làm tăng) s bi u hi n c a th th này t bào nuôi c y. D ch chi t mêtanol h t H tiêu (Piper nigrum L.) c ch m nh ho t ng c a th th NK-1R ư c ho t hóa b i SP cho th y th th này có th là ích tác ng c a thành ph n nào ó có trong d ch chi t, m c dù có th không liên quan n capsaicin qua con ư ng truy n tin c a th th vanilloid lo i 1 (TRPV1) v n ã bi t trư c ây. Thành ph n nào trong d ch chi t H tiêu có ho t tính i kháng ( i v n) th th NK-1R c n ư c ti p t c quan tâm nghiên c u. T khóa: Th th neurokinin-1 (NK-1R), Ch t P (Substance P - SP), Capsaicin, H tiêu (Piper nigrum L.), Ch t i kháng th th .<br /> <br /> 1.<br /> <br /> tv n<br /> <br /> ∗<br /> <br /> Th th neurokinin-1 (NK-1R) thu c nhóm các th th xuyên màng liên k t v i G-protein, bi u hi n m nh nh t khu v c não b và có m t các t bào c a h th ng mi n d ch [1]. Ch t P (SP) là ph i t có ái l c c hi u v i NK-1R. Khi k t c p v i SP, NK-1R kích thích<br /> <br /> _______<br /> ∗<br /> <br /> Tác gi liên h . Tel: 84-0984814776. E-mail: cuongtrinhtat@gmail.com<br /> <br /> quá trình truy n tin trong t bào d n t i i u hòa c m giác au t vùng th n kinh ngo i vi v h th n kinh trung ương, gây ra các tr ng thái lo âu và các tri u ch ng tr m c m, ngoài ra cũng gây tác d ng kích thích co cơ trơn và nh hư ng n i u hòa ph n ng mi n d ch c a cơ th [2]. Ngoài ra, NK-1R khi ho t hóa còn gây các tín hi u áp ng viêm trên m t s mô hình chu t b viêm do nhi m trùng [3]. Theo nghiên c u g n ây, NK-1R tr ng thái ho t hóa thúc 13<br /> <br /> 14<br /> <br /> T.T. Cường và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 13-17<br /> <br /> y t bào lympho (lymphocyte) ti t interferon gamma (IFN-γ) [3]. Capsaicin ư c tách chi t t H tiêu (Piper nigrum L.), t (Capsicum frutescens L.) … ư c bi t có tác d ng gi m au th n kinh sau khi k t c p v i th th TRPV1 thông qua thúc y gi i phóng SP [4]. tìm hi u d ch chi t H tiêu ư c gi thi t có ch a capsaicin có tác ng tr c ti p n th th NK-1R hay không, chúng tôi ti n hành xây d ng i u ki n k thu t cho phép ánh giá s bi u hi n ch c năng c a th th NK-1R t bào lympho chu t do tác ng c a ph i t SP và kh năng nh hư ng c a d ch chi t dư c li u t cây H tiêu n con ư ng truy n tin này. K t qu nghiên c u cho th y, d ch chi t H tiêu không làm tăng ho t ng c a th th NK-1R như d oán và thay vào ó c ch ho t ng c a nó. Như v y, có th trong H tiêu, ngoài capsaicin, còn ch a các thành ph n nào ó có tác ng n ho t ng c a th th NK-1R ư c ho t hóa b i SP theo cơ ch i kháng (antagonist).<br /> <br /> Tách và nuôi t bào lympho: T bào ư c tách t huy t thanh chu t b ng kit Ficoll-paque PLUS theo quy trình c a hãng. T bào sau ó ư c nuôi trong RPMI 1640 ch a 10% FBS. Phân tích ELISA: T bào lympho ư c x lý r i phân tích b ng ELISA như mô t trư c ây [5]. Cytokine IFN-γ mà t bào ti t ra ư c nh lư ng b ng ELISA. Các bư c phân tích ư c th c hi n theo ch d n c a nhà s n xu t (BD Biociences). Western Blot: T bào lympho ư c x lý và phân tích Western Blot như mô t trư c ây [5]. Kháng th kháng NK-1R ư c pha loãng v i t l 1:1000. Màng chuy n protein ư c phát hi n b ng Chemiluminescence (ECL, GE HealthCare). Th ho t tính sinh h c: D ch chi t mêtanol dư c li u có n ng khác nhau (t 0 n 40 g/ml) ư c b sung vào môi trư ng nuôi c y t bào v i v i th tích không quá 5%. i ch ng ư c b sung cùng th tích dung môi nhưng không ch a d ch chi t dư c li u. Cytokine ư c so sánh gi a các lô i ch ng và các lô thí nghi m. Thu th p s li u và x lý th ng kê: S li u ư c thu t 3 thí nghi m l p l i c l p, ư c bi u hi n b ng giá tr trung bình ± phương sai tiêu chu n (±SD) và ư c phân tích b ng Student’s T-test v i i u ch nh Bonferroni ho c ANOVA. S khác nhau có ý nghĩa thông kê v i P < 0,05.<br /> <br /> 2. V t li u và phương pháp i tư ng và v t li u: Chu t nh t tr ng (Mus musculus) dòng Swiss ư c mua t Vi n V sinh D ch t Trung ương. Kit tách t bào lympho Ficoll-paque PLUS c a GE-Health care (M ); ch t P (SP), aprepitant (AP, là ch t c ch NK-1R), kháng th kháng NK-1R ư c mua t Sigma ( c); kit ELISA IFN-γ ư c mua t BD Biociences (M ); môi trư ng RPMI 1640, FBS, kháng sinh ư c mua t InvitrogenTM (Life Technologies, Singapo); ĩa ELISA 24 gi ng và 96 gi ng ư c mua t Corning (M ). Dư c li u ư c Khoa Tài nguyên Dư c li u, Vi n Dư c li u cung c p trong khuôn kh tài c l p c p nhà nư c mã s PTNT 2011-G/04.<br /> <br /> 3. K t qu và bàn lu n 3.1. SP kích thích t bào lympho tăng ti t IFN-γ Công b trư c ây [2] cho th y SP có kh năng kích ho t NK-1R trong t bào lympho thúc y s n sinh IFN-γ. Do v y, kh ng nh<br /> <br /> T.T. Cường và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 13-17<br /> <br /> 15<br /> <br /> l i kh năng kích thích sinh IFN-γ c a SP, t bào lympho chu t ã ư c tách và nuôi v i SP n ng 10-4 mM qua các kho ng th i gian khác nhau là 0, 8, 18, 24 và 48 gi . Sau ó, t bào t d ch nuôi ư c thu l i b ng ly tâm và IFN-γ ti t ra ư c nh lư ng b ng ELISA. K t qu thí nghi m (Hình 1) cho th y dư i tác d ng c a SP, lư ng IFN-γ sinh ra tăng d n trong ngày u tiên và t t i a sau kho ng 24 gi nuôi c y. ây là th i i m t bào nuôi ư c l a ch n nh lư ng cytokine IFN-γ trong các thí nghi m ti p theo.<br /> <br /> kDa (v trí mũi tên), thì các t bào lympho ư c x lý v i SP các n ng thí nghi m trong -4 2 kho ng 10 n 10 mM (các làn i n di 1 - 7) u cho băng này. ây chính là kích thư c phân t c a protein mong i NK-1R.<br /> 1 2 3 4 5 6 7 8 M 225 130 97 76 Kích thư c protein (kDa)<br /> <br /> 52<br /> <br /> 10 2<br /> <br /> 10 1<br /> <br /> 10 0<br /> <br /> 10 - 1<br /> <br /> 10 - 2<br /> <br /> 10 - 3<br /> <br /> 10 - 4<br /> <br /> N ng đ ph i t<br /> <br /> SP (mM)<br /> <br /> 0 ( C)<br /> <br /> Hình 2. T bào lympho bi u hi n NK-1R do kích thích c a ph i t SP. V trí mũi tên (58 kDa) là kích thư c phân t c a NK-1R; các làn 1–7: các t bào ư c x lý v i SP n ng khác nhau, làn 8: i ch ng (không x lý v i SP), M: thang kích thư c protein (marker).<br /> M 1 2 3 4 5 6 7<br /> <br /> Hình 1. Ph i t SP kích thích t bào lympho s n sinh IFN-γ. Trong thí nghi m, 5x105 t bào ư c v i 10-4mM ph i t . IFN-γ qua th i gian ư c nh lư ng b ng ELISA.<br /> <br /> 3.2. Ph i t SP kích thích tăng bi u hi n c a th th NK-1R trên t bào lympho ánh giá s bi u hi n th th NK-1R trên t bào lympho có ư c kích thích b i SP, các t bào lympho ã ư c v i SP các n ng tăng d n t 0 n 102 mM (v i các b c pha loãng như mô t Hình 2), r i sau ó ph c h protein ư c phân tích b ng i n di trên gel SDS-PAGE. K t qu thí nghi m (Hình 2) cho th y: n u như các t bào lympho i ch ng (không ư c v i SP; làn i n di s 8 trên hình) không cho băng protein có kích thư c 58<br /> 10 2 10 1 10 0 10 - 1 10 - 2 10 - 3 10 - 4 N ng đ ph i t SP (mM)<br /> <br /> Hình 3. Xác nh th th NK-1R b ng Western Blot. Các làn 1–7: các t bào ư c x lý v i SP n ng khác nhau t 10-4 n 102 mM, M: h n h p protein trong thang kích thư c (marker).<br /> <br /> Tuy v y, kh ng nh ch c ch n protein 58 kDa là NK-1R, các t bào lympho sau khi ư c v i SP các n ng khác nhau ã ư c thu protein và phân tích Western blot v i<br /> <br /> 16<br /> <br /> T.T. Cường và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 13-17<br /> <br /> kháng th kháng NK-1R như mô t ph n phương pháp. K t qu trên Hình 3 cho th y các t bào ư c v i SP các n ng t 10-4 n 102 mM u cho m t băng duy nh t. i u này kh ng nh chính xác protein 58 kDa thu ư c là NK-1R và SP ã kích thích th th NK-1R bi u hi n và ho t ng trên t bào lympho chu t trong nuôi c y invitro. T k t qu nghiên c u này có th nh n nh ph i t SP kích thích (ho c ít nh t làm tăng) s bi u hi n c a th th NK-1R trên t bào lympho chu t nuôi c y invitro. S kích thích này thu ư c ngay n ng SP th p nh t trong thí nghi m là 10-4mM. 3.3. D ch chi t H tiêu c ch ho t ng c a th th NK-1R trên t bào lympho ư c kích thích b i ph i t SP ánh giá kh năng tác ng c a d ch chi t H tiêu lên NK-1R, t bào lympho ư c v i AP (ch t c ch NK-1R) n ng 10-2mM trong 24 gi làm i ch ng dương ( C(+)). Sau ó, các t bào ư c v i AP ho c không ( C (−)) ư c k ti p v i SP n ng 10-4 mM ho c v i d ch chi t H tiêu các n ng 10, 20, 30 và 40 µg/ml (dư c li u khô/dung môi) trong 24 gi (xem mô t các phương th c thí nghi m Hình 4). D ch t bào thu ư c sau ó ư c phân tích b ng ELISA ánh giá kh năng sinh IFN-γ. K t qu trên hình 4 cho th y, vi c b sung SP rõ ràng làm tăng sinh IFN-γ t 116 pg/ml ( C (−)) lên 644 pg/ml ( C (+)); tuy v y, n ng IFN-γ gi m rõ r t khi d ch nuôi ư c b sung ch t c ch NK-1R là aprepitant (AP). N ng IFN-γ lúc này gi m ch còn 276 pg/ml. Vi c b sung d ch chi t H tiêu vào t bào lympho khi v ng m t SP không làm tăng áng k s ti t IFN-γ so v i i ch ng ( C (−)) có th ư c gi i thích do s bi u hi n y u c a NK-1R dòng t bào này khi thi u v ng ph i t . i u này ng th i kh ng nh s tăng gi m<br /> <br /> n ng IFN-γ ư c ti t ra trong phép th ư c thi t l p ch y u ư c i u hòa qua NK-1R.<br /> <br /> Hình 4. S c ch sinh IFN-γ c a d ch chi t H tiêu tác ng qua th th NK-1R t bào lympho chu t nuôi c y invitro. C (-)= T bào không ư c x lý,<br /> C (+)= D ch t bào ư c b sung SP (10-4mM), AP = aprepitant (ch t c ch NK-1R) ư c b sung n ng 10-2mM, SP = substance P (ph i t c hi u NK-1R) ư c b sung n ng 10-4mM, d ch chi t=d ch chi t methanol H tiêu n ng khác nhau (10 – 40 µg/ml).<br /> <br /> Tuy v y, khi các t bào lympho ng th i ư c x lý v i ph i t SP và v i n ng tăng d n c a d ch chi t H tiêu t 0 ( C (+)) lên 10, 20, 30 và 40 g/ml thì lư ng IFN- γ sinh ra gi m rõ r t tương ng t 644 xu ng 496, 451, 361 và 306 pg/ml. T k t qu này, có th xác nh d ch chi t H tiêu có kh năng c ch quá trình ho t ng c a NK-1R. Vì capsaicin ư c cho có th thúc y ho t ng c a th th NK-1R do kích thích s n sinh SP thông qua ho t hóa con ư ng truy n tin c a th th TRPV1 [4], nhưng trong nghiên c u này d ch chi t H tiêu c ch m nh ho t ng c a NK-1R cho th y ho t ng c ch th th NK-1R có th không liên quan n capsaicin thông qua con ư ng TRPV1. ng th i, k t qu nghiên c u cho th y, có l trong d ch chi t H tiêu ã ch a h p ch t nào ó c ch m nh ho t ng c a th th NK-1R theo cơ ch i kháng (antagonist). xác nh b n ch t hóa h c thành ph n i kháng th th NK1R H tiêu (Piper nigrum L.) c n có nh ng nghiên c u b sung.<br /> <br /> T.T. Cường và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 13-17<br /> <br /> 17<br /> <br /> 4. K t lu n Chúng tôi ã thi t l p ư c mô hình ánh giá kh năng tương tác c a các d ch chi t dư c li u v i th th NK-1R trên t bào lympho chu t nuôi c y invitro thông qua o kh năng sinh IFN-γ ư c kích thích b i ph i t c hi u th th là SP (substance P). S sinh IFN-γ trong t bào lympho chu t khi ư c kích thích b i SP ch y u là do ho t ng truy n tín hi u c a th th NK-1R. D ch chi t dư c li u t cây H tiêu (Piper nigrum L) c ch m nh ho t ng c a NK-1R ư c ho t hóa b i SP cho th y nhi u kh năng dư c li u này ch a dư c ch t tác ng lên th th NK-1R theo cơ ch i kháng. L i c m ơn Chúng tôi trân tr ng c m ơn s tài tr c a B Khoa h c và Công ngh (Vi t Nam) cho tài PTNT .2011-G/04 th c hi n nghiên c u này.<br /> <br /> Tài li u tham kh o<br /> [1] Cook GA, Elliott D, Metwali A, Blum AM, Sandor M, Lynch R, Weinstock JV (1994). Molecular evidence that granuloma T lymphocytes in murine schistosomiasis mansoni express an authentic substance P (NK-1) receptor. J. Immunol.152, 1830-5. Beinborn M, Blum A, Hang L, Setiawan T, Schroeder JC, Stoyanoff K, Leung J, Weinstock JV. TGF-beta regulates T-cell neurokinin-1 receptor internalization and function (2010). Proc Natl Acad Sci USA. 107(9): 4293-8. Baker SJ, Morris JL, Gibbins IL (2003). Cloning of a C-terminally truncated NK-1R from guinea-pig nervous system. Brain Res Mol Brain Res. 11(1-2): 136-47. Arpad S, Peter MB (1999). Vanilloid (Capsaicin) Receptors and Mechanisms. Pharmacol Rev, 51(2): 159-212. Chul-Su Y, Sung-Ryong K, Byung-Goo C, Dong-Min S, Jae-Min Y, Sheng- Jin L, Jin-Man K, Evans RM, Jun-Sub J, Dong-Keun S, EunKyeong (2008). The ginsenoside metabolite compound K, a novel agonist of glucocorticoid receptor, induces tolerance to endotoxininduced lethal shock. J. Cell. Mol. Med, 12 (1): 1-17.<br /> <br /> [2]<br /> <br /> [3]<br /> <br /> [4] [5]<br /> <br /> Methanolic Extracts of Pepper (Piper nigrum L.) Inhibits Substance P-Induced Activation of Neurokinin 1 Receptor (NK-1R) in Murine Lymphocytes<br /> Tr nh T t Cư ng1, Giang Huy Di m2, Tr n Trung oàn2, Ph m Thanh Huy n3, inh oàn Long1,4<br /> 1<br /> <br /> Key Lab for Enzyme-Protein Technology, VNU University of Science, 334 Nguy n Trãi, Hanoi, Vietnam 2 Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguy n Trãi, Hanoi, Vietnam 3 Department of Medicinal Resources, Institute of Medicinal Materials, 3B Quang Trung, Hanoi, Vietnam 4 School of Medicine and Pharmacy, Vietnam National University, 144 Xuân Th y, C u Gi y, Hanoi, Vietnam<br /> <br /> Abstract: In this study, we demonstrated Subtance P (SP) induced the release of interferongamma (IFN-γ) from murine lymphocytes under invitro conditions. Moreover, SP stimulated the expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) on lymphocytes. Methanolic extracts derived from pepper (Piper nigrum L.) seeds inhibited potently SP-induced activity of NK-1R suggested that these receptors might be the target sites for certain constitutents of pepper extracts, though may not associate with capsaicin via TRPV1 pathway. What constituents in pepper extracts that might provoke antagonistic activity of on NK-1R may be another topic for further pharmacological studies of Piper nigrum L. Keywords: Neurokinin-1 Receptor, Substance P, Capsaicin, Pepper (Piper nigrum L.), Antagonist.<br /> <br />