Thí nghiệm bất động tế bào thực vật

Chia sẻ: Nguyen AAA | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

100
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nguyên liệu - 30 mL tế bào dịch huyền phù thuốc lá sinh trưởng bằng phương pháp đã mô tả trong thí nghiệm trước. - Alginate - CaCl2 - Bơm nhu động - Nồi áp suất - Cân hóa chất 2. Phương thức tiến hành - Trộn 0,875 g alginate, 5 mL môi trường nuôi cấy thực vật và 25 mL nước và khử trùng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thí nghiệm bất động tế bào thực vật

Thí nghiệm bất động tế bào thực vật 1. Nguyên liệu - 30 mL tế bào dịch huyền phù thuốc lá sinh trưởng bằng phương pháp đã mô tả trong thí nghiệm trước. - Alginate - CaCl2 - Bơm nhu động - Nồi áp suất - Cân hóa chất 2. Phương thức tiến hành - Trộn 0,875 g alginate, 5 mL môi trường nuôi cấy thực vật và 25 mL nước và khử trùng. - Đợi cho 30 mL dịch nuôi cấy huyền phù của tế bào thực vật lắng xuống, loại bỏ thể nổi. Bước này thường mất khoảng 10 phút. - Bổ sung hỗn hợp alginate và trộn với các tế bào đã được cô lại. - Bơm hỗn hợp alginate-tế bào qua một ống silicon vô trùng (1,6 mm ID) và cung cấp từng giọt vào trong bình tam giác chứa 200 mL dung dịch vô trùng
của CaCl2 0,12 M. Các giọt nhỏ sẽ phản ứng ngay lập tức với CaCl2 để tạo ra các hạt hình cầu có đường kính khoảng 3,75-4,5 mm. - Giữ các hạt trong dung dịch CaCl2 khoảng 1 giờ để đảm bảo phản ứng kết tủa đã xảy ra hoàn toàn. - Cấy vào bình tam giác chứa 30 mL môi trường thực vật với khoảng 30 hạt tế bào thực vật đã được bất động và đặt nó trong tủ nuôi tế bào thực vật có máy lắc và lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ nuôi 27oC, chiếu sáng 8giờ/ngày ở cường độ 2.000 lux. - Chúng ta có thể xác định nồng độ tế bào khô và ẩm của các tế bào tự do trong dịch huyền phù và các tế bào được bất động trong suốt quá trình nuôi cấy mẻ. Để xác định nồng độ tế bào của các tế bào được bất động, cần phải hòa tan các hạt trong potassium phosphate 1 M trong 24 giờ.
Thí nghiệm đường cong sinh trưởng của tế bào thực vật 1. Nguyên liệu - Một dòng tế bào dịch huyền phù của thực vật sinh trưởng tốt. Phương thức sau đây dựa trên cơ sở nuôi cấy tế bào thuốc lá. Nếu chọn dòng tế bào khác thì cần thay đổi môi trường. - Hỗn hợp muối khoáng của Murashige-Skoog (1962) (Bảng 7.2), 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), KH2PO4, inositol, thiamine.HCl, và sucrose để pha chế môi trường. - Hai bình tam giác 125 mL - Pipette loại miệng rộng vô trùng (10 mL) - Tủ nuôi tế bào thực vật kèm máy lắc - Cân hóa chất - Ly tâm - Eppendorf tube
2. Phương thức tiến hành - Chuẩn bị môi trường muối khoáng của Murashige-Skoog, 0,2 mg/L 2,4-D, 0,18 g/L KH2PO4, 0,1 g/L inositol, 1 mg/L thiamine.HCl và 30 g/L sucrose. Điều chỉnh pH tới 5,8 bằng KOH 1N và phân phối môi trường vào hai bình tam giác loại 125 mL, sao cho mỗi bình tam giác chứa 30 mL. - Đậy nắp bình tam giác và khử trùng ở 121oC trong 20 phút. - Cấy vào bình tam giác chứa 30 mL môi trường với 1,5 mL của dịch huyền phù tế bào 7 ngày tuổi và đặt trong tủ nuôi tế bào thực vật có máy lắc và lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ nuôi 27oC, chiếu sáng 8 giờ/ngày ở cường độ 2.000 lux. - Lấy 1,5 mL dịch nuôi cấy mỗi ngày đã được trộn kỹ và cho vào Eppendorf tube để cân, ly tâm tube ở 9.000 vòng/phút trong 4-5 phút và loại thể nổi. Cân lại tube và tính toán phần trăm trọng lượng tế bào ẩm. Đặt tube trong tủ sấy ở 70oC trong hai ngày và cân lại để tính toán trọng lượng khô. - Vẽ đồ thị sự thay đổi nồng độ tế bào khô và tươi (ẩm) theo thời gian.
Thí nghiệm đường cong sinh trưởng của nấm men Trong thí nghiệm này, chủng nấm men sẽ được nuôi cấy trong bình tam giác thuỷ tinh, và sự thay đổi nồng độ tế bào sẽ được kiểm soát bằng cách dùng ba kỹ thuật khác nhau: đếm dưới kính hiển vi, xác định khối lượng khô, độ đục của dịch huyền phù tế bào. 1. Nguyên liệu - Một chủng nấm men bất kỳ sinh trưởng trong nuôi cấy dịch huyền phù. Chúng ta có thể thu chủng nấm men từ một phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc mua một chủng đặc biệt từ công ty. - Glucose, dịch chiết nấm men, NH4Cl, MgSO4, CaCl2 và chất chống tạo bọt để pha môi trường. - Hai bình tam giác 125 mL - Pipette vô trùng - Đèn Bunsen - Nồi khử trùng - Tủ ấm - Hemocytometer - Ly tâm - Cân hóa chất
- Máy quang phổ 2. Phương thức tiến hành - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường sinh trưởng đặc trưng của nấm men: - Glucose: 100g - Dịch chiết nấm men: 8,5g - NH4Cl : 1,32g - MgSO4 : 0,11g - CaCl2 : 0,06g - Chất chống tạo bọt: 0,2 ml - Nước bổ sung vừa đủ :1 L - Rót 50 mL/bình vào 2 bình tam giác loại 125 mL. - Nút bình tam giác bằng một trong số vật liệu sau: giấy nhôm, nút plastic chịu nhiệt, nắp inox, hoặc bông không thấm nước. - Khử trùng bình tam giác đựng môi trường ở 121oC trong 20 phút. - Tiếp mẫu (inoculate) 1 mL dịch nuôi cấy nấm men trước đó vào bình tam giác chứa môi trường vô trùng. Tiến hành cẩn thận để khỏi bị nhiễm bẩn pipette, nắp đậy và bình tam giác trong suốt quá trình tiếp mẫu. Để giảm
thiểu cơ hội nhiễm bẩn, nên đốt nắp đậy và cổ của bình tam giác sau khi lấy nắp ra để cấy nấm men vào. - Đặt bình tam giác vào trong tủ ấm ở 37oC. - Lấy 2 mL mẫu ở các khoảng thời gian khác nhau trong quá trình nuôi cấy để xác định nồng độ tế bào bằng cách đếm trên kính hiển vi, xác định trọng lượng khô và đo độ đục (mật độ quang) bằng máy quang phổ. Thời gian lấy mẫu phải được sắp xếp sao có thể thu được cho đường cong sinh trưởng tốt thể hiện cả ba phase sinh trưởng. Trước khi lấy mẫu phải trộn tất cả các thành phần trong bình tam giác bằng cách lắc.