Thiết kế vector chuyển gen kháng virus mang gen chọn lọc thân thiện với môi trường

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 188­194<br /> <br /> <br /> <br /> THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS <br /> MANG GEN CHỌN LỌC THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƯỜNG<br /> <br /> Lê Thị Thủy2, Nguyễn Thị Thu Hiền1, Phạm Thị Vân1, Lê Văn Sơn1*<br /> 1<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *leson_03@yahoo.com<br /> 2<br /> Trường Đại học Sư phạm Hà Nội<br /> <br /> TÓM TẮT: Việc tạo được một vector chuyển gen thực vật mang gen chọn lọc tích cực nhằm tạo ra <br /> những cây trồng biến đổi gen thân thiện với môi trường sẽ  góp phần thúc đẩy việc thương mại hóa  <br /> sản phẩm chuyển gen. Trong nghiên cứu này, một vector chuyển gen nhị  thể, pK7M/TMV­CPi chứa <br /> cấu trúc RNAi TMV­CPi và gen manA đã được thiết kế. Cấu trúc RNAi TMV­CPi là một cát sét mang <br /> gen chuyển lặp lại đảo chiều ­ đọạn gen mã hóa protein vỏ (coat protein, CP) của virus TMV (Tobacco  <br /> mosaic virus) nhằm làm bất hoạt  gen CP của TMV trong các cây chuyển gen kháng virus này. Gen <br /> manA mã hóa cho enzyme phosphomannose isomerase (PMI) là một marker chọn lọc tích cực cho phép  <br /> sử dụng mannose làm chất chọn lọc. Để kiểm tra hiệu quả của vector thiết kế, cấu trúc RNAi TMV­<br /> CPi và gen manA trong vector này đã được chuyển vào hai giống thuốc lá Nicotiana tabacum K326 và <br /> C9­1   thông   qua   vi   khuẩn  Agrobacterium   tumefaciens.  Sử   dụng   hệ   thống   chọn   lọc   bằng   đường <br /> mannose, 40 dòng thuốc lá chuyển gen thế  hệ  T0 của cả  hai giống phát triển bình thường trên môi  <br /> trường chọn lọc đã được phân tích bằng lây nhiễm nhân tạo virus và PCR. Kết quả cho thấy, có 64,3%  <br /> (18/28) dòng thuốc lá chuyển gen K326 và 58,3% (7/12) dòng thuốc lá chuyển gen C9­1 có biểu hiện <br /> kháng virus TMV hoàn toàn và dương tính với PCR gen chuyển.<br /> Từ khóa: Nicotiana tabacum, RNAi, manA, chọn lọc tích cực, khảm thuốc lá, TMV.<br /> <br /> MỞ ĐẦU  dưỡng của tế  bào.  Vì thế  các tế  bào chuyển <br /> gen   sẽ   phát   triển   được   trên   môi   trường   có <br /> Việc   thay   thế   các   gen   chọn   lọc   gây   nên <br /> đường   Man   thay   vì   sacrose   trong   điều   kiện <br /> những lo lắng về độ an toàn với sức khỏe con <br /> bình thường. Đối với các tế bào không chuyển <br /> người   và   môi   trường   như  các   gen   kháng  lại <br /> gen,   bản   thân   đường   Man   không   gây   độc, <br /> kháng   sinh   hygromycin   (hpt)   và   kanamycin <br /> nhưng   khi   bị   phốt   pho   hóa   bởi   hexokinase <br /> (nptII)   hoặc   kháng   lại   các   chất   diệt   cỏ   như <br /> thành   mannose­6­phosphate     dẫn   đến   các   tế <br /> phosphinothricin   (bar)  và   chlorosulfuron   (als) <br /> bào không thể phát triển được.<br /> bằng thế  hệ  các gen chọn lọc tích cực, thân <br /> thiện với môi trường đang là vấn đề được quan  RNAi là cơ  chế  tự  nhiên của tế  bào sống <br /> tâm trong các nghiên cứu chuyển gen vào thực  có thể làm bất hoạt một gen nào đó. Bằng sự <br /> vật. phát triển của công nghệ sinh học, cơ chế của  <br /> quá trình này đã được làm sáng tỏ. Cho đến <br /> Gen  manA  mã   hóa   cho  enzyme  nay, RNAi được phát triển thành kỹ thuật hiện  <br /> phosphomannose   isomerase   (PMI)  có   nguồn  đại và hữu hiệu trong việc chống lại các bệnh <br /> gốc từ  Escherichia coli [5] là một trong những  do virus gây ra ở thực vật [8]. <br /> gen chọn lọc tích cực được chuyển thành công <br /> ở một số loại thực vật như: củ cải đường [4],  Trong bài báo này, một vector chuyển gen  <br /> ngô  [11, 12], lúa mì  [12], Arabidopsis  [9], cà  kháng virus TMV theo cơ  chế  RNAi đã được <br /> chua [7], đủ đủ [13], hành tây [1] và dưa chuột  thiết kế mang gen chọn lọc Man. Cấu trúc này <br /> [2]. Tế bào thực vật mang gen này thì trên môi  đã được thử nghiệm chuyển vào cây thuốc lá, <br /> trường   có   bổ   sung  mannose  (Man),   PMI   sẽ  cây công nghiệp mẫn cảm với virus TMV, làm <br /> biến đổi mannose­6­phosphate thành fructose­ ảnh   hưởng   nghiêm   trọng   đến   năng   suất   và <br /> 6­phosphate  có thể  sử  dụng như  là chất dinh   chất   lượng  của   thuốc   lá.   Các   dòng  thuốc   lá <br /> <br /> <br /> 188<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 188­194<br /> <br /> chuyển gen thu được trên môi trường chọn lọc   Sử   dụng   phương   pháp   LR   (Gateway­<br /> Man đã được phân tích khả  năng kháng virus  Invitrogen)   để   tạo   vector   RNAi   chuyển   gen <br /> TMV nhân tạo. Kết quả thu được là cơ sở cho  kháng virus  từ  vector  gốc pENTRY/CP  chứa  <br /> thiết   kế   vector   mang   cấu   trúc   RNAi   và   gen  trình tự  của gen CP của virus TMV được thu <br /> chọn lọc an toàn với sức khỏe con người. thập từ  Bắc Giang và vector RNAi chứa gen <br /> chọn lọc bằng mannose (pK7­M). Sản phẩm  <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU phản  ứng LR được biến nạp vào tế  bào khả <br /> Vật liệu biến  E.   coli  DH5α  bằng   phương   pháp   sốc <br /> Gen CP (coat protein) của virus TMV thu   nhiệt. Plasmid được tách, thu và kiểm tra bằng <br /> thập tại Bắc Giang có trong vector pENTRY   enzyme cắt giới hạn XbaI và HindIII. Các dòng <br /> [10]. Vi khuẩn E. coli chủng DH5α và DB3.1,  khuẩn   lạc   đã   biến  nạp  thành   công  sẽ   được <br /> Agrobacterium   tumefaciens  CV58C1   mang  kiểm tra một lần nữa với phản  ứng khuếch  <br /> plasmid gây độc pGV2260. Vector chuyển gen  đại đoạn gen CP thông qua phản  ứng colony­<br /> pK7GWIWG2(II), pNOV­gusplus. PCR với cặp mồi đặc hiệu TMV­Fi và TMV­<br /> Ri.<br /> Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L. K326 <br /> và C9­1 đang nuôi cấy trong điều kiện in vitro. Tạo   cây   thuốc   lá   chuyển   gen   kháng   virus  <br /> TMV<br /> Các  nguồn   vật   liệu   được   cung   cấp   bởi <br /> Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công  Mảnh lá của hai giống thuốc lá K326 và <br /> nghệ sinh học. C9­1 được nhiễm khuẩn A. tumefaciens  mang <br /> vector chuyển gen trong thời gian 10 phút. Sau <br /> Phương pháp<br /> đó,   các   mảnh   lá   được   đặt   trên   môi   trường <br /> Thiết   kế   vector   RNAi   gốc   chọn   lọc   bằng   đồng nuôi  cấy 2 ngày.  Sau 2 ngày,  mảnh lá <br /> đường Man được chuyển sang môi trường chọn lọc chứa  <br /> Vector   RNAi   gốc   chọn   lọc   bằng   đường  30 g/l Man, MS (I­V), 1 mg/l BAP và 250 mg/l <br /> Man được tạo từ  2 vector pK7GWIWG(II) và  Cefotaxim. Sau 3­4 tuần, các chồi tái sinh từ <br /> pNOV­gusplus có chứa gen manA. mảnh lá được cắt chuyển sang môi trường ra  <br /> rễ (MS (I­V), 30 g/l Man, 250 mg/l Cefotaxim).  <br /> Sử   dụng   các   enzyme   cắt   giới   hạn  SphI,  Các chồi ra rễ, sinh trưởng tốt trên môi trường <br /> HindIII   và   enzyme   tạo   đầu   bằng   T4   DNA  khi đạt chiều cao 4­6 cm sẽ tiến hành ra cây ở <br /> polymerase   để   tạo   trình   tự   gốc   RNAi   từ  nhà lưới. <br /> pK7GWIWG(II). Trình tự  gen manA thu được <br /> nhờ   phản   ứng   cắt   bởi   2   enzyme   PmeI   và  Phân tích sự  có mặt của gen chuyển bằng  <br /> HindIII với vector pNOV­gusplus. PCR và lây nhiễm nhân tạo<br /> Vector   pK7­M   là   vector   RNAi   gốc   chọn  DNA   tổng   số   được   tách   chiết   nhanh   từ <br /> lọc bằng đường Man được tạo ra bằng phản   mẫu lá các cây chuyển gen. Phân   tích PCR  <br /> ứng ghép nối từ 2 đoạn RNAi gốc và PMI nhờ  được   thực   hiện   để   khuếch   đại   đoạn   gen <br /> enzyme T4 ligase. Sản phẩm  được biến nạp  chuyển  CP  của   virus  TMV     bằng   cặp  mồi  <br /> vào tế bào khả  biến E. coli DB3.1. Plasmid từ  TMV­Fi   (5’­<br /> các khuẩn lạc được tách chiết theo Sambrook   CACCATGAAACCTTCACCACA­3’)   và <br /> et al. (2001) [6] và tiến hành kiểm tra bằng 2  TMV­Ri (5’­    CTAGGTCCAAACCAAACCA <br /> enzyme   cắt   giới   hạn  HindIII   và  XbaI  G­3’).<br /> (Fermentas). Các dòng cây chuyển gen được  kiểm tra <br /> Thiết kế  vector RNAi chuyển gen đơn đoạn   tính kháng bằng phương pháp lây nhiễm virus <br /> kháng virus TMV nhân tạo của Herbers  et al.  (1996) [3] có cải <br /> tiến.<br /> <br /> <br /> <br /> 189<br />  Le Thi Thuy, Nguyen Thi Thu Hien, Pham Thi Van, Le Van Son<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN nhau   tạo   vector   pK7­M   nhờ   enzyme   T4 <br /> ligase.  Sản   phẩm   của   phản   ứng   ghép   nối <br /> Tạo   vector   chuyển   gen   pK7­M   gốc   mang  được   biến  nạp  vào  tế   bào  khả   biến  E.   coli <br /> gen chọn lọc Man DB3.1 (hình 1c) và được phân tích bằng PCR <br /> Để  thiết kế   được cấu trúc RNAi, vector   và enzyme hạn chế HindIII. Kết quả cho thấy, <br /> pK7GWIWG(II)   đã   được   cắt   bằng   enzyme   sản phẩm cắt pK7­M bởi HindIII đã thu được <br /> SphI. Sản phẩm cắt thu được chứa đoạn gen  một phân đoạn có kích thước khoảng 12000 <br /> có kích thước khoảng 4935 bp là đoạn DNA  bp đúng như tính toán lý thuyết (hình 1d). Điều <br /> mang cấu trúc RNAi chứa ccdB và intron.   Vì  này chứng tỏ  việc thiết kế  vector pK7­M  đã <br /> enzyme  SphI cắt  tạo  đoạn  gen  có đầu  lệch,  thành công.<br /> nên chúng được tạo đầu bằng nhờ enzyme T4 <br /> DNA   polymerase.   Sản   phẩm   này   tiếp   tục <br /> được xử  lý bởi enzyme   HindIII    để  tạo nên <br /> đoạn gen có vị  trí cắt enzyme hạn chế  thích <br /> hợp với vector chuyển gen mong muốn pNOV­<br /> gusplus  <br /> (hình 1a).<br /> Vector pNOV­gusplus được cắt đồng thời <br /> bởi 2 enzyme PmeI và HindIII.  Sản phẩm cắt  <br /> thu được có hai phân đoạn kích thước khoảng <br /> 7000 và 3500 bp. Trong đó, đoạn DNA có kích <br /> thước   7000   bp   là   đoạn   có  mang   gen  manA <br /> mã   hóa   PMI   cần   quan   tâm   được   tinh   sạch <br /> phục vụ  cho phản  ứng ghép nối với cấu trúc <br /> RNAi (hình 1b).<br /> Đoạn gen RNAi và  manA  được ghép nối <br /> với <br /> <br /> <br /> <br /> <br />               a               b               c               d<br /> Hình 1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen pK7­M<br /> a. Sản phẩm cắt  vector pK7GWIWG(II) bằng  SphI và  HindIII; b. Sản phẩm cắt vector pNOV­gusplus  <br /> bằng PmeI và HindIII; c. Sản phẩm tách plasmid pK7­M; d. Sản phẩm cắt pK7­M bằng  HindIII; M. Thang <br /> DNA chuẩn; 1, 2, 3, Mẫu thí nghiệm.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 190<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 188­194<br /> <br /> Thiết   kế   vector   RNAi   chuyển   gen   kháng  vector   pK7M   gốc   cả   hai   phân   đoạn   có   kích <br /> virus TMV chọn lọc bằng Man thước 8600 và 3300 bp.<br /> Kỹ   thuật   Gateway  là   một   kỹ   thuật   dòng  Kết   quả   điện   di   sản   phẩm   cắt   bằng <br /> hóa   phổ   biến,   cho   phép   chuyển   đoạn   DNA  enzyme hạn chế  trên hình 3a cho thấy, dòng <br /> giữa các vector tách dòng khác nhau trong khi  khuẩn lạc số  1 và 2 thu được các phân đoạn <br /> vẫn duy trì định hướng chính và cấu trúc đọc,  có kích thước  như  dự  tính. Điều này khẳng  <br /> thay thế việc sử dụng enzyme cắt giới hạn và   định hai dòng khuẩn lạc này đều chứa vector <br /> enzyme   nối   hiệu   quả.   Kỹ   thuật   này   là   một  chuyển gen pK7M/TMV­CPi có cả hai vị trí tái  <br /> phương pháp có hiệu quả  cao cho việc tách  tổ hợp chứa đoạn gen CPi chèn vào.<br /> dòng có định hướng của các sản phẩm PCR. Để  khẳng định thêm sản phẩm mang gen  <br /> Kỹ  thuật này gồm có hai loại phản  ứng  CP của  virus TMV, các dòng khuẩn lạc này <br /> LR và BR. Trong nghiên cứu này,  phản  ứng  được   thực   hiện   PCR   với   các   cặp   mồi   đặc <br /> LR   được   thực   hiện   giữa   vector   tiếp   nhận  hiệu   TMV­Fi/TMV­Ri.   Từ   kết   quả   điện   di <br /> pENTRY mang đoạn gen CP của virus TMV   trên hình 3b cho thấy các dòng có kết quả PCR <br /> và vector đích pK7­M dưới sự xúc tác bởi hỗn  dương   tính   với   kích   thước   đúng   như   mong <br /> hợp   enzyme   LR   ClonaseTM  II   .  Vector   tái   tổ  đợi. Điều này chứng tỏ  gen CP đã được thiết  <br /> hợp tạo thành sau phản  ứng được kí hiệu là  kế thành công vào vector RNAi.  Kết quả chọn <br /> pK7M/TMV­CPi, là cấu trúc vector cần thiết   dòng bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt bởi <br /> kế (hình 2). Cấu trúc vector này đã được kiểm  enzyme giới hạn đã thu được dòng khuẩn lạc  <br /> tra bằng phản ứng colony­ PCR và enzyme cắt  dương tính mang vector pK7M/TMV­CPi quan <br /> hạn chế XbaI và HindIII.  tâm.  Cấu trúc  này  sẽ  tạo ra  RNA  CPi  dạng <br /> Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm plasmid  kẹp   tóc   bổ   sung   chính   nó   có   intron   (intron­<br /> pK7M/TMV­CPi  cắt   bởi   hai   enzyme  này  thu  hairpin RNA,  ihpRNA)  sau khi  được  chuyển <br /> được   hai   phân   đoạn   DNA   có   kích   thước   vào   cây   trồng.   Cấu   trúc   RNAi   pK7M/TMV­<br /> khoảng 8000 bp và  2700 bp,  tương  ứng  với  CPi này tiếp tục được kiểm tra khả năng biểu <br /> hiện trong cây thuốc lá.<br /> <br /> <br /> <br /> <br />  <br /> <br /> Hình 2. Bản đồ cấu trúc vector pK7M/TMV­CPi<br /> P35S, Promoter 35S của Cauliflower mosaic virus; attB1 và attB2, các vị trí tái tổ hợp trong phản  <br /> ứng LR. LB, left T­DNA border; RB, right T­DNA border; T35S, terminator 35S; PMI, gen kháng  <br /> mannose; CmR, gen kháng Chloramphenicol. Vị  trí các điểm cắt giới hạn của enzyme   XbaI và <br /> HindIII; TMV, đoạn gen CPi của virus TMV.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 191<br />  Le Thi Thuy, Nguyen Thi Thu Hien, Pham Thi Van, Le Van Son<br /> <br /> <br /> <br /> <br />                   a                  b<br /> <br /> Hình 3. Sản phẩm colony­PCR các dòng khuẩn lạc mang vector pK7­M/TMV­CPi<br /> a. Sản phẩm cắt plasmid pK7­M/TMV­CPi bằng 2 enzyme  XbaI và HindIII; b. Sản phẩm colony­PCR các <br /> dòng khuẩn lạc mang vector pK7­M/TMV­CPi; Đường chạy 1, 2, 3, các dòng khuẩn lạc được kiểm tra; <br /> Đường chạy (­), đối chứng âm (mẫu không chứa DNA khuôn); Đường chạy (+),  đối chứng khuôn (DNA <br /> là vector pENTRY/TMV­CPi)<br /> <br /> a b c d<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Các cây thuốc lá chuyển gen giống K326<br /> a. Các chồi thuốc lá chuyển gen trên môi trường Man 30mg/l; b . Rễ các chồi thuốc lá chuyển gen trên môi  <br /> trường Man 30 mg/l; c. Cây chuyển gen biểu hiện bệnh khảm sau lây nhiễm virus TMV;  d. Cây chuyển <br /> gen không nhiễm bệnh sau lây nhiễm virus TMV.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 313 bp<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 192<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 188­194<br /> <br /> Hình 5. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá<br /> M. Thang DNA chuẩn 1 kb (Fermentas)  ; Đường chạy 1­14. Sản phẩm PCR bằng cặp mồi TMV Fi/TMV  <br /> Ri của mẫu thuốc lá chuyển gen C9­1 và K326; Đường chạy (+). đối chứng dương là plasmid TMV­<br /> RNAi; Đường chạy (­). đối chứng âm. <br /> <br /> Tạo   cây   thuốc   lá   chuyển   gen   mang   gen  thương mại ở Việt Nam là K326 và C9­1 hiện <br /> chọn lọc Man kháng TMV đang chịu thiệt hại nặng nề do virus TMV gây <br /> ra   đã   được   lựa   chọn   để   chuyển   cấu   trúc <br /> Thuốc lá là một trong những cây mô hình <br /> pK7M/TMV­CPi thông qua A. tumefaciens. Có <br /> trong   nghiên   cứu   chuyển   gen   bởi   khả   năng <br /> 40 dòng thuốc lá chuyển gen thế  hệ  T0 phát <br /> nuôi cấy invitro dễ dàng, tỷ lệ tái sinh và hiệu  <br /> triển   bình  thường   trên  môi   trường   chọn   lọc <br /> quả  chuyển gen cao. Ngoài ra, thuốc lá là một <br /> Man 30 mg/l từ 2 giống thuốc lá K326 và C9­1 <br /> trong những cây chủ  phổ  biến của TMV. Vì <br /> được   đánh   giá   khả   năng   kháng   virus   TMV <br /> vậy, nhằm mục đích kiểm tra hiệu quả  của <br /> bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và PCR <br /> vector chuyển gen thiết kế, 2 giống thuốc lá <br /> (bảng 1). <br /> <br /> Bảng 1. Kết quả chuyển gen và phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen pK7M/TMV­CPi ở thế hệ <br /> T0<br /> PCR dương <br /> Chuyển gen và tái sinh Lây nhiễm nhân tạo<br /> tính<br /> Số mẫu <br /> Số cây <br /> thí  Số chồi <br /> Giống  Số mẫu  Số cây  kháng  Tỷ lệ <br /> nghiệm x  Tổng số  phát triển  Gen  Gen <br /> thuốc lá cảm ứng  lây  virus  kháng <br /> số lần  chồi tách* bình  CPi manA<br /> tạo chồi* nhiễm hoàn  (%)<br /> thí  thường**<br /> toàn<br /> nghiệm<br /> K326 50 x 2  46,5 ± 0,7 131,0 ±  4,2 14,0 ± 2,8 28 18 64,3 18 18<br /> C9­1 50 x 2 43,5 ± 2,1  73,0 ± 2,8 6,0 ± 1,4 12 7 58,3 7 7<br /> WT­K326 5 x 2   4,5 ± 0,7 13,5± 2,1 0 10 0 0 0 0<br /> WT­C9­1  5 x 2 3,5 ± 0,7 11,0± 1,4 0 10 0 0 0 0<br /> <br /> WT­K326, WT­C9­1: Cây thuốc lá không chuyển gen giống K326 và C9­1; *: mẫu thí nghiệm nuôi cấy  <br /> trên môi trường không có Man; **: Mẫu thí nghiệm nuôi cấy trên môi trường có Man 30 mg/l.<br /> Sau ba lần lây nhiễm nhân tạo virus TMV,   KẾT LUẬN<br /> 64,3% (18/28) dòng thuốc lá chuyển gen K326  <br /> Vector   chuyển   gen   mang   cấu   trúc   RNAi  <br /> và   58,3%   (7/12)   dòng  thuốc   lá   C9­1   chuyển <br /> TMV­M­CPi   và   gen   chọn   lọc   mannose   thân <br /> gen ở thế hệ T0 có biểu hiện kháng bệnh hoàn <br /> thiện với môi trường đã được  thiết  kế  thành <br /> toàn. Tất cả  những dòng có biểu hiện kháng <br /> công. Đồng thời cấu trúc này đã được chuyển <br /> bệnh hoàn toàn này tiếp tục được kiểm tra sự <br /> thành công vào 2 giống thuốc lá K326 và C9­1 <br /> có mặt của gen chuyển bằng PCR. Kết quả,  <br /> với tỉ  lệ  kháng  virus TMV  lần lượt là  64,3% <br /> có 100% dòng kiểm tra dương tính với PCR. <br /> và 58,3% trên tổng số dòng kiểm tra.<br /> Điều này đã chứng tỏ vector thiết kế đã hoạt  <br /> động hiệu quả. Việc thiết kế  vector chuyển   Lời cảm  ơn: Công trình được hỗ trợ về kinh <br /> gen  kháng   virus   mang  gen  chọn  lọc   Man   đã  phí từ  đề  tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu tạo <br /> thành công. giống thuốc lá kháng bệnh khảm lá và xoăn <br /> <br /> <br /> 193<br />  Le Thi Thuy, Nguyen Thi Thu Hien, Pham Thi Van, Le Van Son<br /> <br /> đọt bằng kĩ thuật chuyển gen”. Tập thể  tác <br /> 5. Petersen S. G., Brunstedt J., Okkels F. T., <br /> giả xin chân thành cảm ơn Bộ Nông nghiệp và  <br /> 1998.   Analysis   of   mannose   selection   used <br /> Phát triển nông thôn, Phòng Công nghệ Tế bào <br /> for   transformation   of   sugar   beet.   Mol. <br /> thực vật, Viện Công nghệ  Sinh học đã hỗ  trợ <br /> Breed., 4: 111­117.<br /> chúng tôi thực hiện nghiên cứu này.<br /> 6. Miles  J.  S.,  Guest  J.  R.,  1984.  Nucleotide <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO sequence   and   transcriptional   start   point   of <br /> 1. Aswath C. R., Mo S. Y., Kim D. H., Park S.  the   phosphomannose   isomerase   gene <br /> (manA) of  Escherichia coli. Gene, 32: 41­<br /> W.,   2006.  Agrobacterium  and   biolistic <br /> 48.<br /> transformation of onion using non­antibiotic <br /> selection   marker   phosphomannose  7. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T., 1989. <br /> isomerase. Plant Cell Rep., 5: 92­99. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. <br /> Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold <br /> 2. He Z., Duan Z., Liang W., Chen F., Yao W.,  Spring Harbor, NY.<br /> Liang H., Yue C., Sun Z., Chen F., Dai J., <br /> 2006.   Mannose   selection   system   used   for  8. Sigareva   M.,   Spivey   R.,   Willits   M.   G,, <br /> cucumber   transformation.   Plant   Cell   Rep.,  Kramer   C.   M.,   Chang   Y.   F.,   2005.   An <br /> 25(9): 953­958. efficient   mannose   selection   protocol   for <br /> tomato   that   has   no   adverse   effect   on   the <br /> 3. Herbers K., Meuwly P., Wolf B., Metraux J.  ploidy level of transgenic plants. Plant Cell <br /> P., Sonnowald U., 1996. Systemic acquired  Rep., 23: 236­245.<br /> resistance   mediated   by   the   ectopic <br /> expression   of   invertase:   possible   hexose  9. Smith   N.   A.,   Singh   S.   P.,   Wang   M.   B., <br /> sensing in the secretory pathway. Plant Cell,  Stoutjesdijl P. A., Green A. G., Waterhouse <br /> 8: 793­803. P.   M.,   2000.   Total   silencing   by   intron­<br /> spliced hairpin RNAs. Nature, 407: 319­20.<br /> 4. Joersbo M., Donaldson I., Kreiberg J.,<br /> 10. Todd   R.,   Tague   G.   W.,   2001. <br /> Phosphomannose   isomerase:   a   versatile <br /> selectable   marker   for   Arabidopsis   thaliana <br /> germ­line   transformation.   Plant   Mol.   Biol. <br /> Rep., 19: 307­319.<br /> 11. Phạm   Thị   Vân,   Nguyễn   Minh   Hùng,   Hà <br /> Viết Cường, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, <br /> Lê   Trần   Bình,   2009.   Tạo   cây   thuốc   lá <br /> kháng   virus   TMV   bằng   kỹ   thuật   RNAi.  <br /> Hội thảo quốc gia Bệnh hại thực vật Việt <br /> Nam.   Ninh   Thuận,   25­26/07/2009.   Nxb. <br /> Nông nghiệp, Hà Nội: 32­40.<br /> 12. Wang   A.S.,   Evans   R.A.,   Altendorf   P.R., <br /> Hanten   J.A.,   Doyle   M.C.,   Rosichan   J.L., <br /> 2000.   A   mannose   selection   system   for <br /> production of fertile transgenic maize plants <br /> from   protoplasts.   Plant   Cell   Rep.,  19:654­<br /> 660.<br /> 13. Wright M., Dawson J., Dunder E., Suttie J., <br /> Reed J., Kramer C., Chang Y., Novitzky R., <br /> <br /> <br /> 194<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 188­194<br /> <br /> Wang H., Artim­Moore L., 2001. Efficient  14. Rep., 20: 429­436.<br /> biolistic transformation of maize and wheat <br /> using the phosphomannose isomerase gene,  15. Zhu   Y.   J.,   Agbayani   R.,   McCafferty   H., <br /> pmi as the selectable marker. Plant Cell  Albert H. H., Moore P. H., 2005. Effective <br /> selection   of   transgenic   papaya   plants   with <br /> the   PMI/Man   selection   system.   Plant   Cell <br /> Rep., 24:426­432.<br /> <br /> <br /> CONSTRUCTION OF TRANSFORMATION VECTOR <br /> CARRYING ENVIROMENTAL FRENDLY SELECTION MARKER <br /> AND VIRUS RESISTANT GENE<br /> <br /> Le Thi Thuy2, Nguyen Thi Thu Hien1, Pham Thi Van1, Le Van Son1<br /> Institute of Biotechnology, VAST<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> Hanoi National University of Education<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> The design of a plant transformation vector carrying environmental friendly selection marker gene for <br /> production of bio­safety transgenic plants will promote the commercialization of transgenic products. In this  <br /> study, a binary transformation vector pK7M/TMV­CPi containing TMV­CPi RNAi construct and manA gene <br /> was constructed.  TMV­CPi RNAi construct is a inverted repeat transgene cassette, containing partial  coat <br /> protein  gene sequence  of tobacco mosaic virus (TMV),  that can silence the CP gene of TMV  in the TMV <br /> resistant  transgenic  plants.  ManA  gene  encoding  phosphomannose isomerase  (PMI)  enzyme  is a positive <br /> selectable marker which allows using mannose for selection. With this vector, the TMV­CPi RNAi construct <br /> and manA gene have been transformed  into two Nicotiana tabacum cv. K326 and C9­1 via Agrobacterium  <br /> tumefaciens. There were 100 T0 transgenic tobacco lines (64 of K326 and 34 of C9­1 transgenic tobacco <br /> lines) which growing well on mannose selective medium were analyzed by artificial inoculation with TMV <br /> and PCR. The result showed that 64.3% (18 of 28) and 58.3 % (7 of 12) of K326 and C9­1 transgenic tobacco <br /> lines, respectively, were completely resistant to TMV and positive PCR with transgene. <br /> Keywords:  Nicotiana tobacum, RNA interference (RNAi),  manA  gene, positive selection, tobacco mosaic <br /> virus. <br /> <br /> Ngày nhận bài: 20­6­2013<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 195<br />