Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa ex vivo của cao trà xanh giàu epigallocatechin-3-gallate (EGCG)

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA EX VIVO<br /> CỦA CAO TRÀ XANH GIÀU EPIGALLOCATECHIN-3-GALLATE (EGCG)<br /> Trần Lê Tuyết Châu*, Nguyễn Thị Thu Vân*, Trần Thị Vân Anh*, Dương Phước An*,<br /> Trần Phi Hoàng Yến*<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Đặt vấn đề: Các sản phẩm chứa polyphenol chiết xuất từ trà, đặc biệt là epigallocatechin-3-gallate<br /> (EGCG) – thành phần có hoạt tính sinh học hữu hiệu nhất trong nhóm hợp chất catechin của trà xanh, rất có<br /> giá trị về mặt khoa học và thương mại. Việc nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của cao trà xanh giàu<br /> EGCG rất cần thiết để góp phần khẳng định vai trò của trà xanh trong việc phòng và chữa trị nhiều loại bệnh<br /> khác nhau.<br /> Mục tiêu: Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của cao trà xanh giàu EGCG trên chuột nhắt.<br /> Phương pháp: Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua hai chỉ số Malonyldialdehyd (MDA) và<br /> protein carbonyl.<br /> Kết quả: Với liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột, thử nghiệm 14 ngày đã thể hiện hoạt tính chống<br /> oxy hóa rõ rệt hơn thử nghiệm 7 ngày thông qua sự giảm hàm lượng MDA và protein carbonyl của nhóm<br /> thử thuốc so với nhóm tiêm CCl4 (p < 0,01) trên mô hình gây viêm gan cấp tính bằng CCl4 (0,4 mL/ kg).<br /> Kết luận: Liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột thể hiện rõ hoạt tính chống oxy hóa của cao trà xanh.<br /> Từ khóa: Camellia sinensis, trà xanh, chống oxy hóa, MDA, protein carbonyl.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> ANTIOXIDATIVE ACTIVITY EX VIVO<br /> OF GREEN TEA EXTRACTS ENRICHED EPIGALLOCATECHIN-3-GALLATE (EGCG)<br /> Tran Le Tuyet Chau, Nguyen Thi Thu Van, Tran Thi Van Anh, Duong Phuoc An, Tran Phi Hoang Yen<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 130 - 134<br /> Background: The product contains polyphenols, especially epigallocatechin-3-gallate (EGCG) - the<br /> most abundant catechin in green tea, are very valuable in scientific and trade. Researching the antioxidant<br /> effect of green tea is needed to confirm the role of green tea in preventing and treating many different<br /> diseases.<br /> Objective: The purpose of our work is to study the antioxidant effect of EGCG on mice.<br /> Methods: The antioxidative activity of mice liver were evaluated by determining malonyldialdehyd and<br /> protein carbonyl.<br /> Results: The antioxidant effect of EGCG after administering it perorally to mice at dose 60 mg/ kg mice<br /> body weight for 14 days is better than 7 days by decreasing malonyldialdehyd and protein carbonyl on the<br /> model of acute hepatitis caused by CCl4 (0.4 mL/ kg).<br /> Conclusion: Dose 60 mg EGCG/ kg mice body weight was showed the antioxidant effect.<br /> Key words: Camellia sinensis, green tea extract, antioxidant, MDA, protein carbonyl.<br /> <br /> *<br /> <br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Trần Lê Tuyết Châu ĐT: 0903645131<br /> <br /> 130<br /> <br /> Email: tuyetchau@gmail.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> ĐẶTVẤN ĐỀ<br /> Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) là thành<br /> phần có hoạt tính sinh học mạnh nhất trong<br /> nhóm hợp chất catechin của trà xanh, rất có giá<br /> trị về mặt khoa học và thương mại – đang<br /> được sản xuất với quy mô công nghiệp tại các<br /> nước có vùng trồng trà tập trung lớn như<br /> Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ…<br /> Tiềm năng của các sản phẩm chứa<br /> polyphenol chiết xuất từ trà để ngăn ngừa<br /> hoặc cải thiện các bệnh mãn tính hiện đang là<br /> đối tượng nghiên cứu khoa học(3). Một số cơ<br /> chế đã được đề xuất để giải thích các tác dụng<br /> có lợi của trà, ví dụ: ức chế gốc tự do và chống<br /> oxy hóa(2).<br /> Các bằng chứng in vitro cho thấy polyphenol<br /> trong trà có tác dụng chống oxy hóa trực tiếp<br /> hoặc gián tiếp còn nhiều hạn chế. Vì vậy việc<br /> nghiên cứu trên động vật thí nghiệm để đánh giá<br /> tính chất chống oxy hóa của polyphenol dùng<br /> đường uống là rất cần thiết.<br /> <br /> VẬTLIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Cao trà xanh<br /> Cao chiết ethanol từ búp trà xanh (hàm<br /> lượng EGCG ≥ 60%) đã được tiêu chuẩn hóa.<br /> <br /> Động vật thử nghiệm<br /> Chuột nhắt trắng, đực, giống Swiss albino,<br /> trọng lượng 20±2 g (khoảng 5 – 6 tuần tuổi) do<br /> Viện Vaccin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang<br /> cung cấp.<br /> <br /> Nguyên liệu, hóa chất khảo sát<br /> Chất chuẩn 1,1’,3,3’-tetramethoxypropan,<br /> chất chuẩn Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)<br /> 98% được mua từ công ty Sigma-Aldrich<br /> (Singapore), Acid trichloracetic, Ethyl acetate,<br /> Methanol được mua từ công ty Merck (Đức).<br /> <br /> Xác định Malonyl dialdehyd (MDA)(4)<br /> Malonyl dialdehyd (MDA) là sản phẩm<br /> cuối cùng của quá trình peroxy hoá lipid màng<br /> tế bào gây ra bởi các gốc tự do. MDA phản<br /> ứng với acid thiobarbituric tạo phức màu hồng<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> có hấp thu cực đại ở bước sóng 532–535 nm.<br /> Đo độ hấp thu của phức suy ra lượng MDA<br /> trong mẫu. Hoạt tính chống oxy hoá được<br /> đánh giá là tỉ lệ phần trăm của lượng MDA<br /> giảm đi ở mẫu thử so với mẫu gây viêm gan<br /> cấp.<br /> <br /> Phương pháp xác định protein carbonyl(1)<br /> Protein carbonyl là một sản phẩm được<br /> sinh ra trong quá trình oxy hóa protein, phản<br /> ứng với 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNPH)<br /> tạo sản phẩm có màu vàng, đo quang ở bước<br /> sóng 370 nm.<br /> Bảng 1. Hỗn hợp phản ứng định lượng protein<br /> carbonyl<br /> Thành phần<br /> 100 mM PBS (pH 7,2)<br /> <br /> Ống chứng<br /> <br /> Ống thử<br /> <br /> 320 μl<br /> <br /> 320 μl<br /> <br /> 80 mM FeSO4.7H2O<br /> <br /> 20 μl<br /> <br /> 20 μl<br /> <br /> 8 mM FeCl3.6H2O<br /> <br /> 20 μl<br /> <br /> 20 μl<br /> 20 μl<br /> <br /> 4 M KCl<br /> <br /> 20 μl<br /> <br /> 0,4 M MgCl2.2H2O<br /> <br /> 20 μl<br /> <br /> 20 μl<br /> <br /> Dịch ly tâm<br /> <br /> 200 μl<br /> <br /> 200 μl<br /> <br /> Nước cất<br /> <br /> 120 μl<br /> <br /> 120 μl<br /> <br /> Tổng cộng<br /> <br /> 720 μl<br /> <br /> 720 μl<br /> <br /> Bố trí thí nghiệm<br /> Nhóm I (nhóm sinh lý)<br /> Được nuôi ở điều kiện bình thường và cho<br /> chuột cách ly với thức ăn 16 giờ trước khi tiến<br /> hành thí nghiệm.<br /> Nhóm II (nhóm chứng)<br /> Tiêm phúc mô liều duy nhất dung môi pha<br /> CCl4 trong cùng điều kiện và cho chuột cách ly<br /> với thức ăn 16 giờ trước khi tiến hành thí<br /> nghiệm.<br /> Nhóm III (tiêm CCl4)<br /> 24 giờ trước khi kết thúc thí nghiệm, tiêm<br /> phúc mô liều duy nhất CCl4 (0,4 mL CCl4/ kg<br /> thể trọng chuột) và cho chuột cách ly với thức<br /> ăn 16 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm.<br /> Nhóm IV (thử thuốc)<br /> Cho chuột uống cao trà xanh với liều 60<br /> mg EGCG/ kg trong 7 ngày hoặc 14 ngày, tiêm<br /> phúc mô liều duy nhất CCl4 (0,4 mL/ kg) vào<br /> <br /> 131<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> ngày cuối cùng và cho chuột cách ly với thức<br /> <br /> 0,9<br /> 0,8<br /> 0,7<br /> <br /> ăn 16 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm.<br /> tính chống oxy hóa (lấy mẫu, cân, nghiền<br /> mẫu...) đều được tiến hành ở 0 – 4oC.<br /> <br /> Xử lý và phân tích số liệu<br /> <br /> Đ ộ hấp thu<br /> <br /> Lưu ý: các giai đoạn trong thử nghiệm hoạt<br /> <br /> Số liệu thực nghiệm được biểu diễn dưới<br /> <br /> y = 0,0258x + 0,0215<br /> 2<br /> <br /> R = 0,9994<br /> <br /> 0,6<br /> 0,5<br /> 0,4<br /> 0,3<br /> 0,2<br /> 0,1<br /> 0,0<br /> <br /> dạng Mean ± SEM. Sử dụng phương pháp<br /> phân tích ANOVA 1 hoặc 2 yếu tố với Fisher’s<br /> PLTS Test. Ý nghĩa thống kê được xác định khi<br /> <br /> 0<br /> <br /> 5<br /> <br /> p < 0,01.<br /> <br /> 10<br /> <br /> 15<br /> <br /> 20<br /> <br /> 25<br /> <br /> 30<br /> <br /> Hàm lượng MDA (nmol/ ml)<br /> <br /> KẾTQUẢ<br /> Hình 1. Đường chuẩn định lượng MDA<br /> <br /> Phương trình đường chuẩn MDA<br /> <br /> Kết quả định lượng MDA và protein<br /> carbonyl<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả xây dựng đường chuẩn định<br /> lượng MDA<br /> STT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> <br /> Hàm lượng MDA chuẩn<br /> (nmol/ mL)<br /> 1,25<br /> 2,50<br /> 5,00<br /> 10,00<br /> 15,00<br /> 20,00<br /> 30,00<br /> <br /> Độ hấp thu (A)<br /> <br /> Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) của các<br /> mẫu thử nghiệm được tính theo tỉ lệ phần<br /> <br /> 0,0514<br /> 0,0787<br /> 0,1519<br /> 0,2808<br /> 0,4211<br /> 0,5351<br /> 0,7883<br /> <br /> trăm của lượng MDA hoặc protein carbonyl<br /> giảm đi ở mẫu thử so với mẫu tiêm CCl4 để<br /> gây viêm gan cấp.<br /> <br /> Mô hình 7 ngày<br /> <br /> Bảng 3. Hàm lượng MDA và protein carbonyl trong mô hình 7 ngày<br /> Nhóm<br /> <br /> n<br /> <br /> Hàm lượng MDA<br /> (nmol/ mL)<br /> <br /> I<br /> <br /> 6<br /> <br /> 8,817 ± 2,127<br /> <br /> 7,408 ± 1,024<br /> <br /> II<br /> <br /> 6<br /> <br /> 9,470 ± 0,795<br /> <br /> 7,886 ± 1,199<br /> <br /> III<br /> <br /> 6<br /> <br /> 29,651 ± 1,138<br /> <br /> 0<br /> <br /> 19,839 ± 0,398<br /> <br /> 0<br /> <br /> IV<br /> <br /> 6<br /> <br /> 15,885 ± 2,136<br /> <br /> 46,43 (∗∗p < 0,01)<br /> <br /> 14,923 ± 1,106<br /> <br /> 24,78 (∗∗p < 0,01)<br /> <br /> 132<br /> <br /> HTCO (%)<br /> <br /> Hàm lượng protein<br /> carbonyl (nmol/ mL)<br /> <br /> HTCO (%)<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 35<br /> <br /> Hàm<br /> lượng<br /> protein<br /> carbonyl<br /> (nmol/<br /> Protein<br /> carbonyl<br /> concentration<br /> (nmol/<br /> ml) mL)<br /> <br /> Hàm lượng MDA (nmol/ mL)<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> MDA concentration (nmol/ ml)<br /> <br /> 35<br /> <br /> *<br /> <br /> 30<br /> 25<br /> 20<br /> <br /> **<br /> <br /> 15<br /> 10<br /> 5<br /> 0<br /> <br /> I<br /> <br /> II<br /> <br /> IV<br /> <br /> III<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 25<br /> <br /> *<br /> <br /> 20<br /> <br /> **<br /> 15<br /> <br /> 10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0<br /> <br /> I<br /> <br /> II<br /> <br /> IV<br /> <br /> III<br /> <br /> Group<br /> Nhóm<br /> <br /> Group<br /> Nhóm<br /> <br /> Hình 1. Hàm lượng MDA và protein carbonyl trong mô hình 7 ngày<br /> <br /> Nhận xét<br /> Hàm lượng MDA ở nhóm uống cao trà<br /> xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) giảm<br /> có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4 (p <<br /> 0,01), HTCO đạt 46,43%.<br /> <br /> Hàm lượng protein carbonyl ở nhóm uống<br /> cao trà xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột)<br /> giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm<br /> CCl4 (p < 0,01), HTCO đạt 24,78%.<br /> <br /> Bảng 4. Hàm lượng MDA và protein carbonyl trong mô hình 14 ngày<br /> n<br /> <br /> I<br /> II<br /> III<br /> <br /> 6<br /> 6<br /> 6<br /> 6<br /> <br /> MDA concentration (nmol/ ml)<br /> <br /> Hàm lượng MDA (nmol/ mL)<br /> <br /> IV<br /> <br /> Hàm lượng MDA<br /> (nmol/ mL)<br /> 8,928 ± 0,486<br /> 9,697 ± 0,907<br /> 29,699 ± 0,861<br /> <br /> 0<br /> ∗∗<br /> <br /> 50,19 ( p < 0,01)<br /> <br /> 14,792 ± 1,379<br /> <br /> 35<br /> <br /> *<br /> <br /> 30<br /> 25<br /> 20<br /> <br /> **<br /> <br /> 15<br /> 10<br /> 5<br /> 0<br /> <br /> I<br /> <br /> II<br /> <br /> Hàm lượng protein<br /> carbonyl (nmol/ mL)<br /> 7,196 ± 0,546<br /> 7,492 ± 1,618<br /> 20,392 ± 0,979<br /> <br /> HTCO (%)<br /> <br /> III<br /> <br /> Nhóm<br /> Group<br /> <br /> IV<br /> <br /> Protein<br /> carbonyl<br /> concentration<br /> Hàm<br /> lượng<br /> protein<br /> carbonyl(nmol/<br /> (nmol/ml)<br /> mL)<br /> <br /> Nhóm<br /> <br /> HTCO (%)<br /> <br /> 0<br /> ∗∗<br /> <br /> 33,02 ( p < 0,01)<br /> <br /> 13,658 ± 1,513<br /> 30<br /> 25<br /> <br /> *<br /> 20<br /> <br /> **<br /> <br /> 15<br /> 10<br /> 5<br /> 0<br /> <br /> I<br /> <br /> II<br /> <br /> III<br /> <br /> IV<br /> <br /> Group<br /> Nhóm<br /> <br /> Hình 2. Hàm lượng MDA và protein carbonyl trong mô hình 14 ngày<br /> HTCO đạt 50,19%, thể hiện rõ khả năng chống<br /> Nhận xét<br /> oxy của EGCG.<br /> Hàm lượng MDA ở nhóm uống cao trà<br /> Hàm lượng protein carbonyl ở nhóm uống<br /> xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) giảm<br /> cao trà xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột)<br /> có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4,<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 133<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm<br /> CCl4, HTCO đạt 33,02%.<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Việc khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của<br /> cao trà xanh giàu EGCG thông qua hai chỉ số<br /> MDA và protein carbonyl cho thấy với liều 60<br /> mg EGCG/ kg thể trọng chuột đã thể hiện<br /> HTCO rõ rệt (p < 0,01).<br /> Số liệu thực nghiệm còn cho thấy rằng khi<br /> chuột được uống cao trà xanh dự phòng ở cả<br /> hai mô hình 7 ngày và 14 ngày đều thể hiện<br /> hoạt tính chống oxy hóa.<br /> <br /> KẾTLUẬN<br /> Cao trà xanh (liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng<br /> chuột) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt<br /> <br /> 134<br /> <br /> trên sự giảm hàm lượng MDA và protein<br /> carbonyl của nhóm thử thuốc so với nhóm tiêm<br /> CCl4 để gây viêm gan cấp (p < 0,01).<br /> Cảm ơn: Đề tài này được tài trợ kinh phí từ quỹ nghiên cứu<br /> khoa học của Chương trình Vườn ươm và sáng tạo KHCN trẻ<br /> - Thành đoàn Tp.HCM.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> 4.<br /> <br /> Chevion M, Berenshtein E, Stadtman ER (2000), “Human<br /> studies related to protein oxidation: protein carbonyl<br /> content as a marker of damage”, Free Radic Res. 33<br /> Suppl:S99-108.<br /> Higdon JV, Frei B (2003), “Tea catechins and polyphenols:<br /> health effects, metabolism, and antioxidant functions”,<br /> Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 43:89-143.<br /> McKay DL, Blumberg JB (2002), “The role of tea in human<br /> health: an update”, J. Am. Coll. Nutr. 21:1-13.<br /> Vladimirov XG, 1987, Khimiko farmaxevticheckii Zuranal,<br /> Vol. 3, pg. 236 – 249.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br />