Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ xạ khuẩn và ứng dụng sản xuất bột rong thực phẩm

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2014<br /> <br /> KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC<br /> <br /> THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CELLULASE TỪ XẠ KHUẨN<br /> VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT BỘT RONG THỰC PHẨM<br /> OBTAINING CELLULASE FROM ACTINOBACTERIA<br /> AND APPLICATION FOR PRODUCING SEAWEED POWDER FOR FOOD<br /> Nguyễn Phước Bảo Hoàng1, Trần Thị Luyến2<br /> Ngày nhận bài: 26/3/2013; Ngày phản biện thông qua: 03/7/2013; Ngày duyệt đăng: 10/3/2014<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được tuyển chọn để nghiên cứu sản xuất cellulase. Điều kiện nuôi cấy tối ưu<br /> để thu được cellulase từ chủng xạ khuẩn này là môi trường cải tiến ISP-4 với pH 6,5 ; nhiệt độ nuôi cấy 33oC ± 1, tốc độ<br /> lắc 180v/phút, chất cảm ứng CMC 1,5%, bã mía 2%, bột cá 0,4%. Sau thời gian nuôi cấy 132 giờ cellulase thu được có<br /> hoạt độ cao 188,93UI/ml. Kết tủa enzyme bằng ethanol ở nồng độ 75%, thời gian kết tủa là một giờ ở 4oC, thu được chế<br /> phẩm cellulase có hoạt độ 216,2UI/g. Điều kiện thích hợp cho hoạt động của C-CPE cellulase của chủng Micromonospora<br /> VTCC-A-1787 là 45oC, pH 6,0. Kết quả bước đầu ứng dụng enzyme này thủy phân rong thu được bột rong có chất lượng<br /> đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng và đảm bảo chỉ tiêu vi sinh vật dành cho thực phẩm yêu cầu gia nhiệt trước khi sử dụng.<br /> Từ khóa: xạ khuẩn, Micromonospora, cellulase, thủy phân<br /> <br /> ABSTRACT<br /> Micromonospora VTCC-A-1787 strain was chosen for research into cellulase production. Optimum culture<br /> conditions for produce cellulase from this strain were improved environment ISP-4, pH 6,5; culture temperature<br /> 33 ± 1°C; with inductive substance CMC 1,5%, 2% bagasse powder and 0,4% fish powder. After 132 hours of culture,<br /> cellulase reached the activity 188,93UI/ml. Cellulase was precipitated by ethanol 75%, time of precipitation was 1 hour at<br /> 4°C. The enzyme preparation has activity of 216,2UI/g. Optimum condition for enzyme activity was pH 6.0 and 45°C. The<br /> preparation was used for hydrolyzing seaweed for seaweed powder. The result shows that the quality of seaweed powder<br /> can meet nutrition requirements and microbiological criteria for foods.<br /> Keywords: Actinomycetes, Micromonospora, cellulase, hydrolysis<br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Rong biển là nguồn thực phẩm giàu chất dinh<br /> dưỡng [2], nhưng còn chứa hàm lượng cellulose khá<br /> cao. Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa<br /> không được khuyến khích trong chế biến thực phẩm<br /> ngày nay. Do đó, nghiên cứu thủy phân cellulose<br /> chuyển hóa dưới dạng đường chức năng bằng<br /> phương pháp sinh học là một hướng đi có nhiều<br /> triển vọng, vì điều kiện phản ứng nhẹ, ít gây ô nhiễm<br /> môi trường và cho sản phẩm có chất lượng tốt [5].<br /> Enzyme ngày càng được sử dụng rộng rãi, nhất<br /> là trong công nghiệp thực phẩm. Nguồn enzyme vi<br /> sinh vật rất được quan tâm, do có thể nuôi cấy trên<br /> môi trường rẻ tiền, dễ tìm. Trong các loài vi sinh vật,<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> chúng tôi quan tâm đến xạ khuẩn chi Micromonospora<br /> được phân lập tại Việt Nam, đây là loài có các<br /> nghiên cứu và ứng dụng còn hạn chế.<br /> Vì vậy trong bài báo này, chúng tôi xin trình bày<br /> kết quả nghiên cứu thu nhận chế phẩm cellulase kỹ<br /> thuật từ chủng xạ khuẩn đã lựa chọn; từ chế phẩm<br /> enzyme này sử dụng để thủy phân sản xuất bột<br /> rong thực phẩm.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên vật liệu<br /> - Ba chủng xạ khuẩn Micromonospora ký hiệu<br /> là A-1787, A-1820 và A-1762 được cung cấp từ<br /> <br /> Nguyễn Phước Bảo Hoàng: Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2008 – Trường Đại học Nha Trang<br /> GS.TS. Trần Thị Luyến: Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 109<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Phòng Giống vi sinh vật thuộc Trung tâm Công nghệ<br /> sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Chủng được<br /> cấy truyền và nuôi ở 30oC trong môi trường thạch<br /> nghiêng YS.<br /> - Rong mứt Porphyra Vietnamensis, rong biển<br /> tự nhiên, thu mua tại Nha Trang vào tháng 11/2011.<br /> Rong có màu tím, tươi, sạch, cọng rong dai, mềm.<br /> Có mùi đặc trưng, không lẫn với các loài rong khác,<br /> không có mùi lạ, màu lạ, không có dấu hiệu hư hỏng.<br /> - Môi trường nuôi cấy ISP-4 cải tiến: K2HPO4<br /> 0,1%, MgSO4.7H2O 0,1%, CaCO3 0,2%, NaCl 0,1%.<br /> Đã thay đổi nguồn carbon và nitrogen ban đầu là bột<br /> cá và bã mía, có bổ sung chất cảm ứng CMC [6].<br /> 2. Nội dung nghiên cứu<br /> Nghiên cứu các nội dung chính sau:<br /> - Lựa chọn chủng xạ khuẩn Micromonospora<br /> VTCC thích hợp và nghiên cứu ảnh hưởng của một<br /> số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp<br /> cellulase có hoạt tính cao.<br /> - Nghiên cứu phương pháp thích hợp để thu<br /> nhận dịch chiết và chế phẩm enzyme kỹ thuật ở quy<br /> mô phòng thí nghiệm.<br /> - Bước đầu ứng dụng chế phẩm enzyme trên<br /> thủy phân rong mứt sản xuất bột rong thực phẩm và<br /> đánh giá chất lượng của bột rong này.<br /> 3. Phương pháp nghiên cứu<br /> - Cách tiến hành thí nghiệm: Chủng Micromonospora<br /> <br /> Số 1/2014<br /> VTCC-A-1787 → Hoạt hóa → Nuôi cấy → Ly tâm →<br /> Dịch chứa cellulase → Kết tủa → C-CPE cellulase<br /> → Thủy phân rong → Sấy → Bột rong [7].<br /> - Phương pháp xác định đường cong sinh<br /> trưởng: Đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng<br /> 620 nm [4].<br /> - Phương pháp xác định hoạt tính cellulase:<br /> Dựa vào định lượng đường khử theo phương pháp<br /> so màu (phương pháp Hagedorn Jensen). Một<br /> đơn vị hoạt tính của enzyme cellulase được định<br /> nghĩa là lượng enzyme có khả năng thủy phân<br /> cơ chất CMC tạo thành đường khử tương đương<br /> 1 µg glucose trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ phòng<br /> (300C) [1].<br /> - Phương pháp xác định đường kính phân giải<br /> của enzyme bằng phương pháp đục lỗ thạch [3].<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Kết quả lựa chọn chủng xạ khuẩn Micromonospora<br /> VTCC và môi trường nuôi cấy thích hợp<br /> Khảo sát 3 chủng xạ khuẩn được nuôi cấy<br /> sinh enzyme trong ba môi trường khác nhau là YS,<br /> ISP-4, Gause-I có bổ sung cơ chất cảm ứng CMC<br /> 0,5%, pH 7,0, lắc 180 v/phút ở nhiệt độ 30oC. Sau<br /> 72 giờ, chọn chủng Micromonospora VTCC-A-1787<br /> tiếp tục nghiên cứu do khả năng sinh tổng hợp<br /> cellulase cao trong môi trường ISP-4 với đường kính thủy<br /> phân ban đầu là 15mm, hoạt tính 92,0 ± 0,011 UI/ml.<br /> <br /> Hình 1. Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 và khả năng sinh enzyme<br /> trong các môi trường nuôi cấy<br /> <br /> Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả<br /> năng lên men và sử dụng 4 nguồn đường là glucose,<br /> fructose, lactose và sucrose, không có khả năng<br /> đồng hóa manitol, saccharose. Chịu được nồng độ<br /> muối 4%, có khả năng sinh tổng hợp protease và<br /> amylase. Dựa vào mật độ tế bào A620nm cho thấy<br /> chủng Micromonospora VTCC-A-1787 sinh trưởng<br /> và phát triển có sinh khối đạt giá trị cao nhất ở môi<br /> trường ISP-4 sau 72 giờ nuôi cấy (OD620 = 1,554),<br /> do đó chọn thời điểm này để tiếp giống nuôi sinh<br /> enzyme với tỷ lệ 10%.<br /> <br /> 110 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> 2. Kết quả xác định nồng độ cơ chất cảm ứng,<br /> nguồn và nồng độ carbon, nitrogen<br /> Chọn chế độ nuôi cấy lắc 180v/phút tạo ra oxy<br /> hòa tan, giúp các chất dinh dưỡng phân bố đều<br /> trong môi trường, làm tăng trao đổi chất dinh dưỡng<br /> là điều kiện cần thiết để chủng Micromonospora<br /> VTCC-A-1787 sinh trưởng và sinh tổng hợp<br /> enzyme tốt.<br /> Theo kết quả nghiên cứu (bảng 1a) cho thấy<br /> nồng độ chất cảm ứng CMC có ảnh hướng rất lớn<br /> đến khả năng sinh tổng hợp cellulase. Với điều kiện<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> bình thường enzyme được tổng hợp với một số<br /> lượng cơ bản tương đối ít, nhiều khi khó phát hiện,<br /> nhưng khi tăng một lượng CMC nhất định vào môi<br /> trường nuôi cấy thì hàm lượng cellulase được tổng<br /> hợp sẽ tăng lên. Tuy nhiên nếu cứ tiếp tục tăng<br /> nồng độ CMC, sẽ làm cho độ nhớt của môi trường<br /> tăng gây ảnh hưởng đến bề mặt trao đổi chất của<br /> vi sinh vật, hạn chế trao đổi chất, làm tăng áp suất<br /> thẩm thấu gây ra hiện tượng co nguyên sinh chất,<br /> <br /> Số 1/2014<br /> làm nước tự do trong tế bào ra ngoài. Kết quả<br /> nghiên cứu chọn nồng độ CMC thích hợp bổ sung<br /> vào môi trường nuôi cấy là 1,5% cho hoạt tính cao<br /> nhất là 141,3UI/ml.<br /> Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn<br /> carbon và nitrogen (bảng 1b và 1c) cho thấy chủng<br /> Micromonospora VTCC-A-1787 thích hợp với<br /> carbon phức tạp ở dạng thô như phế phẩm bã mía,<br /> với nguồn nitrogen hữu cơ là bột cá.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hoạt tính enzyme<br /> Nồng độ CMC, (b) Nguồn carbon, (c) Nguồn nitrogen<br /> Nồng độ CMC<br /> (%)<br /> <br /> Hoạt tính<br /> (UI/ml)<br /> <br /> Nguồn carbon<br /> (Nồng độ 1%)<br /> <br /> Hoạt tính cellulase<br /> (UI/ml)<br /> <br /> 0<br /> 0.5<br /> 1<br /> 1.5<br /> 2<br /> 2.5<br /> 3<br /> <br /> 20,8 ± 0,025<br /> 110,3 ± 0,02<br /> 117,7 ± 0,03<br /> 141,3 ± 0,025<br /> 118,5 ± 0,04<br /> 73,7 ± 0,01<br /> 45,2 ± 0,034<br /> <br /> Bã mía<br /> Bã rơm<br /> Cao nấm men<br /> Mật rỉ đường<br /> Mùn gỗ<br /> Tinh bột bắp<br /> Tinh bột gạo<br /> Tinh bột sắn<br /> Tinh bột tan<br /> <br /> 148,6 ± 0,035<br /> 76,1 ± 0,02<br /> 95,7 ± 002<br /> 10,2 ± 0,01<br /> 11,9 ± 0,015<br /> 77,8 ± 0,011<br /> 100,1 ± 0,01<br /> 126,6 ± 0,02<br /> 119,3 ± 0,02<br /> <br /> Glucose<br /> <br /> 49,3 ± 0,02<br /> <br /> Fructose<br /> Sucrose<br /> Lactose<br /> <br /> 58,2 ± 0,025<br /> 51,7 ± 0,01<br /> 102,2 ± 0,025<br /> <br /> (a)<br /> Nguồn nitrogen<br /> (Nồng độ 0,2%)<br /> Bột cá<br /> Bột đậu tương<br /> Pepton<br /> <br /> Hoạt tính cellulase (UI/ml)<br /> 164, 1 ± 0,045<br /> 112,0 ± 0,056<br /> 151,8 ± 0,026<br /> <br /> NaNO3<br /> <br /> 84,3 ± 0,040<br /> <br /> (NH4)2SO4<br /> Urea<br /> <br /> 125,8 ± 0,035<br /> 26,5 ± 0,030<br /> <br /> (c)<br /> <br /> (b)<br /> Kết quả cho thấy khi bổ sung bã mía với nồng độ 2% và bột cá 0,4% thì khả năng sinh tổng hợp cellulase<br /> cao nhất với hoạt tính lần lượt là 148,6UI/ml và 164,1UI/ml.<br /> 3. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy quy hoạch Box – Behnken<br /> Sau khi xác định các khoảng điều kiện nuôi cấy thích hợp: nhiệt độ (30÷40oC), pH (6,0÷7,0), thời gian<br /> (120÷14h). Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các điều kiện này, nhằm xác định mối quan hệ tương tác của 3 yếu tố<br /> này, hàm mục tiêu của quá trình nuôi cấy là đạt hoạt tính enzyme cao nhất. Kết quả được trình bày trong hình 2.<br /> <br /> Hình 2. Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzyme ở các khoảng yếu tố khác nhau<br /> X3, pH 6,5; (b) X2, Thời gian 132 giờ; (c) X1, Nhiệt độ 32,5oC<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 111<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Phương trình hồi quy được chấp nhận với<br /> R2 = 0,9815, p < 0,05:<br /> Y= 188.2 + 6.0125X1 + 3.6625X2 + 0.725X3<br /> +3.875X1X2 – 10.6X1X3 + 1.45X2X3 – 16.7625X12<br /> - 28.7625X22 – 15.1375X32<br /> Kết quả cho thấy nhiệt độ là yếu tố có ảnh<br /> hưởng trực tiếp và rõ ràng nhất đến sự sinh trưởng<br /> và phát triển, khả năng tổng hợp cellulase của chủng<br /> Micromonospora VTCC-A-1787. Tùy theo điều kiện<br /> sản xuất, có thể cố định một yếu tố và thay đổi thông<br /> số khác trong khoảng tương ứng thích hợp. Xác định<br /> điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu được cellulase có<br /> hoạt độ cao: Môi trường cải tiến ISP-4 với pH 6,5;<br /> ở nhiệt độ 33oC ± 1, tốc độ lắc 180v/phút, thời gian<br /> nuôi cấy 132 giờ, cellulase thu được có hoạt độ cao<br /> 188,93UI/ml. Việc tăng nồng độ CMC 1,5%, thay thế<br /> nguồn carbon là bã mía 2%, nguồn nitrogen là bột<br /> cá 0,4% vào môi trường giúp tăng hoạt tính enzyme.<br /> 4. Kết quả xác định tác nhân kết tủa<br /> Mỗi enzyme sẽ có loại tác nhân kết tủa thích<br /> hợp, khi đó C-CPE thu được sẽ có hoạt độ cao<br /> nhất. Trong quá trình thu nhận và làm sạch enzyme<br /> thì phương pháp tủa bằng ethanol 96o cho hiệu<br /> quả và hoạt tính cao hơn so với aceton 99,5% ở<br /> nồng độ thích hợp là 75% (216,2UI/g) và dung dịch<br /> (NH4)2SO4 bão hòa không có hiện tượng kết tủa.<br /> Bảng 2. Ảnh hưởng tác nhân kết tủa<br /> đến hoạt độ enzyme<br /> Dung môi hữu cơ<br /> <br /> Hiệu suất<br /> Khối lượng kết<br /> Hoạt độ<br /> thu nhận<br /> tủa trung bình (g)<br /> CPE (UI/g)<br /> (%)<br /> <br /> Aceton 99,5%<br /> <br /> 1,61 ± 0,035<br /> <br /> 4,03<br /> <br /> 152,7 ±<br /> 0,023<br /> <br /> Ethanol 960<br /> <br /> 2,57 ± 0,047<br /> <br /> 6,43<br /> <br /> 216,2 ±<br /> 0,01<br /> <br /> Ammonium sulfate<br /> <br /> Không có hiện tượng kết tủa<br /> <br /> Khi tăng nồng độ ethanol từ 60% lên 75% thì<br /> hoạt độ cellulase tăng lên và đạt giá trị cực đại ở<br /> nồng độ 75%. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ<br /> kết tủa đến 80% thì hoạt độ enzyme sẽ giảm vì gây<br /> biến tính enzyme. Điều này có thể giải thích khi ở<br /> nồng độ thấp thì chưa đủ gây kết tủa hoàn toàn hết<br /> enzyme có trong dịch thể, nếu tăng nồng độ vượt<br /> ngưỡng cho phép thì sẽ gây biến tính enzyme.<br /> <br /> 112 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Số 1/2014<br /> 5. Kết quả thủy phân rong mứt Porphyra<br /> vietnamensis sử dụng chế phẩm enzyme kỹ<br /> thuật từ Micromonospora VTCC-A-1787<br /> Bước đầu ứng dụng enzyme C-CPE cellulase<br /> từ Micromonospora VTCC-A-1787 thủy phân rong<br /> mứt với tỷ lệ C-CPE với nguyên liệu là 2%, nhiệt độ<br /> 45oC, pH 6,0, lượng nước là 1:1 (v/w) so với nguyên<br /> liệu, lắc 180 v/phút. Sau 48 giờ cho thấy enzyme<br /> này đã có tác động, làm giảm lượng cellulose của<br /> rong và làm tăng hàm lượng đường khử ban đầu.<br /> Bảng 3. Thành phần dinh dưỡng bột rong<br /> trước và sau khi thủy phân<br /> STT<br /> <br /> Tên chỉ tiêu<br /> <br /> Hàm lượng (%)<br /> Trước<br /> <br /> Sau<br /> <br /> 1<br /> <br /> Protein<br /> <br /> 38<br /> <br /> 42,4<br /> <br /> 2<br /> <br /> Lipid<br /> <br /> 1,5<br /> <br /> 0,8<br /> <br /> 3<br /> <br /> Cellulose<br /> <br /> 39,2<br /> <br /> 13,5<br /> <br /> 4<br /> <br /> Đường khử<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 14,12<br /> <br /> 5<br /> <br /> Tro<br /> <br /> 2,6<br /> <br /> 2,1<br /> <br /> 6<br /> <br /> Độ ẩm<br /> <br /> 13,1<br /> <br /> 12,3<br /> <br /> Về thành phần dinh dưỡng: bột rong đã đáp<br /> ứng được nhu cầu dinh dưỡng và đảm bảo chỉ tiêu<br /> vi sinh vật dành cho thực phẩm yêu cầu gia nhiệt<br /> trước khi sử dụng. Tuy nhiên, đánh giá chất lượng<br /> cảm quan của bột rong thì chưa đạt yêu cầu, do<br /> khả năng hòa tan trong nước còn thấp, độ tan chỉ<br /> đạt 68%.<br /> IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ<br /> 1. Kết luận<br /> Theo các kết quả nghiên cứu, chủng<br /> Micromonospora VTCC-A-1787 được chọn để nuôi<br /> cấy sinh tổng hợp cellulase trong môi trường ISP-4,<br /> pH 6,5, lắc 180 v/phút ở 33oC sau 132 giờ. Nồng độ<br /> chất cảm ứng CMC tối ưu là 1,5%, nguồn carbon<br /> và nitrogen thích hợp là bã mía với tỷ lệ 2% và bột<br /> cá 0,4%. Đã thu được C-CPE cellulase có hoạt độ<br /> cao nhất là 216,2UI/g, sử dụng tác nhân kết tủa là<br /> ethanol 96o ở nồng độ 75%, thời gian kết tủa là một<br /> giờ ở 4oC. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của<br /> C-CPE cellulase của chủng Micromonospora<br /> VTCC-A-1787 là 45oC, pH 6,0.<br /> Ứng dụng chế phẩm enzyme này thủy phân<br /> rong thu được bột rong cho chất lượng đạt yêu cầu.<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy đánh giá cảm quan<br /> sản phẩm rong biển khá tốt về chất lượng màu, mùi<br /> và vị, hàm lượng protein và đường tăng lên, hàm<br /> lượng lipid và cellulose giảm, điều này có nghĩa<br /> cellulase đã có tác động đến hệ cellulose trong rong,<br /> <br /> Số 1/2014<br /> giúp thủy phân cellulose và tạo thành một lượng<br /> đường khử tương ứng.<br /> 2. Kiến nghị<br /> Tiếp tục nghiên cứu phương pháp và chế độ<br /> sấy để sản phẩm bột rong được tốt hơn.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Tiếng Việt<br /> 1.<br /> <br /> Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998. Công nghệ enzyme. NXB Nông nghiệp.<br /> TP. HCM.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến,<br /> Phạm Văn Ty, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật - Tập 2 và 3, NXB Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ thuật Sinh hóa. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. NXB Đại học Quốc gia TP. HCM.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa, 2004. Chế biến rong biển. NXB Nông nghiệp.<br /> TP. HCM.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Nguyễn Đức Lượng, 2003. Thí nghiệm vi sinh vật học – Tập II. NXB Đại học Quốc gia TP. HCM.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> Trần Linh Thước, 2007. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> Teruo Nakakuki (Ed.), 1993. Oligosaccharides: Production, Properties and Applications, Japanese, Technology Reviews,<br /> Vol. 3, No. 2, Gordon and Breach. Switzerland.<br /> <br /> Tiếng Anh<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 113<br /> <br />