Thực hành ứng dụng gen trị liệu - PGS. TS Nguyễn Văn Kình

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:374

Thêm vào BST

Báo xấu

246
lượt xem 39
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính: Chương 1. Liposome cationic; Chương 2. Cô đặc DNA và sự vận chuyển gen qua trung gian receptor; Chương 3. Nhiễm sắc thể động vật có vú - viễn cảnh của gen trị liệu; ....; Chương 7. Các vector adenovirus liên hợp (AAV)

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thực hành ứng dụng gen trị liệu - PGS. TS Nguyễn Văn Kình

P GS.TS Nguy ễ n V ă n Kình (C h ủ b iên) T S Nguy ễ n Qu ố c Tu ấ n – B S Nguy ễ n Tu ấ n Anh T h ự c hành ứ ng d ụ ng GEN TRỊ LIỆU N hà xu ấ t b ả n Y H ọ c 2007
L Ờ I GI Ớ I THI Ệ U Úng dụng công nghệ sinh học trong Y Học là nhiệm vụ trọng tâm của ngành Y tế hiện nay. Gen trị liệu thể hiện rõ ràng là một phương pháp chữa bệnh mới với những tính năng vượt trội, nó có thể chữa khỏi các bệnh nan y như ung thư, HIV-AIDS, viêm gan B, C mà các phương pháp truyền thống đã tỏ ra bất lực. Cuốn sách “Thực hành ứng dụng gen trị liệu” của các tác giả PGS.TS Nguyễn Văn Kình (Chủ biên), TS. Nguyễn Quốc Tuấn, BS. Nguyễn Tuấn Anh - những người đã và đang công tác nhiều năm tại Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã đề cập tới những vấn đề nóng bỏng nhất trong lĩnh vực gen trị liệu. Cuốn sách chẳng những đưa ra những luận chứng khoa học hịện đại mà còn gợi ra những ý tưởng cần được quan tâm nhằm phát triển công nghệ này trong điều kiện hoàn cảnh Việt Nam, phục vụ lợi ích cho toàn dân. Các tác giả cuốn sách cũng là những người đầy tâm huyết muốn xây dựng một cơ sở nghiên cứu ứng dụng gen trị liệu với phương châm “khoa học, dân tộc, đại chúng”. Chắc rằng ý tưởng này mau chóng trở thành hiện thực. “Thực hành ứng dụng gen trị liệu” mang đến bạn đọc đầy đủ các thông tin khoa học cập nhật nhất. Thực chất đây là một cuốn sách Y Học Phân tử hiện đại, cung cấp cho chúng ta nhiều thông tin bổ ích mà các sách khác chưa đề cập tới. Thực hành ứng dụng gen trị liệu chắc chắn là tài liệu hữu ích cho các bác sĩ thực hành, những người làm công tác nghiên cứu thực nghiệm Y Học. Sách cũng thực sự có ích cho các sinh viên Y, Dược, các nghiên cứu sinh và tất cả những ai quan tâm tới lĩnh vực gen trị liệu. Nhà xuất bản Y Học trân trọng giới thiệu cuốn sách “Thực hành ứng dụng gen trị liệu” tới các bạn độc giả. N HÀ XU Ấ T B Ả N Y H Ọ C 2
L Ờ I NÓI Đ Ầ U Những người mắc các bệnh nan y như ung thư, HIV-AIDS, u não hay viêm đa khớp dạng thấp v.v..có thể được cứu sống. Câu chuyện tưởng như viễn tưởng, nhưng nó lại là hiện thực ở thời đại ngày nay. Trong cuốn sách này chúng tôi muốn chuyển tải tới bạn đọc những thành quả mới nhất của gen trị liệu. Sách bao hàm đầy đủ thông tin về các thí nghiệm tiền lâm sàng, lâm sàng thuộc nhiều chuyên khoa từ những năm khởi đầu của gen trị liệu (1990) cho tới thời điểm cuốn sách ra đời. Phần thứ nhất của sách đề cập tới các phương pháp vận chuyển gen. Đây là vấn đề mấu chốt nhất quyết định sự thành công của gen trị liệu. Ngoài các vec tơ thông thường như retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno liên hợp, những phương thức chuyển gen khác hoàn toàn mới cũng được đề cập như liposome cationic, nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú hay những vec tơ thiết kế đặc biệt để chuyển gen tới hệ thần kinh v.v.. Phần thứ hai của sách là các phương pháp điều trị cụ thể các bệnh di truyền như bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng (SCID), bệnh xơ nang, bênh đau cơ Ducchenne, các bệnh thuộc hemoglobin, các bệnh liên quan tới lysosome. Một số bệnh “nhạy cảm” được đặc biệt quan tâm cũng được đề cập như: điều trị thâm nhiễm HIV (chương XIV), điều trị các bệnh ung thư (chương XV), điều trị các bệnh gan (chương XVI), điều trị các bệnh tim mạch (chương XVII), điều trị các bệnh thuộc hệ thần kinh (chương XVIII), điều trị bệnh u não (chương XIX), điều trị viêm đa khớp dạng thấp (chương XX). Sách dẫn chứng đầy đủ các thông tin cần thiết, những kết quả đã đạt được và cả những khó khăn phải đương đầu trong hiện tại và tương lai. “Thực hành ứng dụng gen trị liệu” có thể giúp ích cho các bác sĩ lâm sàng, các nhà nghiên cứu Y, Sinh, Dược học, các nghiên cứu sinh ngành công nghệ sinh học, các sinh viên Y , Dược và nó cũng bổ ích cho bất kỳ ai muốn tìm hiểu về một bệnh nào đó mà mình quan tâm. Để đỡ mất thời gian tra cứu của độc giả, phần cuối của sách chúng tôi có ghi chú những vấn đề liên quan tới sự chuyển và biểu hiện gen như sinh học virus, các tế bào gốc, sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Đây là những khía cạnh khoa học hiện đại mới chỉ xuất hiện trong những năm gần đây nhất nhưng lại rất cần thiết để lý giải các khía cạnh khoa học đương thời. Điều đặc biệt lưu ý là những kết quả bước đầu trong lĩnh vực khoa học non trẻ này đã khẳng định những khả năng vượt trội của nó và rõ ràng gen trị liệu là một vũ khí tinh nhuệ nhất của Y học thế kỷ 21. Những kết quả đạt được có thể là những định hướng quan trọng cho các nhà nghiên cứu. Hy vọng những thành quả mới đạt được trong tương lai sẽ giải quyết tận gốc các vấn đề bệnh tật, nâng cao tuổi thọ của con người. Để hoàn tất cuốn sách này chúng tôi xin trân trọng cám ơn các nhà khoa học trong và ngoài nứớc đã động viên, khích lệ và cung cấp cho chúng tôi những tài liệu quý báu trong quá trình biên soạn. Chúng tôi xin trân trọng cám ơn Nhà Xuất bản Y Học đã tạo điều kiện tốt nhât để cuốn sách sớm đến tay độc giả. Vì thời gian biên soạn gấp và trình độ của các tác giả có hạn nên những sai sót trong sách là không thể tránh khỏi. Chúng tôi mong nhận được sự đóng góp từ các độc giả, các nhà khoa học và các đồng nghiệp. Một lần nữa chúng tôi xin trân trọng cám ơn. Hà Nội ngày 19 tháng 5 năm 2007 Các tác giả 3
M Ụ C LUC Lời giới thiệu Lời nói đầu Phần thứ nhất: NHỮNG PHƯƠNG TIỆN CHUYỂN GEN C h ươ ng I. Liposome cationic 1.1 Mở đầu 1.2 Cơ chế tyác động của các liposome cationic 1.3 Chuyển gen qua trung gian lipid tới biểu mô bì phân cực 1.4 Phát hiện các lipid cationic 1.5 Lipid thải chậm 1.6 Nâng cấp các plasmid 1.7 Các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng 1.8 Vấn đề điều hòa phức hợp DNA-lipid C h ươ ng II. Cô đ ặ c DNA và s ự v ậ n c huy ể n gen qua trung gian receptor 2.1 Mở đầu 2.2 Vận chuyển gen qua tẻung gian receptor 2.2.1 Đích ligand 2.2.1.1 Receptor asialoglycoprotein 2.2.1.2 Receptor transferrin 2.2.1.3 Receptor Ig tổng hợp 2.2.1.4 Receptor mannose 2.2.2 Sự cô đặc và hình thành phức DNA 2.2.3 Sự lưu chuyển và tẩu thoát theo kiểu tiêu hóa nôị bào 2.2.4 Xác định đích và sự chuyển vị nhân 2.3 Kết luận C h ươ ng III. Nhi ễ m s ắ c th ể đ ộ ng v ậ t có vú - v i ễ n c ả nh c ủ a gen tr ị l i ệ u 3.1 Mở đầu 3.2 Sự cần thiết phải kiến tạo một nhiễm sắc thể nhân tạo 3.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú lý tưởng (MAC) 3.4 Các chiến lược tạo NST nhân tạo động vật có vú (ĐVCV) 3.4.1 Cách tiếp cận từ trên xuống (top-down) 3.4.2 Cách tiếp cận từ dưới lên (bottom-up) 3.5 Các vấn đề thực tiễn tồn tại 3.6 Kết luận C h ươ ng IV. Các vec t ơ r etrovirus 4.1 Mở đầu 4.2 Chu kỳ (vòng) sao chép của retrovirus 4.2.1 Những dữ kiện kinh điển 4.2.2 Sự hợp nhất của DNA virus vào trong hệ gen tế bào chủ 4.2.3 Sự sao chép, phiên dịch và lắp ráp 4.3 Phát hiện các vec tơ retrovirus 4.3.1 nguyên lý 4
4.3.2 Những bước cải tiến 4.4 Đích thâm nhiễm 4.5 Sự biểu hiện gen từ các vec tơ retrovirus 4.5.1 Xem xét chung 4.5.2 Đích thâm nhiễm 4.5.3 Các promoter có thể cảm ứng được 4.6 Độ chuẩn và tính ổn định của các vec tơ retrovirus 4.7 Các vec tơ lentivirus 4.8 Viễn cảnh và kết luận C h ươ ng V. Các vec t ơ l entivirus 5.1 Mở đầu 5.2 Các cấu trúc gen của lentivirus 5.2.1 Lợi thế của các vec tơ lentivirus 5.2.2 Những bất lợi của các vec tơ lentivirus 5.3 Các vec tơ cơ sở lentivirus 5.3.1 Các ảnh hưởng khác nhau đối với sự đóng gói 5.3.2 Chuyển gen trực tiếp 5.3.3 Virus trợ giúp trung gian 5.3.4 Các hệ thống cộng nhiễm 5.3.4.1 Bổ sung vỏ 5.3.4.2 Sự cộng nhiễm khi sử dụng vec tơ độc lập và các cấu trúc đóng gói 5.3.4.3 Cộng nhiễm với 3 plasmid 5.3.5 Các donmg tế bào đóng gói 5.3.5.1 Các vấn đề protein 5.3.5.2 Các cấu trúc có thể cảm ứng được 5.3.6 Sự giả vỏ 5.3.7 Sự chuyển giao protein 5.3.8 Độ chuẩn virus 5.4 Phạm vi ứng dụng 5.5 Độ an toàn C h ươ ng VI. Các vect ơ a denovirus 6.1 Mở đầu 6.2 Cấu trúc và tổ chức của adenovirus 6.3 Thiết kế và cấu trúc vec tơ adenovirusnguwowif khiếm khuyết sao chép 6.4 Sự nhân giống và làm tinh khiết các vec tơ adenovirus 6.5 Chuyển gen in vivo qua trung gian adenovirus 6.6 Đánh lừa đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với sự chuyển gen adenovirus in vivo. C h ươ ng VII. Các vec t ơ a denovirus liên h ợ p (AAV) 7.1 Mở đầu 7.2 Tính chất sinh học của AAV 7.2.1 Phân lại và lịch sử rự nhiên của AAV 7.2.2.Cấu trúc AAV và hệ gen của nó 7.2.3 Chu kỳ sống của AAV 5
7.2.4 Tính đặc hiệu vị trí của sự hợp nhất AAV 7.3 Các vec tơ tái tổ hợp từ AAV 7.3.1 Cấu trúc của các vec tơ AAV tái tổ hợp 7.3.2 Chiến lược đóng gói các vec tơ AAV TÁI TỔ HỢP 7.3.3 Sự tồn tại của DNA vectơ trong các tế bào đích 7.3.4 Các yếu tố của tế bào vật chủ tác động tới sự tải nạp vec tơ AAV 7.3.5 Tóm tắt những tiện lợi và bất tiện của các vec tơ tải nạp AAV 7.4 Ứng dụng của vec tơ AAV 7.4.1 Ứng dụng in vitro 7.4.2 Ứng dụng in vivo 7.5 Vấn đề an toàn 7.5.1 Những vấn đề liên quan tới tính an toàn 7.5.2 Vấn đề an toàn môi trường C h ươ ng VIII. Nh ữ ng ti ế n b ộ đ ạ t đ ượ c trong các vec t ơ H SV công ngh ệ h óa d ùng đ ể c huy ể n gen t ớ i h ệ t h ầ n kinh 8.1 Mở đầu 8.2 Đặc điểm sinh học của HSV 8.3 Phát triển các vec tơ HSV cho hệ thần kinh 8.3.1 Loại trừ các chức năng phụ để nâng cao khả năng của gen ngoại lai 8.3.2 Độc tính tế bào cảu các vec tơ hợp nhất 8.3.3 Hệ thống promoter đối với sự biểu hiện gen chuyển 8.3.3.1 Sự biểu hiện tức thì 8.3.3.2 Sự biểu hiện dài hạn 8.3.3.3 Điều hòa sự biểu hiện gen chuyển 8.3.4 HSV amplicon 8.3.5 Các vec tơ lai HSV-AAV mới 8.4 Tóm tăt chung và triển vọng của các vec tơ dùng trong hệ thần kinh Phần thứ hai: GEN TRỊ LIỆU LÂM SÀNG C h ươ ng IX. Gen tr ị l i ệ u b ệ nh thi ế u h ụ t mi ễ n d ị ch t ổ h ợ p tr ầ m tr ọ ng (SCID) 9.1 Mở đầu 9.2 Bệnh lý phân tử của SCID 9.2.1 Thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng liên quan tới NST giới tính 9.2.2 Khiếm khuyết JAK-3 9.2.3 Thiếu hụt adenosine desaminase và purine nucleoside phosphorylase 9.2.4 Khiếm khuyết gen hoạt hóa tái tổ hợp (RAG1 và RAG2) 9.2.5 Khiếm khuyết ZAP 70 9.2.6 Thiếu hụt MHC lớp I (hội chứng lympho trần type I) 9.2.7 Thiếu hụt miễn dịch MHC lớp II (hội chứng lympho trần type II) 9.2.8 Những bất thường TCR-CD3 9.3 Gen trị liệu soma đối với bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng trong SCID 9.3.1 Gen trị liệu lâm sàng đối với ADA-SCID 9.3.2 Gen trị liệu lympho T đopói với ADA-SCID 6
9.4 Cải tiến các hệ thống vec tơ 9.5 Đánh giá tiền lâm sàng sự chuyển gen tế bào gốc của sự tạo máu C h ươ ng X. Đ i ề u tr ị b ệ nh x ơ n ang 10.1 Mở đầu 10.2 Đặc trưng di truyền của bệnh xơ nang 10.3 Protein CFTR và bệnh học của bệnh xơ nang (CF) 10.4 Điều trị bệnh xơ nang 10.5 Hệ thống chuyển gen và bệnh xơ nang 10.5.1 Cơ sở lý luận 10.5.2 Chuyển gen qua trung gian retrovirus 10.5.3 Chuyển gen qua trung gian adenovirus 10.5.4 Chuyển gian qua trung gian virus adeno liên hợp 10.5.5 Chuyển gen qua trung gian lipid cationic 10.6 Kết luận C h ươ ng XI. Đ i ề u tr ị c ác b ệ nh thu ộ c hemoglobin 11.1 Mở đầu 11.2 Vec tơ retrovirus cho globin 11.3 các vec tơ virus adeno liên hợp 11.4 Tái tổ hợp tương đồng và sự sửa chữa 11.5 Trị liệu gen gián tiếp bệnh thiếu máu vùng biển 11.5.1 Hiệu ứng ghép nối bất thường 11.5.2 Hoạt hóa các gen bù 11.5.3 Chuyển gen tạo hồng cầu 11.5.4 Giảm biểu hiện gen globin 11.5.5 Các kiểu GTL khác 11.6 Điều trị bệnh tế bào liềm 11.7 Viễn cảnh tương lai C h ươ ng XII. Đ i ề u tr ị b ệ nh đ au coe Ducchenne 12.1 Mở đầu 12.2 Các đặc trưng bệnh lý và lâm sàng 12.3 Gen dystrophin và các sản phẩm của nó 12.4 Sự định vị và chức năng của dystrophin 12.5 Các hệ thống mô hình của bệnh đau cơ Ducchenne (DMD) 12.6 Những cách tiếp cận đối với việc điều trị bệnh DMD 12.7 Điều trịo bệnh DMD: Ghép nguyên bào cơ 12.8 Gen trị liệu bệnh DMD 12.8.1 Tiêm trực tiếp DNA 12.8.2 Các vec tơ retrovirus 12.8.3 Các vec tơ adenovirus 12.9 hay đổi các chiến lược trị liệu 12.10 Kết luận C h ươ ng XI II. Đ i ề u tr ị n h ữ ng b ệ nh liên quan t ớ i lysosome 7
13.1 Mở đầu 13.2 Xác định quần thể bệnh nhân 13.3 Điều trị chuẩn và điều trị “thực nghiệm” 13.3.1 Chăm sóc chu đáo 13.3.2 Thay thế enzyme 13.3.3 Ghép tủy xương 13.4 Các mô đích của GTL 13.4.1 Ghép các tổ chức mới 13.4.2 Thao tác với các tế bào lympho 13.4.3 Ghép tủy xươngb tự thân 13.4.4 Đích trực tiếp của hệ TKTƯ 13.5 Kết luận C h ươ ng XIV. Đ i ề u tr ị t hâm nhi ễ m HIV 14.1 Mở đầu 14.2 Tổ chức gen HIV 14.3 Chu kỳ sống (vòng đời) và bệnh lý học của thâm nhiễm HIV 14.4 Những cách tiếp cận nhằm ức chế sự sao chép của HIV 14.4.1 Những protein không trans trội 14.4.2 Các kháng thể chuỗi đơn 14.4.3 Các protein tế bào nội sinh và các tác nhân kháng HIV 14.5 Các cáh tiếp cận GTL vopứi cơ sở acid nucleic 14.5.1 Bẫy RNA 14.5.2 Antisense DNA và RNA 14.5.3 ribozyme (antisense RNA xúc tác) 14.6 Các cách tiếp cận nhằm kích thích đáp ứng miễn dịch đặ hiệu HIV 14.6.1 Các vaccine DNA 14.6.2 Các lympho T gây độc tế bào đặc hiệu HIV 14.7 Các khía cạnh thực tiễn của gen trị liệu HIV 14.7.1 Các đích tế bào của GTL 14.7.2 các hệ thống chuyển gen 14.7.3 Các thử nghiệm lâm sàng GTL kháng HIV 14.7.3.1 Đánh dấu các tế bào T đồng gen 14.7.3.2 Đánh dáu các tế bào T độc tế bào 14.7.3.3 Rev trans trội 14.7.3.4 Rev trans trội trong sự tổ hợp với antisense TAR 14.7.3.5 Các ribozyme kháng HIV 14.7.3.6 Vaccinne gen 14.7.3.7 Các kháng thể nội bào 14.8 Kết luận C h ươ ng XV. Đ i ề u tr ị c ác b ệ nh ung th ư 15.1 Mở đầu 15.2 Cơ sở di truyền của gây ung thư 15.2.1 Chu kỳ tế bào 15.2.2 Sự chết theo chương trình của tế bào –apoptosis 8
15.2.3 Sự biến nạp tế bào 15.2.4 Các gen gây ung thư 15.2.5 Các gen kiềm chế ung thư 12.5.6 Các gen sử chữa DNA 15.3 Gen trị liệu ung thư 15.3.1 Tăng cườngkiềm chế ung thư 15.3.1.1 Retriovirus 15.3.1.2 Adenovirus và virus adeno liên hợp 15.3.1.3 Các hệ thống chuyển gen không phải là virus 15.3.2 Làm bất hoạt biểu hiện quá mức các gen ung thư 15.3.3 Trị liệu với tiền thuốc đích (targeted prodrug) 15.3.4 Cải biến đáp ứng miễn dịch kháng u 15.3.4.1 Miễn dịch khối u qua trung gian tế bào 15.3.4.2 Các cytokine 15.3.4.3Sự kiềm chế miễn dịch 15.4 Các vaccine kháng ung thư DNA 15.4.1 Các vaccine cơ sở vec tơ 15.4.2 Tiêm chủng vaccine cơ sở tế bào 15.4.2.1 Các vaccine khối u cải biến gen 15.4.2.2 Tiêm chủng với các tế bào phân nhánh (dendritic) 15.4.3 các vaccine cơ sở idiotype 15.5 Tóm lại C h ươ ng XVI. Đ i ề u tr ị c ác b ệ nh gan 16.1 Mở đầu 16.2 Nguyên lý chung của GTL với gan 16.3 Các vec tơ virus 16.3.1 Retrovirus 16.3.2 Adenovirus 16.3.3 Virus adeno liên hợp 16.3.4 Các vec tơ không virus 16.3.4.1 Liposome 16.3.4.2 Các phức hợp protein-DNA 16.4 Những ứng dụng lâm sàng của GTL trực tiếp bệnh cholesterol cao có tính chất gia đình 16.4.1 Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình 16.4.2 Bệnh ưa chảy máu hemophilia B 16.4.3 Bệnh thiếu hụt 1-antitrypsin 16.4.4 Hội chứng Crigler-Najjar 16.5 Gen trị liệu với thâm nhiễm virus 16.5.1 Bệnh viêm gan virus mạn 16.5.2 Virus gây viêm gan B 16.5.3 Virus gây viêm gan C 16.6 Ung thư tế bào gan 16.7 Bệnh gan do alcohol 9
Ch ươ ng XVII. Đ i ề u tr ị c ác b ệ nh tim m ạ ch 17.1 Mở đầu 17.2 Thao tác gen đối với mô tim mạch 17.2.1 Sự điều biến biểu hiện gen trong các mô tim mạch 17.2.2 Vec tơ chuyển giao DNA tim mạch 17.2.2.1 Plasmid 17.2.2.2 Các vec tơ retrovirus không sao chép tái tổ hợp 17.2.2.3 Adenovirus tái tổ hợp 17.2.2.4 Virus adeno liên hợp (AAV) 17.2.3 Kiểm soát sự biểu hiện gen trong mô tim mạch 17.3 Gen trị liệu hẹp van tim tái phát 17.3.1 Sinh lý bệnh học của hẹp van tim tái phát 17.3.2 Các cách tiếp cận để kiềm chế tế bào và gây độc tế bào 17.4 Gen trị liệu sự tạo mạch 17.4.1 Sự tạo mạch và các yếu tố của sự tạo mạch 17.4.2 Gen trị liệu sự tạo mạch 17.5 Gen trị liệu sự ghép mạch 17.5.1 những cải biến sinh học đối với ghép tĩnh mạch 17.5.2 Công nghệ sinh học và gen trị liệu 17.6 Gen trị liệu các bệnh tim 17.6.1 Suy tim xung huyết 17.6.2 nhòi máu cơ tim 17.6.3 Thiếu máu cục bộ và sự tưới nước (tái truyền dịch) 17.7 Tóm lại C h ươ ng XVIII. Đ i ề u tr ị c ác b ệ nh thu ộ c h ệ t h ầ n kinh 18.1 Mở đầu 18.2 Sự phức tạp của hệ thần kinh 18.3 Những lệch lạc trong hệ thần kinh 18.4 Các yếu tố dinh dưỡng thần kinh và gen trị liệu 18.4.1 Các yếu tố dinh dưỡng thần kinh 18.4.2 Các mô hình động vật GTL về sự thoái hóa thần kinh 18.4.3 Khai thác các đặc tính của HIV trong việc chuyển gen trong hệ thần kinh 18.4.4 Sự chết theo chương trình của các tế bào và sự thoái hóa thần kinh 18.5 Cấy ghép neuron và các tế bào gốc 18.5.1 Từ cấy ghép thực nghiệmtới các ứng dụng trong lâm sàng 18.5.2 Các tế bào gốc ở não người trưởng thành 18.5.3 Chuyển gen ung thư tới các tế bào thần kinh 18.6 Các bệnh thopái hóa thần kinh trên lâm sàng 18.6.1 Bệnh Alzheimer 18.6.2 Bệnh Parkinson 18.6.3 Bệnh Huntington 18.6.4 Bệnh xơ cứng cột bên teo cơ 18.6.5 Bệnh đa xơ cứng 18.7 Các thử nghiệm lâm sàng test các tế bào biến đổi gen và các yếu tố dinh dưỡng thần kinh đối với thoái hóa thần kinh 10
18.8 Những vấn đề cần quan tâm trong tương lai C h ươ ng XIX. Đ i ề u tr ị b ệ nh u não 19.1 Mở đầu 19.2 Nhân tố cơ bản của các thí nghiệm trị liệu gen với u não 19.3 Các thử ngfhiệm GTL đã được phê chuẩn với việc sử dụng gen HSV-TK đối với các u não 19.3.1 Gen nhạy cảm HSV-TK 19.3.2 Khảo sát các phương pháp chuyển gen cho các khối u ở thần kinh trung ương 19.3.3 Chuyển gen nhạy cảm HSV-TK qua trung gian retrovirus in vivo 19.3.4 Chuyển gen nhạy cảm HSV-TK in vivo qua trung gian adenovirus 19.3.5 Tải nạp ex vivo gen IL-2 và IL-4 của người vào trong nguyên bào cơ hoặc trong các khối u với các vec tơ retrovirus 19.3.6 Chuyển gen antisense IGF-1 ex vivo với một vec tơ plasmid vào các tế bào khối u bản thân 19.3.7 Chuyển gen antisense TGF- ex vivo vào trong các tế bào khối u 19.3.8 Chuyển gen MDR-1 ex vivo vào trong các tế bào gốc tạo máu với các vec tơ rẻttovíu chuột 19.4 Tóm lại C h ươ ng XX. Đ i ề u tr ị v iêm đ a kh ớ p d ạ ng th ấ p 20.1 Mở đầu 20.2 Những vấn đề cần xem xét vè GTL trong viêm đa khớp dạng thấp 20.3 Bệnh lý học của viêm đa khớp dạng thấp 20.4 Chuyển gen tới các tế bào hoạt dịch 20.5 Các mô hình động vật dùng để test gen trị liệu 20.6 Những đích hiện nay của gen trị liệu viêm đa khớp dạng thấp 20.7 Hiện trạng lâm sàng và triển vọng của viêm đa khớp dạng thấp PHỤ LỤC P h ụ l ụ c I. M ộ t s ố k hia c ạ nh sinh h ọ c virus liên quan t ớ i s ự c huy ể n gen 1.1 Hệ gen của virus 1.2 Virus chỉ thâm nhiễm những tế bào xác định 1.3 Sự nhận diện tế bào vật chủ của thực khuẩn thể 1.4 Các thực khuẩn thể đưa acid nucleic của chúng vbào các tế bào vật chủ 1.5 Sự nhận diện tế bào vật chủ của những virus động vật 1.5.1 Sự gắn kết qua các virus trần 1.5.2 Sự gắn kết qua các virus có vỏ 1.6 Các virus động vật vào trong các tế bào vật chủ và sự lột vỏ acid nucleic của chúng P h ụ l ụ c II. Nh ữ ng khái ni ệ m c ơ b ả n v ề t ế b ào g ố c và nh ữ ng ứ ng d ụ ng c ủ a c húng trong gen tr ị l i ệ u 11
2.1 Mở đầu 2.2 Thế nào là tế bào gốc và tầm quan trọng của chúng như thế nào? 2.3 Những đặc tính độc quyền của tất cả các tế bào gốc 2.3.1 Các tế bào gốc không chuyên hóa 2.3.2 Các tế bào gốc có khả năng phân chia và tự phục hồi dfài hạn 2.3.3 Các tế bào gốc có thể sản sinh ra các tế bào chuyên hóa 2.4 Các tế bào gốc của phôi 2.4.1 Các giai đoạn phát triển sớm giữ vai trò quan trọng trong việc sản sinh các tế bào gốc 2.4.2 Phát triển các tế bào gốc của phôi trong phngf thí nghệm 2.4.3 những test trong phòng thí nghiệm để xác định các tế bào gốc của phôi 2.4.4 Kích thích sự biệt hóa các tế bào gốc của phôi 2.5 Các tế bào gốc trưởng thành 2.5.1 Nơi cư trú của các tế bào gốc trưởng thành và những nhiệm vụ của chúng 2.5.2 Các test cần dùng để xác định các tế bào gốc trưởng thành 2.5.3 Những điều đã biết về sự biệt hóa tế bào gốc trưởng thành 2.5.3.1 Những cách biệt hóa bình thường của các tế bào gốc trưởng thành 2.5.3.2 Tính mềm dẻo hay sự chuyển biệt hóa của các tế bào gốc trưởng thành 2.5.4 Một số câu hỏi chủ chốt về các tế bào gốc trưởng thành 2.6 Những điểm giống nhau và khác nhau giữa các tế bào gốc của phôi và tế bào gốc trưởng thành 2.7 Tiềm năng của việc sử dụng các tế bào gốc người và những trở ngại cần phải vượt qua trước khi tiềm năng này trở thành hiện thực P h ụ l ụ c III. S ự c h ế t theo ch ươ ng trình c ủ a t ế b ào 3.1 Chức năng cơ bản của apoptosis 3.1.1 Sự cân bằng nội mô 3.1.2 Sự phát triển và biệt hóa 3.1.3 Chức năng miễn dịch 3.1.4 Sự tiêu hủy tế bào 3.2 Apoptosis ở giun tròn Caenorhabditis elegans 3.3 Các thành phần của chương trình apoptosis ở động vật có xương sống 3.3.1 Caspase: sự chết do ly giải protein 3.3.2 Họ protein Bcl-2 3.3.3 Các đồng yếu tố của sự hoạt hóa caspase 3.3.4 Điều hòa nội bào 3.4 Apoptosis qua trubg gian stress: con đường cytochrome c/Apafl 3.5 Apoptosis phát sinh bởi receptor chế 3.6 Apoptosis và con đường tín hiệu tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH 12
P h ần Th ứ nhất N H Ữ NG PH ƯƠ NG TI Ệ N CHUY Ể N GEN 13
C h ươ ng I L IPOSOME C ATIONIC 1.1 Mở đầu Liposome cationic là các vec tơ tổng hợp làm trung gian cho việc chuyển giao và biểu hiện các gen chuyển (transgene) bên trong các tế bào động vật. Vec tơ này ra đời nhờ những tiến bộ đáng kể đã đạt được trong một số lĩnh vực khoa học. Một điều đã được xác nhận là những cơ chế tác động của thuốc thử đã được hiểu rõ hơn và người ta đã hoàn thiện được phân tử lipid ứng dụng trong việc vận chuyển các gen đặc hiệu in vivo. Tuy nhiên, trong chiến lược này có sự linh hoạt trong việc tiếp cận mới nhằm cải tiến các kỹ thuật điều trị bệnh cho con người. Phức hợp DNA-lipid đã được ứng dụng trong lâm sàng và tiền lâm sàng. Với các kết quả ban đầu đã tạo nên vô số các mô hình có thể ứng dụng được trên người. 1 .2 C ơ c h ế t ác đ ộ ng c ủ a các l iposome - cationic Felgner và cộng sự là những người đầu tiên sử dụng các phân tử lipid có nhóm tích điện dương ở đầu để chuyển gen vào các tế bào nuôi cấy. Một phân tử lipid trung tính chẳng hạn như dioleoyl phosphatidyl ethanolamin (DOPE) đã tạo hiệu quả cho sự chuyển gen. Về mặt hiệu quả, phương pháp này có thể so sánh được với hầu hết các phương pháp chuyển gen khác không phải là vius in vitro và đã thể hiện có hiệu quả với hầu hết các tế bào đã được nghiên cứu. Về cơ chế của quá trình cũng như các đặc tính làm giới hạn sự chuyển gen trung qua lipid thì vẫn chưa rõ hòan toàn. Không giống như các hệ thống chuyển giao thuốc dựa trên cơ sở lipid khác, DNA plasmid không được đóng gói trong lõi của liposome hình cầu, thay vì là DNA cô đặc hơn do các lipid cationic đã phủ lên toàn bộ hoặc một phần plasmid. Dạng bọc áo và cô đặc này của DNA có thể xác định được bằng hiển vi điện tử hoặc đo bằng tính khó nóng chảy của DNA khi xử lý với nuclease in vitro . Mặc dù lúc đầu người ta nghĩ rằng phức hợp DNA-lipid thấm trực tiếp vào màng sinh chất rồi đi vào tế bào chất. Nhưng hiện nay người ta lại cho rằng trong nhiều trường hợp sự tiếp nhận DNA plasmid phải đòi hoỉ quá trình tiêu hòa nội bào (endocytosis) và có thể được tăng cường bởi các thuốc nội thậm thấu (endosomolytic) như chloroquine hoặc thêm vào các virus (adenovirus) có khả năng nội thẩm thẩu trung gian. Những cố gắng nhằm nâng cao hiệu lực sự vận chuyển gen qua trung gian lipid in vitro cũng tập trung vào việc phát triển các mẫu thuốc thử (reagent) lipid mới nhằm tăng sự gắn kết với màng tế bào. Hiệu quả của việc chuyển một dạng tế bào đặc biệt vào trong môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi một tỷ lệ thích hợp lipid:DNA hoặc tỷ lệ của các cationic để trung hòa lipid. Tuy nhiên, vẫn chưa tìm được một hợp chất có hiệu lực để chuyển plasmid vào tế bào chất. Đó là một khía cạnh quan trọng làm hạn chế toàn bộ quá trình. Sự chuyển giao với hiệu lực cao của các phân tử plasmid huỳnh quang hoặc nucleotide huỳnh quang đã được thực hiện ở một vài dạng tế bào và đã chuyển giao gần như 100% DNA vào trong các tế bào nuôi cấy. Việc giải phóng bào chất DNA khỏi liposome là một đặc trưng quan trọng về tính hiệu quả của toàn bộ quá trình. Hiệu lực ấn tượng của sự chuyển giao DNA plasmid tới các tế bào nuôi cấy không phân cực là tương đối thấp. Thậm chí, dưới các điều kiện thích hợp nhất cũng chỉ phát hiện có 1-5% các tế bào đã được chuyển với nhiều dạng 14
khác nhau, như trường hợp chuyển gen -galactosidase (nếu được xét đoán bằng một thử nghiệm tương đối nhậy chẳng hạn như hóa tế bào X-gal). Những trái ngược này dẫn đến giả thuyết cho rằng việc giải phóng các phân tử plasmid khỏi lipid cationic và việc plasmid vào nhân đã làm trở ngại thật sự cho sự biểu hiện gen khi có mặt liposme cationic. Điều đó cũng có thể nghĩ rằng việc chuyển gen cơ sở plasmid đòi hỏi phải vào lúc có sự phân chia tế bào và sự hòa tan đồng thời của màng nhân. Và trong nuôi cấy tế bào thì chỉ có một phần nhỏ tế bào có sự phân bào nguyên nhiễm tích cực vào đúng thời điểm có chuyển giao plasmid, tức là có khả năng chuyên chở các plasmid từ tế bào chất tới nhân để thực hiện sự phiên mã. Người ta đã thử nghiệm các phân tử plasmid được gắn các tín hiệu định vị nhân qua các lỗ nhân (một cải tiến hiện đại nhất làm tăng hiệu lực chuyển gen ở các tế bào không phân cực in vitro). Tuy nhiên, vai trò của màng nhân trong sự chuyển gen qua trung gian lipid quả là phức tạp vì khi kéo dài sự tiếp cận tế bào với phức hợp DNA-lipid (để cho phép một lượng lớn tế bào qua giai đoạn phân chia trong khi chuyển plasmid tới tế bào chất) thì chưa chắc đã làm tăng được hiệu ứng chuyển gen hoặc biểu hiện gen. Hơn nữa, thử nghiệm chuyển các tế bào đồng bộ lại không làm tăng hiệu lực vận chuyển. Khi dùng các phương pháp nhậy để xác định sự biểu hiện gen thì thấy hầu hết các tế bào trong quần thể lại tiềp nhận và biểu hiện gen ngoại lai. Nhưng cũng có một số tế bào xác định trong quần thể lại được chuyển gen ở mức cao, lý do của sự biểu hiện cao này vẫn chưa được rõ. 1 .3 C huy ể n gen qua trung gian lipid t ớ i bi ể u m ô bì phân c ự c Khả năng chuyển các liposome cationic tới các tế bào biểu mô bì đã phân hóa là tương đối yếu đã gợi ý rằng sự phân cực và hình thành các ghép nối vững chắc đã làm giới hạn sự chuyển giao các phân tử DNA plasmid. Sự tăng trưởng của các tế bào biểu mô bì in vitro thường được dùng để mô hình hóa in vivo ở phổi, ruột hoặc các biểu mô khác. Dưới các điều kiện này, sự tiếp nhận và chuyển giao DNA là rất hạn chế và khối plasmid đã vào trong tế bào chất sau này có thể sẽ can thiệp vào hiệu lực chuyển gen. Các chất thấm trung gian như sodium glycholate có thể làm tăng sự tải nạp gen (gene transduction) của phổi chuột, nhưng những tác nhân này cũng làm tăng độc tính. Ít nhất đã có một mô hình chỉ rõ có sự phụ thuộc rất nhiều vào tiêu hóa nội bào (endocytosis) ở các tế bào đã phân hóa và phân cực. Tuy nhiên có thể thu được kết quả nếu sử dụng một liều rất cao phức hợp DNA-lipid in vivo, cơ sở lý luận của vấn đề này vẫn chưa được rõ. Tuy nhiên, việc tạo ra các lipid thế hệ mới hơn có thể sẽ nâng cao được khả năng vận chuyển tới các lớp đơn của biểu bì. Những kết quả này vạch ra một điểm quan trọng là phải lựa chọn cẩn thận các mô hình thích hợp để kiểm tra hiệu lực của lipid cationic in vitro, hoặc phải dự đoán trước các hiệu ứng sinh học in vivo. Với biểu mô bì đã phân hóa (trong các mô như phổi, đường tiêu hóa hoặc trong các khối u đặc) đòi hỏi phải có sự xem xét đặc biệt vì nó có thể là một đích hiệu quả cho sự chuyển gen qua trung gian lipid in vivo. 1 .4 P hát hi ệ n các l ipid cationic Việc phát hiện các lipid cationic tân tiến cho sự chuyển gen phụ thuộc vào các test thực nghiệm của phòng thí nghiệm về các hợp chất mà mỗi hợp chất lại được sàng lọc cho các ứng dụng đặc biệt. Nhìn chung lợi thế cuối cùng thuộc về lipid trung tính có công thức là DOPE. Các hợp chất thuộc thế hệ đầu tiên như DOTMA và DOTAP đã chưa vứt bỏ được 15
các lipid có chứa các nhóm có tiếp đầu là polyamin. Dưới các điều kiện đặc biệt, các chất mới hơn rõ ràng đã làm tăng hiệu lực chuyển giao. Tuy nhiên, công thức tối ưu đặc hiệu vẫn chỉ cho từng dạng tế bào, tức là phải có rất nhiều công thức liposome cationic. Để áp dụng in vivo phải sàng lọc một lượng lớn các vec tơ liposome để xác định được m ột hợp chất có hoạt tính cao. DMRIE (1,2-dimyristyloxypropyl-3- dimethylhydroxyethylamminium bromide) được xác định là một hợp chất chuyển hiệu quả và các gen trị liệu đã được thiết lập ở các khối u đặc trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng. GAPDLRIE cũng được chứng minh là có tiềm năng trong các nghiên cứu in vivo, chẳng hạn như trong việc chuyển và biểu hiện gen trong các tế bào nội mạc mạch (intimal) và các tế bào giữa (medial) động mạch lợn. Một số lipid (gồm DOTMA và các hợp chất thuộc thế hệ sau nữa) đã được công thức hóa đặc biệt cho chuyển giao trong các tĩnh mạch, điều đó đã gợi ra các tín hiệu gen với các mô như phổi và gan. Trong các mô hình thiết kế thì các tế bào Kuffer của hệ thống lưới nội mô ở gan được chú ý hơn cả. Người ta đã xác định được các liposome có công thức đặc biệt phù hợp với việc chuyển gen tới phổi của chuột. Ví dụ như GL-67 là một phức hợp khí dung DNA plasmid dùng để chuyển gen tới phổi chuột hiệu quả cao hơn gần 1000 lần DNA đơn và 100 lần so với các đối tượng khác. Như vậy, lipid tối ưu hóa đã được dùng để chuyển gen tới phổi. Mặc dù vậy, lớp hợp chất này vẫn phải được xác định qua sự sàng lọc chặt chẽ của các phòng thí nghiệm lớn về liposome cationic và người ta đã bắt đầu phân tích hoạt tính – cấu trúc của chúng. Các nghiên cứu về các chất tương tự lớp này như GL-67 thì nhóm cationic đầu hình chữ T có phần mỏ neo của cholesterol gắn với spermine đã làm tăng đáng kể khả năng chuyển gen tới phổi chuột in vivo. Việc cải biến các vùng đặc biệt trong phân tử GL- 67 cho phép nâng cao hơn nữa khả năng hoạt động của thuốc khi sử dụng các phương pháp y hóa học truyền thống. Các lipid cationic guanidium – cholesterol cũng đã được thông báo là các chất chuyển gen trung gian hiệu lực tới phổi động vật. Tuy nhiên, một lipid đặc hiệu lại chỉ có hoạt tính ở các mô đặc hiệu (tức GL-67 chỉ dùng cho phổi và không có tiềm năng cao đối với các mô khác). Điều đó chỉ ra rằng việc phát triển các liposome cationic dùng cho in vivo đòi hỏi phải có sự sàng lọc rất kỹ và phải có các test thực nghiệm cho từng trường hợp cụ thể. 1 .5 L ipid th ả i ch ậ m Thất bại của việc gắn phức hợp DNA-lipid với các tế bào đích rồi việc plasmid kém hoặc không hiệu lực đi vào tế bào chất là một vấn đề quan trọng làm giới hạn sự chuyển gen qua trung gian lipid in vivo. Việc cải tiến các phức hợp liposome bằng cách hợp nhất với protein virus Sendai đã được ứng dụng trong chuyển gen in vitro và in vivo trong một số trường hợp như biểu hiện insulin tái tổ hợp để điều chỉnh hạ thấp mức glucose huyết ở chuột, hay chuyển phân tử antisense oligonucleptide để ngăn chặn sự nhân lên của tân nội mạc (neointimal) hoặc chuyển gen tới võng mạc động vật hay tới các khối u não. Enzyme chuyển đổi angiotensin của người (human angiotensin converting enzyme –ACE) cũng được chuyển bằng phương pháp này vào trong động mạch cảnh chuột để ACE được biểu hiện cả trong tế bào cơ trơn giữa (medial smooth muscle) và trong các tế bào biểu mô nội mạc mạch. Những thay đổi tăng sinh mạch máu cũng quan sát thấy ở các động mạch, mô hình biểu hiện trong thành động mạch thỏ cũng đã được công bố. Cách tiếp cận tương tự cũng thấy trong chuyển gen superoxyde dismutase với tỷ lệ % rất cao các tế bào cơ tim trong mô hình ghép tim trên chuột. Đích của các lipid cationic tới các receptor 16
đặc hiệu theo con đường nội bào (endocytic) cũng đã được thông báo. Chẳng hạn như trong thử nghiệm nhằm tránh sự bất hoạt của lipid cationic trong tuần hoàn thì DNA sẽ được phức hợp với lipopolyamin hoặc các ligand khác. Mẫu hình này cũng được sử dụng đối với receptor asialoglycoprotein và cũng đã áp dụng mô hình theo cơ chế này in vitro. Lipid cationic có thể được làm ổn định khi chuyển gen in vivo bằng cách gắn với các polyamin hay polyethylen glycol phospholipid. Tương tự như vậy, các thí nghiệm gắn lipid cationic vào các virus tổng hợp nhân tạo cũng đã được dự định cho các vec tơ không phải virus. 1 .6 N âng c ấ p các plasmid Hai vấn đề chính cần đặt ra trong việc nâng cao chất lượng của sự chuyển gen là do: (1) mức độ biểu hiện còn thấp và (2) thời gian biểu hiện ngắn. Một vài chiến lược đã được thử nghiệm in vitro hướng vào các vấn đề này. Các trình tự đích của nhân liên kết đồng hóa trị với plasmid đã làm tăng đôi chút hoạt tính gen. Cũng tương tự như vậy, T7 polymerase cũng làm tăng khả năng biểu hiện gen in vitro mặc dầu thời gian tồn tại của plasmid vẫn chưa kéo dài đáng kể. Sự lựa chọn một cách khôn khéo các yếu tố điều hòa gen có thể làm tăng thật sự hiệu quả chuyển gen như với liposome cationic chẳng hạn. Để chuyển gen vào phổi in vivo người ta đã cải tiến một promoter trên cơ sở cytomegalovirus (CMV). Theo như thông báo, mức độ biểu hiện gen cao hơn 100 lần các cấu trúc thế hệ thứ nhất theo cùng một thiết kế. Vùng phía 5’ của c-erb B-2 được sử dụng để hướng dẫn đặc hiệu cho gen thymidin kinase của virus herpes simplex (HSV-tk) vào trong các khối u mới phát triển ở chuột. Các plasmid cơ sở các trình tự virus Efstein- Barr được chuyển tới gan bằng các liposome cationic có thể tồn tại vài tháng, rõ ràng là do sự định hướng của plasmid có thể tự sao chép được của episome. Các plasmid có thể tự sao chép lâu dài trong các tế bào biểu mô do có sự hợp nhất virus gây u nhú trên người (human papilloma virus –HPV) E1, E2 và vùng điều hòa trên (upstream). Các yếu tố HPV này là các chất hoạt hóa vận chuyển mạnh, nó làm tăng 10.000 lần tín hiệu gen ở các tế bào biểu mô trong môi trường nuôi cấy. 1 .7 C ác th ử n ghi ệ m ti ề n lâm sàng và lâm sàng Một vài công trình nghiên cứu trên người với việc sử dụng liposome cationic đã cho những kết quả khích lệ sau khi đưa plasmid DNA vào mũi để điều hòa độ dẫn điện vận chuyển màng tế bào bệnh xơ nang (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator – CFTR). Các thử nghiệm nhằm: (1) theo dõi sự phân phối luồng khí của phức hợp DNA- lipid khí dung và (2) tái phân phối và theo dõi luồng khí qua mũi với DNA-lipid. Cả hai công việc đó đều đã hoàn tất. Nói chung, những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các chỉ số đo được về sự vận chuyển gen cho thấy với quy trình qua mũi có ít tác dụng phụ nhất và khí dung cũng gây độc cho hệ thống. Những tiến bộ đạt được trong kỹ thuật liposome dẫn đến việc phát triển các test lâm sàng với nhiều ứng dụng khác nhau của gen trị liệu trên người. Việc chuyển và biểu hiện gen adenomatous polyposis coli (APC) thể hoang dã ở đường tiêu hóa, chuyển gen -1 antitrypsin tới gan, chuyển yếu tố IX tới gan chuột và các tổ chức khác, sự biểu hiện gen nghiên cứu trong các tế bào gốc của máu và phôi động vật nguyên vẹn cũng đã thành công trong các mô hình động vật nhờ sử dụng liposome cationic. Gen -1 antitrypsin được chuyển tới gan có thể tồn tại trên 5 tháng nếu kết 17
hợp cắt bỏ một phần gan. Các gen được chuyển qua trung gian liposome (ex vivo) vào trong các tế bào tủy xương chuột có thể có hoạt tính tới 4 tuần lễ nếu việc truyền được tái lập lại. Các lposome cationic cũng được sử dụng để ức chế sự tăng sinh của cơ trơn nội mạc mạch (chẳng hạn như vận chuyển các bẫy vị trí gắn E2F) in vivo trong các thí nghiệm gây tổn thương động mạch cảnh chuột hoặc chuyển các gen mã cho interleukin- 10 (IL-10) hoặc các domain receptor yếu tố alpha hoại tử u trên người (human tumor necrosis factor alpha -TNF receptor) để làm giảm nhẹ các nội độc tố nguy hiểm. Sự biểu hiện qua trung gian liposome của gen luciferase ở động mạch vành lợn cũng được nâng cao do hoạt hóa tăng sinh tế bào mạch máu. Trong mô hình ở động mạch chủ thỏ, DOTMA/DOPE đã được dùng để chuyển cDNA hormone tăng trưởng của người, mặc dù chỉ có một phần nhỏ các tế bào động mạch (< 1%) biểu hiện là sản phẩm gen in vitro. Đối với mô mắt bao gồm các tế bào giác mạc, tròng đen, lông mi và võng mạc cũng đã được vận chuyển in vitro và in vivo với các lipid cationic, đó cũng là một trong những cách tiếp cận mới đối với các bệnh về mắt. Những chiến lược phát triển sự chuyển gen trong lâm sàng như thế đang trên đà phát triển. Theo sau các nghiên cứu ban đầu của Canonico và cộng sự, việc chuyển gen tiền lâm sàng tới mũi động vật cũng đã thu được kết quả trong một số trường hợp. Những nghiên cứu này bao gồm cả việc thiết lập các lipid thế hệ cũ (DOTMA, DOTAP, DMRIE, DC- cholesterol) và các thuốc thử (chất phản ứng) thế hệ sau như GL-67. Việc chỉnh sửa các khiếm khuyết điện sinh học đường dẫn khí trong mô hình xơ nang ở chuột cũng áp dụng cách chuyển gen qua trung gian lipid. Chẳng hạn như việc phân phối các phức hợp DNA- lipid ở tĩnh mạch cũng sử dụng DOTMA/DOPE để biểu hiện gen in vivo ở các tế bào biểu mô trên bề mặt đường dẫn khí. Các tín hiệu biểu hiện gen trong một số trường hợp cũng được thông báo là có thể kéo dài được tới vài tháng bằng kỹ thuật này. Các lipid cationic hay các chế phẩm khác cũng có thể làm tăng thêm hoạt tính trong máu in vivo, trừ trường hợp hình thành phức hợp với DNA làm giảm hiệu lực của quá trình. Sự chuyển giao các plasmid đánh dấu phóng xạ có thể thực hiện được bằng các mô hình trên động vật với phóng xạ tự ghi trên toàn bộ cơ thể. Các liposome cationic đã được sử dụng để chuyển gen trị liệu tới một số khối u xác định hoặc được sử dụng trong vaccine kháng u có các chất phụ trợ. Với một lượng nhỏ HLA-B7 (khoảng vài microgram DNA được chuyển tới các mô bị u) đã phức hợp với DMRIE/DOPE hoặc DC-cholesterol có thể tiêm chủng an toàn cho các khối u hắc tố trong các nghiên cứu tiền lâm sàng ở người. Chiến lược này được thiết kế nhằm kháng lại các kháng nguyên gây khối u. Sự thoái lui một cách khách quan của các khối u cũng quan sát thấy ở một số bệnh nhân và hiệu lực kháng u đã đạt đựợc ở một mức nào đó. Một bệnh nhân bị u hắc tố trong phổi (intrapulmonary melanoma) có biểu hiện đáp ứng sau khi HLA-B7 cDNA phức hợp với liposome cationic được chuyển vào qua động mạch phổi phải. Cần lưu ý rằng chính các liposome cationic cũng có hiệu lực kháng u trong một số mô hình in vivo. Trên cơ sở các phát hiện trước của Nabel và cộng sự, nhiều thử nghiệm tiền lâm sàng vaccine đối với khối u hoặc các nghiên cứu tạo ra các mô hình nhằm nâng cao đáp ứng kháng khối u khi sử dụng lipid cationic phức hợp với DNA plasmid cũng đã khởi đầu. Một plasmid liên hợp các trình tự từ adeno-asociated virus (AAV) mã cho IL-2 cDNA của chuột đã được tiêm vào các tế bào khối u tuyến tiền liệt của người. Liposome cũng đã được sử dụng để chuyển giao hiệu quả HVS-tk hoặc p53 tới các khối u mới hình thành ở chuột. Mặc dù có sự thoái lui của khối u, nhưng cơ chế của hiệu ứng kháng khối u thì vẫn còn phải nghiên cứu tiếp tục. 18
1 .8 V ấ n đ ề đ i ề u hòa p h ứ c h ợ p DNA - lipid Mỗi công thức của phức hợp DNA-lipid đều đòi hỏi một tỷ lệ lipid:DNA xác định và các chế phẩm lipid tối ưu thường gồm cả lipid trung tính và lipid cationic. Các thử nghiệm tiền lâm sàng có thể được dùng trong việc xác định xem thuốc thử nào là tốt nhất cho một mục tiêu đặc biệt nào đó. Các nghiên cứu thuộc nhiều dạng ở pha I (pha I type) nhằm chứng minh cho các khái niệm khoa học cũng đã được đặt ra hoặc đang trên đà tiến triển. Một vài nghiên cứu còn đề cập tới cả sự tăng tiến của liều lượng. Một mô hình nghiên cứu lâm sàng với một công thức đã cho sẽ phải ước lượng được mức tăng của liều lượng. Phải tập hợp đầy đủ các số liệu thử nghiệm về hiệu lực, độ an toàn tiền lâm sàng để phục vụ cho các công việc sau này. Mặt khác, nếu một nghiên cứu lâm sàng theo mô hình nhằm thay đổi thành phần của một công thức đặc hiệu (chẳng hạn như thay đổi tỷ lệ lipid:DNA) thì mỗi sự thay đổi đều phải được nhìn nhận từ các thử nghiệm tiền lâm sàng về độ an toàn và hiệu lực của nó. Vì thế, trước hết phải sớm xác định một công thức tối ưu với các thành phần cố định trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và sau đó đánh giá thật cẩn thận độ an toàn và hiệu ứng sinh học của của công thức đặc hiệu này. Những tiếp cận như thế sẽ làm đơn giản hóa cho các nghiên cứu trên lâm sàng. 19
C h ươ ng II CÔ Đ Ặ C D NA VÀ S Ự V Ậ N CHUY Ể N GEN QUA TRUNG GIAN RECEP TOR 2.1 M ở đ ầ u Việc phát triển các chiến lược để đưa các yếu tố ngoại sinh, các gen chức năng đến các tế bào soma có lẽ là rất quan trọng cho việc điều trị bệnh, với điều kiện là các phương pháp này phải an toàn, hiệu quả và phải được chọn lọc. Những tiến bộ đạt được trong lĩnh vực này rất ấn tượng. Hiện nay có một số hệ thống chuyển gen đã được kiểm tra (làm test) trên các thử nghiêm lâm sàng. Các virus tái tổ hợp khiếm khuyết sao chép đã được sử dụng làm trung gian vận chuyển gen cho nhiều loại tế bào trong các thử nghiệm in vitro và in vivo. Mặc dầu các virus tái tổ hợp có sự lôi cuốn rất lớn, nhưng các vector này vẫn có những giới hạn đáng kể khi áp dụng vào thực tế. Ví dụ, các retrovirus tái tổ hợp có thể đưa được các gen vào trong tế bào nuôi cấy, nhưng các vector này lại không chuyển được gen vào trong các tế bào không sao chép (nhân lên) và nhìn chung thiếu hiệu quả trong việc chuyển gen in vivo. Tính hướng của các virus tái tổ hợp có thể làm hạn chế tác dụng của chúng, và khả năng đóng gói của nhiều virus đã làm giới hạn kích cỡ các trình tự ngoại lai có thể được cài vào trong các vec tơ này. Một vài vector virus có thể gây độc tế bào hay kích thích các phản ứng dị ứng, làm giảm hiệu quả sự chuyển gen và biểu hiện gen chuyển nếu sử dụng lặp lại các virus tái tổ hợp. Cũng có vấn đề liên quan là một vec tơ virus bất hoạt có thể trở nên hoạt hóa sau khi thâm nhiễm các virus hoang dã hoặc virus trợ giúp và có thể tạo nên một virus tái tổ hợp có khả năng sao chép cao. Vì còn nhiều điều cần cân nhắc nên việc phát triển các phương pháp chuyển gen không virus vẫn cần được quan tâm nhiều. Các gen chức năng có thể được đưa tới các tế bào nhân chuẩn in vitro bằng nhiều phương pháp vật lý, không gây thâm nhiễm. Tế bào của động vật có vú có thể được thâm chuyển bằng cộng tủa calcium phosphate, liposome, DEAE-dextran, vi tiêm, thả bom các hạt gene và electroporation. Một số kỹ thuật đã được mở rộng để chuyển DNA vào các tế bào động vật thực nghiệm in vivo. Ví dụ, cộng tủa calcium phosphate (co-precipitation) được dùng để chuyển DNA vào trong các tế bào nuôi cấy bằng tiêu hóa nội bào (endocytosis) đặc hiệu và kỹ thuật này đã trở thành cách tiếp cận chuẩn cho sự chuyển gen in vitro. Các nhà nghiên cứu đã tiêm plasmid tủa calcium phosphate vào khoang màng bụng của chuột, kết quả là biểu hiện được gen chuyển ở gan với mức thấp. Mặc dầu những phương pháp thâm chuyển như thế có thể chuyển được DNA vào tế bào, nhưng it hiều quả hơn so với các vector virus và những kết quả thu được có thể thay đổi rất lớn. Thêm vào đó, những quy trình này chỉ cho kết quả biểu hiện ngắn hạn và thường là không đặc hiệu, hầu hết các kỹ thuật này là không thực tế đối với việc chuyển gen vào các động vật. Tuy nhiên, một vài hệ thống không virus thể hiện như những phương thức tiếp cận tiềm năng đưa các gen chức năng vào đông vật. Quả thực là những phương pháp chuyển gen không virus tiềm năng này có thể được sử dụng trong gen trị liệu trên người nếu những kỹ thuật này thật sự đáng tin cậy và có hiệu quả trong chuyển gen in vivo. Trong phạm vi chương này, chúng ta sẽ bàn đến sự phát triển và những tiến bộ đạt được trong sự 20