Thực hành Vi sinh ứng dụng

Chia sẻ: Lan Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

227
lượt xem 63
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vi khuẩn sinh sản bởi một quá trình gọi là nhân đôi - tế bào mới sinh ra bằng cách chia đôi từ tế bào mẹ. Một số có thể sinh sản rất nhanh ở những điều kiện thích hợp. Nếu có thực phẩm, độ ẩm thích hợp ở đúng nhiệt vi sinh có thể bắt đầu sinh sản trong vòng chưa đến hai mươi phút, chỉ trong tám giờ một tế bào ban đầu có thể nhân lên thành 17 triệu vi khuẩn mới.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thực hành Vi sinh ứng dụng

TRƯ NG I H C K THU T CÔNG NGH TP. HCM KHOA MÔI TRƯ NG & CÔNG NGH SINH H C ------ BÀI GI NG TH C HÀNH VI NG NG VI SINH NG D NG TS. Nguy n Hòai Hương Dùng cho sinh viên ngành Công ngh Sinh h c Năm xu t b n: 2009
Trang M CL C Gi i thi u môn h c 4 Bài 1 Vi khu n amôn hóa 5 I Lý thuy t 5 II Th c hành 5 1. Môi trư ng - hóa ch t 5 2. Ti n hành thí nghi m 6 3. Quan sát và ghi nh n k t qu 7 III Bài n p 8 Bài 2 Vi khu n nitrate hóa 9 I Lý thuy t 9 II Th c hành 9 1. Môi trư ng - hóa ch t 10 2. Ti n hành thí nghi m 10 3. Quan sát và ghi nh n k t qu 10 III Bài n p 11 Bài 3 Vi khu n ph n nitrate hóa 12 I Lý thuy t 12 II Th c hành 12 1. Môi trư ng - hóa ch t 12 2. Ti n hành thí nghi m 13 3. Quan sát và ghi nh n k t qu 13 III Bài n p 14 Bài 4 Vi khu n c nh nitơ 15 I Lý thuy t 15 II Th c hành 16 1. Môi trư ng - hóa ch t 16 2. Ti n hành thí nghi m 17 3. Quan sát và ghi nh n k t qu 17 III Bài n p 18 Bài 5 Vi khu n phân h y cellulose 19 2
I Lý thuy t 19 II Th c hành 20 1. Môi trư ng - hóa ch t 20 2. Ti n hành thí nghi m 20 3. Quan sát và ghi nh n k t qu 20 III Bài n p 21 Tài li u tham kh o 22 Ph l c 23 3
GI I THI U MÔN H C Môn th c hành vi sinh ng d ng nh m giúp sinh viên làm quen v i các phương pháp phân l p, kh o sát các vi sinh v t ư c ng d ng trong x lý môi trư ng, công ngh lên men. Các vi sinh ng d ng thư ng ư c phân l p t môi trư ng t nhiên, chúng có kh năng s d ng các cơ ch t khác nhau, chuy n hóa v t ch t trong t nhiên. Ngu n phân l p chúng có th t t, nư c, ng v t, th c v t hay th c phNm. Phân l p, xác nh ch c năng, nh danh chúng là bư c u ưa chúng vào ng d ng. Trong khuôn kh bài th c hành môn vi sinh ng d ng sinh viên phân l p vi sinh v t ch y u t môi trư ng t. t là m t trong nh ng cơ ch t thu n l i nh t i v i s phát tri n c a các lo i vi sinh v t khác nhau. S lư ng vi sinh trong 1 g t có t i hàng trăm tri u, th m chí hàng t t bào. Ho t ng s ng c a vi sinh v t t có liên quan n nhi u quá trình x y ra trong t, trư c h t là các vòng tu n hoàn c a v t ch t trong t nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu huỳnh. Các bư c chung c a bài th c hành là 1. Phát hi n các nhóm vi sinh v t trong m u t bao g m i di n c a m t s nhóm phân lo i 2. Nghiên c u m t s c i m sinh trư ng và hình thái t bào h c t bào c a các i di n thu c vi sinh v t phân l p ư c. N I DUNG TH C HÀNH BÀI 1: VI KHU N AMÔN HÓA BÀI 2: VI KHU N NITRATE HÓA BÀI 3: VI KHU N PH N NITRATE HÓA BÀI 4: VI KHU N C NNH NITƠ BÀI 5: VI SINH V T PHÂN GI I CELLULOSE 4
BÀI 1: VI KHU N AMÔN HÓA I. Lý thuy t Quá trình amôn hóa là quá trình phân gi i protein và các h p ch t h u cơ khác có ch a nitơ t o thành amoniac. Các vi sinh v t có kh năng amôn hóa bao g m nhi u loài sinh bào t ho c không sinh bào t , có kh năng s d ng nhi u ngu n v t ch t khác nhau. Ngoài ra còn nhi u lo i x khuN n và n m khuN n ty. Tuy v y, nh ng vi sinh v t ch s d ng riêng m t lo i protein thì không nhi u. Các vi sinh v t này có kh năng ti t men phân gi i protein vào môi trư ng, th y phân thành các amino acid. Khi ó, chúng s d ng các amino acid này trong quá trình d hóa và ng hóa. Các s n phN m c trưng c a quá trình phân gi i protein là NH3 và H2S. Quá trình phân gi i protein có th x y ra trong các i u ki n hi u khí và k khí. Trong i u ki n hi u khí, các h p ch t h u cơ có ch a nitơ ư c phân gi i b i các loài trong gi ng Bacillus và Pseudomonas, các i di n trong h Enterobacteriaceae, các x khuN n và n m khuN n ty. Trong ó, vai trò quan tr ng và ch y u nh t là gi ng Bacillus. Trong i u ki n k khí thì các loài trong gi ng Clostridium tham gia quá trình chuy n hóa này. Còn trong i u ki n thông khí h n ch , quá trình amôn hóa ư c th c hi n b i các loài vi khuN n và tr c khuN n k khí tùy nghi. II. Th c hành Vi c phát hi n và xác nh s lư ng các vi sinh v t amôn hóa ư c th c hi n b ng cách c y các m u phân tích vào môi trư ng l ng và r n canh th t-peptone. Vi c c y lên môi trư ng th ch ư c ti n hành b ng d ch huy n phù ã thanh trùng Pasteur nh m tiêu di t các t bào sinh dư ng và ch còn gi l i bào t c a các i di n thu c gi ng Bacillus – gi ng c trưng nh t cho quá trình amôn hóa. Ngoài ra, vi c c y lên môi trư ng th ch cho phép nh n nh ư c các c tính khác nhau c a khuN n l c các vi khuN n khác nhau này. 1. Môi trư ng - hóa ch t - Môi trư ng canh th t- peptone: Cao th t 5g Peptone 10g Nư c 1000ml 5
- Môi trư ng th ch: Tr n vào môi trư ng l ng 2% th ch. - Dung d ch pha loãng m u: dung d ch nư c mu i sinh lý ti t trùng. Gi y l c lo i th m acetate chì - Gi y quỳ - Các lo i thu c nhu m quan sát vi sinh v t: thu c nhu m Gram và thu c nhu m bào t - Thu c th Nessler: Hòa tan 50 g KI trong 35 ml nư c c t không m. Thêm dung d ch HgCl2 bão hòa cho n khi xu t hi n k t t a. Thêm 400 ml KOH 50% pha lõang n 1 l, l ng, s d ng d ch trong. 2. Ti n hành thí nghi m Chu n b môi trư ng: - Môi trư ng canh th t-peptone ư c phân vào kho ng 1/3 chi u cao ng nghi m, kh trùng 1 atm, 15 phút. - Các d i gi y quỳ và gi y l c th m acetat chì ư c cho vào ĩa petri, h p kh trùng 0,5 atm. - Môi trư ng th ch canh th t-peptone: sau khi h p kh trùng ư c phân vào các 30OC ĩa petri, gi Chu n b m u: -Mu t ư c pha v i nư c thu d ch huy n phù vi sinh v t trên môi trư ng l ng: 102, 103, 104, 105, 106 - C y t các d ch pha loãng n ng - L y 1ml d ch pha loãng c y vào ng nghi m có ch a môi trư ng canh th t- peptone ã kh trùng trên - Dùng k p l y các d i gi y quỳ và gi y l c th m acetate chì gài vào gi a nút bông và ng nghi m 30OC trong 3 ngày êm. - nhi t - Mu i ch ng là môi trư ng không c y d ch huy n phù. vi sinh v t trên môi trư ng th ch: 102, 103, 104, 105, 106 - C y t các d ch pha loãng n ng - L y 0,1 ml d ch pha loãng cho vào các ĩa petri có ch a môi trư ng ã kh trùng trên - Dùng que trang tr i u lên b m t th ch 6
30oC trong 3 ngày êm. - nhi t - Mu i ch ng là môi trư ng không c y d ch huy n phù. 3. Quan sát và ghi nh n k t qu Môi trư ng l ng: Quan sát: - S c môi trư ng - S t o bông, k t c n - N i váng trên b m t. Ph n ng sinh hóa: - Th v i thúôc th Nessler: nh m t gi t thu c th Nessler lên ĩa s tr ng, thêm m t que c y y t vư n trong peptone broth. Quan sát màu k t t a: Màu vàng nh t – ít ammoniac Vàng s m – nhi u ammoniac Nâu – r t nhi u ammoniac - Dùng gi y quỳ th s sinh NH3 (làm gi y quỳ hóa xanh). - Quan sát màu gi y l c th m acetate chì: s sinh H2S làm gi y l c th m acetate chì hóa en. - So sánh i ch ng và thí nghi m và ghi k t qu vào b ng sau: pha c môi T o bông T oc n Sinh NH3 Sinh H2S loãng trư ng - Ch n m t pha loãng có t l vi sinh v t cao nh t làm tiêu b n và soi kính hi n vi. Môi trư ng th ch: Ghi nh n: - S lư ng khuNn l c trên 1 ĩa mi pha loãng - Quan sát hình thái khuNn l c, mô t , ghi nh n vào b ng sau: pha loãng S khu n l c Hình thái Xu t hi n bào t khu n l c 7
- Làm tiêu b n và soi kính hi n vi - So sánh hình thái quan sát ư c gi a tiêu b n t môi trư ng l ng và môi trư ng th ch - Ch p hình khuNn l c, t bào. III. Bài n p - N p k t qu ghi chép trong thí nghi m và hình ch p khuNn l c, t bào. - Nêu ng d ng vi khuNn amôn hóa. 8
BÀI 2: VI KHU N NITRATE HÓA I. Lý thuy t Nitrate hóa là quá trình oxi hóa NH3 thành HNO3, cung c p năng lư ng cho vi sinh v t ho t ng. Quá trình oxi hóa này x y ra cùng v i quá trình ng hóa CO2. H u h t các vi sinh v t t dư ng hóa năng vô cơ thu c lo i hi u khí b t bu c u có kh năng th c hi n quá trình này. Nitrate hóa qua 2 giai o n: u tiên là giai o n oxi hóa NH3 thành nitrite b i m t s i di n thu c nhóm vi khuNn nitrite hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, ...T t c chúng u gi ng nhau v m t sinh lý, sinh hóa, ch khác nhau v m t hình thái h c và c u trúc t bào. Các i di n c a gi ng Nitrosomonas không sinh n i bào t , t bào nh bé hình b u d c. Trên môi trư ng l ng, Nitrosomonas tr i qua m t s pha, phát tri n tùy thu c m ts i u ki n. Hai pha ch y u là pha di ng- t bào có 1 hay chùm tiên mao và pha t p oàn khuNn keo-các t bào không di ng. Giai o n 2 c a quá trình nitrate hóa oxi hóa nitrite thành nitrate b i m t s vi khuNn: Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis. T bào c trưng c a Nitrobacter trong d ch nuôi thư ng có d ng hình que tròn, hình h t u, ho c hình tr ng, có th di ng ho c không di ng. Khi i u ki n không thu n l i chúng có th hình thành nh ng t p oàn khuNn keo. Nitrospina gracilis là nh ng tr c khuNn th ng, m nh d , th nh tho ng có d ng hình c u, không di ng, và có c trưng là hình thành nh ng t p oàn khuNn keo. Nitrococcus mobilis thì có d ng hình tròn, có tiên mao. Vi khuNn nitrate hóa không s d ng các ch t h u cơ và chuy n hóa m t cách ch t ch i v i vi c oxi hóa cơ ch t-NH3 và nitrite. II. Th c hành Vi c phát hi n vi khuNn nitrate hóa ư c th c hi n b ng cách c y d ch huy n phù c n phân tích lên môi trư ng ch n l c vô cơ Winogradski. Ngu n C duy nh t trong môi trư ng này là CO2 có trong không khí và trong thành ph n c a CaCO3. Nguyên li u năng lư ng và ngu n N cho các vi khuNn gây ra giai o n u c a quá trình nitrate hóa là NH3 và mu i amôn, còn i v i vi khuNn gây ra giai o n hai là nitrite. 9
i u ki n c n thi t i v i s phát tri n c a vi khuNn nitrate hóa là vi c thông khí y vào môi trư ng nuôi c y. 1. Môi trư ng - hóa ch t - Môi trư ng Winogradski phân l p Nitrosomonas spp. (NH4)2SO4 2 g/l K2HPO4 1 g/l MgSO4.7 H2O 0,5 g/l FeSO4 . 7H2O 0,4 g/l NaCl 2 g/l Chia vào các bình th y tinh 50ml, cho vào m i bình m t ít CaCO3. H p kh trùng 1 atm - Môi trư ng phân l p Nitrobacter spp. NaNO2 1,0 g MgSO4. 7H2O 0,5 g FeSO4. 7H2O 0,03 g NaCl 0,3 g Na2CO3 1,0 g K2HPO4 1,0 Nư c 1L Ch nh pH v 7,3. - Dung d ch pha loãng m u - Tinh th diphenylamin - H2SO4 m c 2. Ti n hành thí nghi m - ChuNn b môi trư ng: Môi trư ng ã h p kh trùng ư c phân vào các ng nghi m - Xác nh vi sinh v t trên môi trư ng l ng: Pha loãng m u 102 - 105 Mi pha loãng l y 1ml m u c y vào ng nghi m có ch a môi trư ng kh trùng trên 30OC trong 2-3 tu n - Làm 1 ng nghi m i ch ng 3. Quan sát và ghi nh n k t qu : 10
- mi pha loãng, ghi nh n s thay i môi trư ng trong ng nghi m - Nh ng ng nghi m nào ghi nh n có vi khuNn phát tri n, c n ti n hành th nghi m nh tính. nh tính nitrate: L y vài tinh th diphenylamin hòa tan trong 1 gi t Ph n n g H2SO4 m c. Sau ó thêm 1 gi t d ch c n ki m tra. Ti n hành trên b n s tr ng s th y xu t hi n màu xanh thNm. Ghi nh n k t qu vào b ng: ng nghi m pha loãng s 102 103 104 105 106 NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3- Ch n ng nghi m có k t qu dương tính làm tiêu b n quan sát dư i kính hi n vi. C n lưu ý ch n ư c c nh ng h t CaCO3, vì xung quanh h t này, t l vi khuNn là cao nh t. Miêu t , so sánh hình thái các t bào vi khuNn quan sát ư c. III. Bài n p - N p k t qu ghi chép trong thí nghi m và hình ch p khuNn l c, t bào. - Nêu ng d ng vi khuNn nitrate hóa. 11
BÀI 3. VI KHU N PH N NITRATE HÓA I. Lý thuy t Ph n nitrate hóa là quá trình vi sinh v t th c hi n vi c kh nitrate thành nitơ phân t, ng th i oxi hóa các ch t h u cơ như ư ng, rư u, axit h u cơ thành CO2 và H2O v i ch t nh n i n t cu i cùng là NO3-. Năng lư ng sinh ra khi oxi hóa cơ ch t ư c vi sinh v t s d ng trong quá trình ho t ng s ng c a mình. Quá trình ph n nitrate hóa có th x y ra trong i u ki n hi u khí l n k khí, nhưng c bi t m nh trong i u ki n k khí. Các vi sinh v t th c hi n quá trình này phân b r t r ng rãi trong t nhiên. Ph n l n chúng thu c lo i d dư ng hóa năng h u cơ, k khí tùy nghi g m m t s gi ng Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus … II. Th c hành Vi c phát hi n vi khuNn ph n nitrate hóa ư c th c hi n b ng phương pháp c y m u lên môi trư ng ch a h p ch t C d ng oxi hóa, có nitrate và các h p ch t khác c n cho quá trình sinh t ng h p c a t bào. Các vi khuNn này s d ng nitrate làm ch t nh n electron nhưng không dùng làm ngu n N trong quá trình ng óa, vì không th kh NO3- thành NH4+. Vì v y, trong môi trư ng nuôi c y vi khuNn ph n nitrate hóa, ngư i ta cho thêm peptone, asparagine ho c mu i amôn và h n ch lưu khí trong quá trình nuôi c y. 1. Môi trư ng- hóa ch t - Môi trư ng Giltay: Dung d ch A: Asparagine (C4HgN2O3. H2O) 1g KNO3 1g Nư c máy: 0,25 l Dung d ch B: Citric acid ho c 5g Citrate kali 8,5 g KH2PO4 1g MgSO4.7H2O 1g 12
CaCl2.6H2O: 0,2g FeCl2. 4H2O vt Nư c máy: 0,25l N u s d ng acid citric c n b sung KOH 10% v i phenolphthalein làm ch t ch th . Hòa 0,25l dung d ch A và 0,25l dung d ch B, sau ó thêm nư c máy n 1L dung d ch môi trư ng Giltay hoàn t t. 2. Ti n hành thí nghi m - ChuNn b môi trư ng: môi trư ng Giltay v i thành ph n như trên ư c phân vào 6 ng nghi m, h p kh trùng 0,5 atm. - Pha loãng m u 103- 107 - L y 1ml m u c y sâu vào áy ng nghi m có ch a môi trư ng ã kh trùng trên. ng i ch ng không c y m u. 30OC trong 7 ngày êm. - 3. Quan sát và ghi nh n k t qu D u hi u ch y u nh t cho s phát tri n c a vi khuNn nitrate hóa là s sinh khí, làm c và gi m pH c a môi trư ng. - Quan sát các ng nghi m các pha loãng khác nhau và ghi nh n vào b ng. - Ki m tra vi c kh nitrate trong môi trư ng b ng ph n ng sinh hóa v i diphenylamine môi NO3- pha loãng c môi Sinh khí pH trư ng trư ng 3 10 104 105 106 107 - Ch n 1 ng nghi m cho k t qu t t nh t làm tiêu b n, quan sát kính hi n vi và ghi nh n hình thái h c c a các vi khuNn ph n nitrate hóa phân l p ư c. - Ki m tra vi c kh nitrate trong môi trư ng b ng ph n ng sinh hóa v i diphenylamine: L y vài tinh th diphenylamine hòa tan vào m t gi t H2SO4 c, sau ó thêm vào m t gi t d ch nghiên c u. N u có m t nitrate s xu t hi n màu xanh th m. 13
III. Bài n p - N p k t qu ghi chép trong thí nghi m và hình ch p khuNn l c, t bào. - Nêu ng d ng vi khuNn ph n nitrate hóa. 14
BÀI 4. VI SINH V T C NNH NITƠ I. Lý thuy t C nh N là kh năng ng hóa N phân t c a m t s vi sinh v t và dùng làm ngu n ki n t o t bào. Các vi sinh v t c nh N s ng t do, có nhi u trong t, hay s ng c ng sinh trong n t s n cây h u, hai h quan tr ng nh t là Azotobacteraceae và Rhizobiaceae. Trong bài thí nghi m này chúng ta s phân l p các vi khuNn c nh m t do thu c h Azotobacteraceae. Trong h Azotobacteraceae có hai gi ng vi khuNn c nh m t do trong i u ki n hi u khí là Azotobacter và Azomonas. T t c các loài thu c gi ng Azotobacter và u s ng d dư ng, dùng nhi u ngu n carbon khác nhau, monosacharide, Azomonas disacharide, polysacharide (dextrin, tinh b t), nhi u rư u và acid h u cơ, các h p ch t có vòng thơm…Ngu n nitơ có th là nitơ phân t , cũng có th là mu i amôn, nitrate, nitrite, amino acid. Tùy thu c n ng các h p ch t có nitơ này trong môi trư ng mà quá trình c nh nitơ phân t s b c ch nhi u hay ít. ng th i chúng có nhu c u ln i v i P và Ca, cũng như c nh nitơ m nh m chúng c n Mo và B. Ph n l n các loài Azotobacter ch phát tri n ư c pH l n hơn 6, vì v y h u như không g p chúng t chua. Azotobacter c n Nm cao hơn so v i nhi u vi khuNn khác nên cũng ít g p chúng các vùng t khô h n. Gi ng Azotobacter theo Khóa phân l oi Bergey g m 6 lòai chính: A. chroococcum, A. vilelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. armenicanus và A. paspali; trong khi ó gi ng Azomonas g m 3 lòai chính: A. agilis, A. insignis và A. macrocytpgenes. Có th phân bi t các lòai này qua kh năng sinh kén, kh năng di ng, kh năng t ng h p s c t , kh năng phát hùynh quang (B ng 1). B ng 1. Phân bi t các lòai thu c gi ng Azotobacter và Azomonas d a vào c i m hình thái S c t tan trong nư c Nâu Nâu Lc Vàng Lam- Di Gi ng Lòai Kén en en – tím – l c tr ng ng tím hùynh hùynh quang quang + + - - - - - - A. A z 15
chroococcum + + - - +/- +/- + - A. vilelandii + - - - - - - - A. beijerinckii + - +/- + +/- - - - A. nigricans + + - + + - - - A. armenicanus + + - - + - + - A. paspali - + - - - - + + A. agilis - + +/- - +/- - +/- - A. insignis - + - - - - +/- +/- A. Azomonas macrocytpgene s Qua b ng 1 ta nh n th y t t c các Azotobacter u sinh kén, ngư c l i v i các Azomonas. C ba lòai thu c gi ng Azomonas u có hình thái khuNn l c và t bào r t gi ng A. chroococcum. H u h t chúng t ng h p s c t phát hùynh quang (phát hi n khi chi u tia c c tím λ = 364 nm trong bu ng t i). II. Th c hành Vi c phát hi n Azotobacter và Azomonas ư c th c hi n trên môi trư ng ch n l c Thompson-Skerman không ch a nitơ h p ch t, trong i u ki n hi u khí và Nm cao. 1. Môi trư ng- hóa ch t - Môi trư ng Thompson-Skerman (N2-free glucose) tăng sinh K2HPO4: 1g MgSO4: 0,2g FeSO4: 0,2g CaCl2: 0,1g Na2MoO4: 0,001g Glucose: 10g Nư c máy: 1000ml - Môi trư ng Thompson-Skerman (N2-free glucose) phân l p K2HPO4: 1g MgSO4: 0,2g 16
CaCl2: 0,1g Na2MoO4: 0,001g Glucose: 10g Nư c máy: 1000ml Agar: 3% th tích môi trư ng - ChuNn b môi trư ng Thompson-Skerman v i thành ph n như trên, h p kh 121oC trong 15 phút 1 atm. trùng - Bu ng t i có èn c c tím. 2. Ti n hành thí nghi m - Giai o n tăng sinh: Cân 1g t cho vào erlen có 50 ml môi trư ng Thompson- 4-7 ngày 30OC. Skerman tăng sinh ã h p kh trùng v i thành ph n như trên. an sau tăng sinh: ki m tra xem có vi khuNn mong múôn không: soi kính - Giai X 100 hay soi d u quan sát tìm t bào hình oval hay que ng riêng l hay c p ôi. - Giai o n phân l p: C y truy n t môi trư ng tăng sinh vào môi trư ng Thompson-Skerman phân l p ã phân vào ĩa petri và h p kh trùng. 3-5 ngày, 30oC. 3. Quan sát và ghi nh n k t qu - Quan sát và ghi nh n hình thái vi khuNn c trưng sau giai o n tăng sinh. Hình d ng t Kích S s p x p Hình v t Bào t bào thư c t bào bào L ai 1 L ai 2 … - Ghi nh n các lo i khuNn l c khác nhau xu t hi n sau giai o n phân l p. Mô t các khuNn l c ó: Khu ch S lư ng Khu n Hình Màu Huỳnh tán màu B mt khu n l c lc d ng trong sc quang vào môi lo i này trư ng 17
- Ch n các khuNn l c c trưng nh t làm tiêu b n gi t ép quan sát bao nh y. Soi kính hi n vi v t kính 40X ki m tra hình thái vi khuNn: kích thư c l n, thư ng ng thành ôi và có bao nh y. - Ghi nh n các c i m này vào b ng: Hình d ng t Kích S s p x p Hình v t Bào t bào thư c t bào bào L ai 1 L ai 2 … III. Bài n p - N p k t qu ghi chép trong thí nghi m và hình ch p khuNn l c, t bào. - Nêu ng d ng vi khuNn c nh nitơ. 18
BÀI 5:VI SINH V T PHÂN GI I CELLULOSE I. Lý thuy t Cellulose là thành ph n c u t o cơ b n c a thành t bào th c v t. Vi c t ng h p cellulose có quy mô ph c t p hơn h n vi c t ng h p nh ng h p ch t khác. Do ó, vi sinh v t phân gi i cellulose có vai trò c bi t quan tr ng trong chu trình tu n hoàn Carbon. S phân gi i ti n hành trong i u ki n hi u khí l n k khí, môi trư ng ki m ho c acid, Nm th p ho c cao và các nhi t khác nhau. T t c vi sinh v t tham gia vô cơ hóa cellulose u thu c lo i d dư ng hóa năng h u cơ, có enzyme cellulase xúc tác vi c phân gi i cellulose thành cellobiose và glucose. Vi sinh v t dùng các h p ch t sinh ra này làm ngu n carbon và ngu n năng lư ng. Trong i u ki n hi u khí, các vi sinh v t tham gia vào quá trình này g m niêm khuNn, m t s i di n c a các vi khuNn không sinh bào t và sinh bào t , x khuNn, n m...Trong ó, quan tr ng nh t là niêm khuNn (Myxobacteria). Niêm khuNn có t bào hình que nh bé (03-0,4 x 0,7-10µm) hơi u n cong, thư ng có u nh n, thành t bào m ng và nhu m màu kém hơn so v i các vi khuNn khác. Trên cơ ch t c niêm khuNn có chuy n ng trư t, do s ti t ch t nh y không ng u trên b m t t bào. Vài loài niêm khuNn có tiên mao, có chu kỳ phát tri n ph c t p. u tiên, các t bào hình que t t d y lên, bi n thành nh ng t bào d ng ngh , hình c u ho c b u d c, kích thư c khác nhau. Niêm khuNn phân gi i cellulose ch y u g m các gi ng Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium s ng trong t ít acid, trung tính và ít ki m. Các loài thu c gi ng Cytophaga có t bào u nh n, không sinh vi kén. Các loài trong gi ng Sporocytophaga có hình thái tương t như Cytophaga nhưng khác ch có kh năng sinh vi kén. Các loài thu c gi ng Sorangium là nh ng tr c khuNn u nh n, có kh năng hình thành kén. Trên b m t v t li u có cellulose, niêm khuNn phát tri n trong d ng th nh y, không có hình d ng xác nh, lan r ng, không màu ho c có màu vàng, da cam, tương ng v i ch cellulose b phân gi i nhi u hay ít. Ngoài niêm khuNn, trong t còn có các loài phân gi i cellulose thu c gi ng Cellvibrio, t bào u ng cong, di ng nh 1 tiên mao, không sinh n i bào t , khuNn 19
l c không màu ho c có màu vàng l c. Chúng ch dùng cellulose khi c n ki t các ngu n cacbon khác và kh năng phân gi i không m nh m b ng niêm khuNn. Trong t chua, vai trò phân gi i do các n m thu c gi ng Chaelomium, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus... II. Th c hành H u h t t t c nh ng loài phân gi i cellulose thu c nhóm hi u khí và ưa Nm. Vi c phát hi n và xác nh sô lư ng các vi sinh v t phân gi i cellulose trong i u ki n hi u khí ư c ti n hành b ng cách c y d ch huy n phù nghiên c u lên các ĩa ch a môi trư ng ch n l c Hutchinson có ngu n carbon duy nh t là cellulose. Nuôi c y trong i u ki n hi u khí. 1. Môi trư ng và hóa ch t - Môi trư ng Hutchinson (g) KNO3 2,5 K2HPO4 1,0 MgSO4 0,3 CaCl2 0,1 NaCl 0,1 FeCl3 0,01 Agar 3% Nư c máy 1000ml 2. Ti n hành thí nghi m - ChuNn b các ĩa petri có môi trư ng Hutchinson v i thành ph n như trên, h p kh trùng 1 atm. - Gi y l c c t thành nh ng khoanh tròn kích thư c tương ng ĩa petri. H p kh trùng 1 atm. -M u t pha v i nư c máy l y d ch huy n phù pha loãng 102 n 106, trang - C y 0,1 ml d ch huy n phù t u lên b m t b ng que c y trang. - Dùng k p s t ã kh trùng trên ng n l a g p 1 khoanh gi y l c vô trùng t áp sát lên b m t. M i pha loãng l p l i 3 l n, y n p ĩa petri. - Nuôi c y 30OC trong 12-14 ngày êm. 3. Quan sát và ghi nh n k t qu 20