Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm coliforms và E.coli

Chia sẻ: Ngô Thị Thảo Ngân | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

247
lượt xem 42
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tài liệu Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm coliforms và E.coli sau đây có nội dung trình bày tổng quan về coliforms và E.coli, các phương pháp định tính, định lượng, các tiêu chuẩn hiện hành trong kiểm nghiệm coliforms và E.coli. Tham khảo nội dung tài liệu để nắm bắt nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm coliforms và E.coli

TIÊU CHUẨN HIỆN HÀNH ĐỂ KIỂM NGHIỆM COLIFORMS VÀ E.COLI I. TỔNG QUAN VỀ COLIFORMS VÀ E.COLI 1. Coliforms Coliformsđược xem là những visinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh, bởi vì số lượng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lượng Coliform trong thực phẩm càng cao thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất lớn. Tuy vậy mối liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh còn đang được tranh cãi về cơ sở khoa học, cho đến nay mối liên hệ này vẫn không được sự thống nhất trong các hội đồng khoa học. Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, hình que, là nhóm những trực khuẩn đường ruột gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 370C trong vòng 24 giờ, không sinh bào tử, chứa βgalactosidase. Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm.Có những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến 2 oC và cao đến 500C.Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 50C tuy cũng có tài liệu ghi nhận sự phát triển của chúng ở 3 – 6 0C.
Ngưỡng pH để Coliforms có thể phát triển là 4,4 – 9 E.coli có thể phát triển trên môi trường tối thiểu chỉ chứa một nguồn carbon hữu cơ duy nhất (chẳng hạn glucose) và một nguồn nitơ duy nhất như (NH4)2SO4 cùng vài loại khoáng khác. Chúng phát triển tốt trên môi trường thạch thường, cho những khuẩn lạc thấy được sau 12 – 16 giờ ở 370C, phát triển tốt ở rất nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp. Nhóm Coliforms gồm 4 giống đó là Escherichia với một loài duy nhất là E .coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte (gồm 2 loài E. aerobacter và E. cloacae). Các giống có nguồn gốc từ phân (như Escherichia) phát triển nhanh, khoảng 16 giờ, trong 8 môi trường dinh dưỡng ở 440C, không mọc ở 40C trong 30 ngày. Là loại vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp nhất là 410C. Các giống không có nguồn gốc từ phân (như Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte), chúng có nguồn gốc thuỷ sinh hay từ đất, mọc nhanh ở 4oC trong 3 – 4 ngày và 10oC trong 1 ngày. Không mọc ở 41oC, ở 44oC ức chế hoàn toàn sự phát triển của tất cả các Coliforms không có nguồn gốc từ phân. Coliforms chịu nhiệt là những coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường canh EC. Coliforms phân (Faecal Coliforms hay E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển, thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường. Trên thực tế kiểm nghiệm Coliforms phân được quan tâm nhiều hơn, đặc biệt là E. coli là loài được quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm.
2. Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc: Lớp: Schgzomycetes Bộ: Eubacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống: Escherichia Loài: Escherichia coli E. coli là một phân nhóm của nhóm coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++ Escherichia coli còn có tên là Bacteriam coli Commue được ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em. Theo P. J. Quinn và cs (1994), E. coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nước, ngoài tự nhiên. Hầu hết chúng không gây hại cho người và động vật, giúp ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên cho đến nay đã phát hiện được 5 dòng có khả năng gây hại cho người và động vật là: EAEC (Enteroaggregative E. coli), E. coli kết tập ở ruột. EHEC (Enterohemorrhagic E. coli), E. coli gây xuất huyết ở ruột. EPEC (Enteropathogenic E. coli), E. coli gây bệnh đường ruột. ETEC (Enterotoxigenic E. coli), E. coli sinh độc tố ruột.
EIEC (Enteroinvasive E. coli), E. coli xâm lấn niêm mạc ruột. Tính chất vi sinh học E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, gram âm bắt màu hồng, kích thước dài hay ngắn tuỳ thuộc vào môi trường nuôi cấy trung bình 2 – 3µm x 0,5µm, hai đầu tròn, có lông quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành nha bào. Trong bệnh phẩm có khi bắt màu lưỡng cực hai đầu. Đặc điểm nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, nhiệt độ phát triển thích hợp là 37oC, pH = 7,4. Mọc tốt trên môi trường dinh dưỡng thông thường chịu được nhiệt độ biến thiên từ 4 – 450C. Môi trường thạch dinh dưỡng tạo khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng đục hơi lồi để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn. Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β. Trên thạch gelatin không tan chảy. Môi trường canh dinh dưỡng: làm đục đều môi trường, sau lắng xuống đáy, có màu tro nhạt đôi khi có màu xám, có mùi trứng thối. Trên môi trường chuyên biệt. Môi trưòng Eosin mythylen blue (EMB) tạo khuẩn lạc tím ánh kim. Môi trường MacConkey (MCK) tạo khóm đỏ hồng. Môi trường Kligler iron agar (KIA) lên men đường glucose và lactose (vàng / vàng), sinh gas, không sinh H2S. Môi trường Brilliant green agar (BGA) tạo khuẩn lạc xanh lá mạ. Đặc tính sinh hoá
E. coli lên men sinh hơi đường glucose, manitol, lactose, galactose nhưng không sinh hơi đường maltose, arabinose.E. coli không lên men dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin. E. coli không sinh H2S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên Nitrate thành Nitrite. Để phân biệt E. coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng thử nghiệm IMViC. E. coli cho kết quả IMViC là: + + hay + . Sức đề kháng E. coli bị diệt ở 55oC trong 1 giờ, 60oC trong 15 30 phút, các chất sát trùng như acid phenic, formol có thể bị diệt trong 5 phút. Đề kháng với sự sấy khô, 95% E. coli bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ. Kháng nguyên Vi khuẩn đường ruột E. coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Dựa vào tính chất kháng nguyên, người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết thanh (serotype) khác nhau. Kháng nguyên O (somatic antigen) là kháng nguyên chịu nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2 giờ, kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%, bị hủy bởi formol 5%, rất độc chỉ cần 0,05mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ. Được phân bố trong vách tế bào, bao gồm hỗn hợp lipid–polysaccharid–protein.Lipid xác định độc tính colitoxin, polysaccharid xác định tính đặc thù của huyết thanh và protein mang tính kháng nguyên. Kháng nguyên O được chia làm 4 nhóm chính: OI , OII, OIII, OIV, với trên 150 loại khác nhau, nó bám vào nhung mao ruột làm giảm sự hấp thụ. Kháng nguyên K (capsalar antigen) có bản chất là polysaccharid hay protein, chịu nhiệt kém (dễ bị phá huỷ ở 1000C trong 1 giờ). Có hơn 100 loại khác nhau và nằm ngoài kháng nguyên O. Nếu kháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn thì sẽ
ngăn cản phản ứng ngưng kết O. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu. Kháng nguyên H (flagellar antigen) có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết H. Kháng nguyên F (fimbrial antigen) có dạng hình sợi, dài khoảng 4 m, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 – 7nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó, ngƣời ta có thể định danh vi khuẩn. Độc tố E. coli sinh ra các độc tố sau Nội độc tố: gồm 2 loại Enterotoxin LT: không bền với nhiệt độ, trọng lượng phân tử 91,5 KDa, chia làm 2 phần LTa và LTb, mang tính kháng nguyên. LT gây hoạt hoá adennylcylase trong tế bào biểu mô ruột, làm tăng lượng AMP vòng do đó kích thích bài tiết CT và Bicarbonate, ức chế tái hấp thụ Na+ , hậu quả cuối cùng là tiêu chảy mất nước.
Enterotoxin ST: bền với nhiệt gồm STa và STb không có tính kháng nguyên. ST hoạt hoá fuanylcylase làm tăng GMP vòng dẫn đến kích thích bài tiết nước muối gây tiêu chảy. Ngoại độc tố: trọng lượng phân tử 70 KDa, mang tính kháng nguyên. Tình hình nhiễm Các ổ dịch trên gia súc và người gây ra bởi các kiểu huyết thanh O157:H7, đã được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1982. Sau đó được ghi nhận ở một số nơi như: Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi, Nam Mỹ, Nhật, Úc…Đặc biệt là ở Nhật vào năm 12 1996 làm 10 ca tử vong và hơn 8000 ca bệnh. Ở các nước phát triển, có thể do sự hạn chế về trang thiết bị kỹ thuật trong chẩn đoán nên người ta chưa điều tra xác định được tầm quan trọng của bệnh. Các vụ dịch lớn làm một số người chết do ăn bánh mì kẹp thịt nấu chưa chín, do uống sữa chưa được khử trùng, có khi do uống rượu táo được chế biến từ táo bị nhiễm phân bò. Ở Châu Âu và Bắc Mỹ dịch thường xảy ra vào mùa hè, có thể do nhiều yếu tố như sự gia tăng tiêu thụ nước, sự nhiễm khuẩn cao hơn trong thịt bò. Đặc điểm gây bệnh Chúng tiết ra các độc tố tế bào (cytotoxin), các dòng vi khuẩn này có một plasmid có thể giúp chúng bám dính vào màng nhày của ruột, gây tiêu chảy không có máu hoặc có máu và các hội chứng khác ở người. Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh đường ruột của vi khuẩn E. coli cũng có một số điểm giống vi khuẩn Salmonella và họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae). Để gây bệnh trước hết vi khuẩn phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các nhân tố xâm nhập, vi khuẩn bám dính vào lớp tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đây, chúng phát triển và nhân lên làm phá huỷ các lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột. Đồng thời sản sinh độc tố
đường ruột enterotoxin gồm yếu tố chịu nhiệt (ST) làm tăng tính thẩm xuất của tế bào thành ruột và phá huỷ tế bào, yếu tố không chịu nhiệt (LT) sẽ tác động vào quá trình trao đổi muối, nước làm rối loạn chu trình này. Nước từ cơ thể chảy vào ống ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác động cơ học làm nhu động ruột đẩy nước và thức ăn gây nên hiện tượng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột, chúng vào hệ bạch huyết, đến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu, chúng chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ thống tuần hoàn chúng theo các vi quản đến các tổ chức, cơ quan, ở đây chúng lại phát triển nhân lên lần thứ hai. Chúng phá huỷ tế bào tổ chức gây viêm và sản sinh ra độc tố toxogenic và verotoxin phá huỷ tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết. Triệu chứng trúng độc E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến nhất, đặc biệt là ở trẻ em. Đường lây nhiễm chủ yếu là qua đường tiêu hoá do sử dụng nguồn nước và ăn phải thức ăn bị ô nhiễm có chứa lượng lớn vi khuẩn E. coli.13 Sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm E. coli thì trong vòng 4 – 48 giờ sẽ có các triệu chứng như đau bụng, đi ngoài phân lỏng từ 5 – 15 lần/ngày có lẫn máu trong phân, đôi khi có buồn nôn. Nếu không được cấp cứu, xử trí kịp thời sẽ bị mất nước, điện giải, rối loạn thân nhiệt, hạ huyết áp và có thể tử vong. Phòng ngừa E. coli gây bệnh theo phân ra ngoài và phát tán trong đất, nước, không khí. Ngoài ra, bệnh có thể lây truyền từ người sang người do tay bẩn, thực phẩm và nước uống bị nhiễm. Do đó, bệnh có thể gây thành dịch, đặc biệt ở nhà trẻ, khoa nhi của bệnh viện và người già. Vì vậy phòng bệnh chủ yếu là tuân thủ nghiêm ngặt qui chế vệ sinh, chú ý xử lý phân và dụng cụ của bệnh nhân. Không nên ăn những loại thực phẩm không đảm bảo
chất lượng, đặc biệt là sản phẩm từ thịt chưa nấu chín. Có thể xác định mật độ E. coli trong nước để xem nước có nhiễm bẩn hay không. II. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG 1. Định tính 1.a. Nguyên tắc:  E. coli lên men sinh hơi đường glucose, manitol, lactose, galactose nhưng không sinh hơi đường maltose, arabinose. E. coli không lên men dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin.  Trong môi trường BGBL, khuẩn lạc dẹt, có ánh kim  E. coli không sinh H2S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên Nitrate thành Nitrite. 1.b. Quy trình định tính: 2. Định lượng 2.a. Phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất; số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục …), ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng.
Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng. Cụ thể là xác định số lượng Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt hoặc nước thải.  Nguyên tắc Số lương E.coli trong mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp có thể được xác định bằng phương pháp MPN ( Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và được vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. Môi trường và hóa chất : Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate) Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL) Môi trường lỏng E.coli (E.coli medium, canh EC) Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. Môi trường thạch đĩa EMP Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate) Canh MRPV Thuốc thử Methyl Read Thuốc thử αnapthol.  Thao tác:
Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp. Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môi trường Lauryl Sulphate broth (LSB). Hút 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 3 ống nghiệm. Bước 3: Ủ ấm từ 35 – 370C, thời gian 24 48 giờ. Bước 4: Ống dương tính là có bọt khí trong ống durham. Bước 5: Tra bảng Mac Crady – loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ liên tiếp. Bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1ml và 0,1ml tương đương MPN/ml của mẫu đã pha loãng 101, 102 và 103 dùng phân tích. Kết quả tra bảng MPN/ml = kết quả tra bảng x f/10 ( f độ pha loãng thấp nhất 10n) Lưu ý: Các ống nghiệm có khả năng hiện diện của coliform là dương tính cả hai môi trường LSB và BGBL.  Quy trình phân tích
Tuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng 101vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 102 và 103. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay 9 ống nghiệm). nếu nghi ngờ số lượng vi sinh vật trong m ẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37 0C trong 48 giờ.Ghi nhận ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết quả (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng. Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi trường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,20C trong 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng. Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ông (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa MBN. Ủ các đĩa này ở 370C trong 24 giờ để tìm khuẩn lạc E.coli giả định (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím). Chọn khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào các môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC. Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là + + chính là E.coli. Ống nghiệm cho kết quả trong môi trường EC và khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E.coli (+).Thực hiện tương tự cho tất cả các ông nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.  Cách đọc kết quả Ở tất cả các trường hợp nêu trên, từ số lượng các ông nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3 x 3 tức 9 ống nghiệm) để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. 2.b. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc  Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose.Đếm số khuẩn lạc lên men lactose & sinh acid sau khi ủ ở 37±1oC trong 2448h., đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của Coliforms.Khẳng định khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC.  Môi trường và hóa chất
Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 450C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng. Môi trường canh Escherichia coli broth (EC Broth) được phân phối 10ml trong mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm tra không có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham. Các ống EC này được bảo quản ở 2 – 80C. Môi trường canh Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth (LST Broth) được chuẩn bị tương tự môi trường canh EC. Môi trường canh Tryptone Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng. Môi trường canh MRVP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng, để nguội và bảo quản ở 280C cho đến khi sử dụng. Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng có màu xanh lục. Thuốc thử Kovac’s.  Quy trình phân tích Mẫu được đồng nhất hóa bằng cách đối với mẫu rắn xay nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng rồi cân chính xác 10g (hoặc 25g), đối với mẫu lỏng hút 10ml (hoặc 25ml), bổ sung vào trong bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW đã được hấp khử trùng. Lắc đều trong một thời gian nhất định (ít nhất là 2 phút đối với mẫu rắn). Sau khi được làm đồng nhất bằng cách trên, dung dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 101 so với ban đầu. Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng. Dung dịch này có độ pha loãng 102, sau đó tiếp tục chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml dung dịch pha loăng ta sẽ thu được dịch mẫu có độ pha loãng 103. Tiếp tục thực hiện để được các độ pha loãng thập phân tiếp theo sao cho chứa
dịch mẫu với môi trường. Để nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổng thương. Bổ sung vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 450C trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 ± 1 0C trong 24 – 48 giờ. Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng. Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥ 0,5 mm), dung que cấy vòng chuyền sang môi trường canh EC, ủ ở 44 ± 0,50C trong 24 giờ. Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dung que cấy vòng chuyền sang các môi trường sau: canh Tryptone, canh MRVP, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường trên ở 44 ± 0,50C trong 24 giờ Thử nghiệm Indol, Methyl Read, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nh ận khu ẩn l ạc cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) ( IMViC là + + ).  Cách tính kết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ khẳng định, tính mật độ của E.colitheo công thức sau: A(CFU/mghayCFU/ml)=x R N: tổng số khuẩn lạc đếm được ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng V: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỷ lệ khẳng định
2.c. Phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang Khi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang với các chất nhuộm khác như acridin cam (AODC), 4’,6dianidino2phenylindol (DAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC) cũng được sử dụng rộng rãi để đếm số lượng vi khuẩn. Các nghiên cứu của K.G. Porter và Y.S. Feig cho thấy rằng khi sử dụng DAPI để đếm số lượng vi khuẩn trong nước cho kết quả tốt hơn khi sử dụng chất nhuộm AODC khi trong mẫu nước có nhiều chất dinh dưỡng và nhiều phiêu sinh vật khác. Về độ bền tính phát huỳnh quang của DAPI cũng cao hơn AODC.Hai tác giả trên cũng chứng minh rằng khi nhuộm với DAFI có thể bảo quản trong tối đến 24 tuần mà cường độ phát quan không thay đổi.Trong khi đó AODC cường độ và số lượng phát quang bị giảm khi bảo quản trong vòng 1 tuần ở củng điều kiện. Một kỹ thuật khác dựa trên nguyên tắc nhuộm màu đặc hiệu DNA được gọi là Hoechst 33258 cũng được sử dụng để nhuộm và đếm số lượng vi sinh vật trên kính hiển vi huỳnh quang. Phương pháp này như sau: Bisbenzumide kết hợp với vùng DNA giàu adenine và thyamine sau khi gắn phức hợp này sẽ phát huỳng quang. Hoechst 33258 được sử dụng nhiều trong việc định lượng vi sinh vật trên bề mặt. Đặt biệt trên bề mặt có gắn các acridine orange. Một sự thuận lợi khác khi sử dụng phương pháp nhuộm màu bisbenzimide cho phép đếm số lượng vi sinh vật trong các dụng dịch chất tẩy rửa, trong muối dùng cho các phòng thí nhiệm hay trong các chế phẩm sinh học khác mà không có sự hiện diện của DNA. Phương pháp đếm số lượng vi sinh vật bằng phương pháp phát huỳnh quang được ứng dụng rộng rãi trong việc phân tích các mẫu môi trường như nước đất …. Sử dụng dầu nhúng phát quang thấp là một phát minh quan trọng trong việc hạn chế sự phát huỳnh quang của các màng lọc. Màng carbonate Nuclepore là một màng cellulose cao cấp dùng trong việc đếm trực tiếp vi khuẩn bởi vì chúng có kích thước lổ đồng nhất và bề mặt màng phẳng, chúng có thể giữ lại tất cả các vi sinh vật trên bể mặt của chúng. Màng Nuclepore có thể nhuộm với thuốc nhuộm Irgalan đen hay các loại thuốc nhuộm phù hợp khác để tạo nên một nền màu đen tương phản với màu phát quang của vi sinh vật vì thế việc đếm được thực hiện dễ dàng. Khi sử dụng thuốc nhuộm là acridine cam vi khuẩn và các vi sinh vật khác phát quang màu xanh hay màu cam. Màu phát quang xanh hay cam là phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của từng vi sinh vật. Nhưng khả năng phân biệt tế bào đang sống hay tế bào đã chết bởi mầu phát quang đôi khi đưa đến sự nhầm lẫn. Sử dụng ADPI nhuộm DNA của tế bào vi khuẩn chúng đưa đến sự phát quang màu xanh dương được cho là tối ưu hơn so với việc sử dụng acridin cam để nhuộm các vi khuẩn có kích thước nhỏ.
Số đếm nhận được từ phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi phát huỳnh quang luôn cho kết quả cao tương đương hai lần so với kết quả nhận được bằng kỹ thuật nuôi cấy khác. Những vi khuẩn có kích thước nhỏ, có hình dạng bất thường khác cũng đều có thể nhìn thấy bằng phương pháp phát huỳnh quang. Một số dạng vi sinh vật không thể nuôi cấy trong các môi trường tổng hợp trong phòng thí nghiệm. Hiện tượng không thể nuôi cấy của các vi sinh vật cho đến nay vẫn chưa rõ là do chúng thoái hoá, không thể nhân lên trong các môi trường nhân tạo hay do không đáp ứng được các điều kiện sinh lý cần thiết cho sự phát triển của chúng. Trong một số trường hợp, sự tương quan cao giữa phương pháp đếm trực tiếp bằng phương pháp phát huỳnh quang và phương pháp đếm khuẩn.Tuy nhiên trong một số trường hợp khác sự tương quang này rất kém.Sự khác biệt giữa phương pháp đếm trực tiếp và phương pháp đếm khuẫn lạc phản ánh sự chọn lọc của môi trường và điều kiện nuôi cấy, một phần tế bào bị chết hay bị thương tổn và số loài cụ thể trong mẫu. 2.d. Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc: Phương pháp này thường được áp dụng cho các mẫu lỏng như nước, sữa… và được đánh giá là cho kết quả chính xác hơn so với phương pháp ứơc đoán MPN. Các mẫu chất lỏng được lọc qua màng lọc có kích thước lổ lọc nhỏ hơn kích thước của vi sinh vật. Vi sinh vật được giữa lại trên màng lọc. Màng được đặt trên môi trường agar hay trên giấy thấm được ngấm sủn môi trường nuôi cấy lỏng đã chọn và ủ trong điều kiện xác định.Sau khi ủ, đếm các khuẩn lạc sẽ xuất hiện trên bề mặt màng lọc. Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp:
2.e. Dùng Đĩa Petrifilm Đĩa Petrifilm E.coli/Coliform Count dùng để xác định cả E.coli và các loại coliform khác. Với một bước kiểm tra đơn giản, bạn có thể xác định kết quả chỉ trong vòng 24 đến 48 giờ. Bằng cách loại bỏ yêu cầu bước xác định các khuẩn lạc nghi ngờ, bạn sẽ gia tăng hiệu quả phòng thí nghiệm đáng kể và cắt giảm được tổng chi phí.Đĩa Petrifilm là phương pháp làm sẵn và cung cấp chi phí hiệu quả nhất, thuận tiện và đáng tin cậy để kiểm tra thiết bị, nguyên liệu tươi sống, thực phẩm thành phẩm và môi trường sản xuất. Sử dụng đĩa Petrifilm tiết kiệm công lao động, bạn sẽ có thời gian để giám sát các điểm kiểm soát tới hạn thường xuyên hơn. Kết quả cuối cùng là kiểm soát quá trình sản xuất tốt hơn và chất lượng sản phẩm được nâng cao hơn. Nhanh chóng, chính xác. Chỉ qua 3 bước đơn giản: 1 Cấy và trải đều 1 ml mẫu trên đĩa. 2 Ủ ở nhiệt độ thích hợp. 3 Đếm số khuẩn lạc. Vì đĩa Petrifilm được làm đồng nhất và dễ dàng sử dụng nên ít xảy ra sai sót so với các phương pháp khác.Đĩa có kẻ ô thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc.Cho kết quả nhanh, chính xác và nhất quán. Có thể sử dụng máy đếm khuẩn lạc Quebectype hoặc nguồn sáng phóng đại. Chất nhuộm chỉ thị trong đĩa cho tất cả khuẩn lạc màu đỏ, tấm film phía trên giữ khí (giống như bọt khí) sinh ra bởi coliforms. Ngoài ra, chất chỉ thị glucuronidase hình thành nên chất tủa màu xanh xung quanh các khuẩn lạc E.coli. E. coli O157:H7 không sinh glucuronidase, do đó không xuất hiện chất tủa màu xanh. Đĩa Petrifilm E.Coli/Coliform Count (EC) có chứa Violet Red Bile (VRB), chất gel tan được trong nước lạnh, chất chỉ thị hoạt động của glucuronidase và một chất chỉ thị giúp cho việc đếm khuẩn lạc dễ dàng hơn. Hầu hếtE.coli (khoảng 97%) sinh beta glucuronidase, chất này tạo tủa màu xanh gắn kết với khuẩn lạc.Tấm film phíatrên giữ bọt khí sinh ra từ quá trình lên men lactose của E.coli và coliforms. Khoảng 95% E.coli có sinh bọt khí,cho khuẩn lạc có màu từ xanh đến xanh – đỏ kèm theo bọt khí trên đĩa Petrifilm.
AOAC INTERATIONAL và U.S FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) xác định Coliforms là trực khuẩn gram âm, hình que, sinh hơi và acid suốt quá trình lên men chuyển hoá lactose.Khuẩn lạc coliform phát triển trên đĩa Petrifilm 3M EC sinh acid, chất chỉ thị pH trong đĩa làm cho lớp keo có màu đỏ.Khí sinh ra được giữ lại xung quanh khuẩn lạc Coliform màu đỏ là dấu hiệu để xác định Coliform. Việc xác định E. coli có thể theo nhiều cách khác nhau theo từng quôc gia. (Xem phần hướng dẫn thời gian và nhiệt độ ủ ). Theo AOAC INTERNATIONAL: – E.coli = 49 (khuẩn lạc màu xanh có khí). – Coliform tổng = 87 (khuẩn lạc xanh và đỏ có khí). Không sử dụng đĩa này riêng rẻ để phát hiện E. coli O157.Như hầu hết những môi trường kiểm tra E.coli/coliform khác, đĩa này sẽ không hiển thị đặc biệt với bất kì dòng O157 nào hiện diện. + Đối với coliforms: Ủ 24h ± 2h 35°C ± 1°C. + Đối với E.coli : Ủ 48h ± 2h 35°C ± 1°C. – AOAC Official Method 998. 08 + Đối với E.coli (trong thịt, thịt gia cầm và hải sản): Ủ 24h ± 2h 35°C ± 1°C.
– NMKL method (147.1993) + Đối với coliforms: Ủ 24h ± 2h 37°C. + Đối với E.coli: Ủ 48h ± 2h 37°C. 2.f. Dùng Colilert Colilert – bộ phân tích nhanh chỉ tiêu vi sinh mẫu nước của hãng Idexx – Mỹ cho phép phát hiện đồng thời định tính và định lượng cả hai chỉ tiêu Coliform và Ecoli chỉ sau 24 giờ hoặc 18 giờ mà không cần quá trình đếm khuẩn lạc phức tạp và dễ sảy ra sai xót. Ưu điểm nổi bật của Colilert: • Dễ sử dụng: Thao tác đơn giản, không cần pha loãng mẫu, Không cần tạo môi trường cấy, không cần đếm khuẩn lạc, Giảm tối đa yếu tố cản trở hay dị dưỡng. • Tốc độ phân tích nhanh: Thực hiện nhanh Phân tích đồng thời Coliform và E.coli trong vòng 18 tiếng hoặc 24 tiếng.Thời gian chuẩn bị mẫu ít (dưới 1 phút), tăng hiệu suất phân tích mẫu. • Chính xác: Độ tin cậy đạt 95 % cao hơn phương pháp đa ống nghiệm và màng lọc. Có khả năng định lượng từ 1 đến 200 MPN/100mL đối với khay 51 giếng , từ 1 đến 2419 MPN/100mL đối với khay 97 giếng vượt xa so với phương pháp truyền thống. • Tin cậy: Bộ phân tích Colilert xác định Ecoli, coliform là phương pháp được chấp thuận bởi US EPA (Cục bảo vệ môi trường Mỹ), US FDA (Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ) và các tổ chức quốc tế như AOAC, WHO, IBWA. • Hiệu quả kinh tế: Tiết kiệm 70 % chi phí thiết bị so với phương pháp màng lọc Không cần kiểm tra lại do không có những yếu tố cản trở. Các bước đơn giản để phân tích định tích và định lượng Coliform và Ecoli bằng Colilert:
1 Pha thuốc thử vào 100mL mẫu. 2 Đổ mẫu vào khay nhựa định lượng. 3 Dán khay bằng máy dán và ủ mẫu ở thời gian và nhiệt độ thích hợp. 4 Định tính: Quan sát kết quả định tính dễ dàng bằng mắt thường: Giếng màu vàng dương tính với Coliform, soi đèn UV giếng phát huỳnh quang cho kết quả dương tính với Ecoli. 5 Định lượng: Đếm số gếng trên khay có kết quả dương tính, đối chiếu với bảng MPN để định lượng Ecoli và Coliform III. CÁC TIÊU CHUẨN HIỆN HÀNH 1. Đối với nước Theo TCVN 5942 – 1995 qui định hai mức sau: • Loại A dùng làm nguồn cấp nước sinh hoạt nhưng phải qua quá trình xử lý, giới hạn tối đa số Coliforms cho phép là 5000 MPN/100ml • Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số Coliforms cho phép là 10 000 MPN/100ml • Đối với nước ngầm, tiêu chuẩn chất lượng về vi sinh vật theo TCVN 5944 – 1995 được quy định là Coliforms không quá 3 MPN/100ml, không cho phép có Coliforms phân Bảng: Chỉ tiêu coliforms và E.coli trong nước uống Chỉ tiêu Mức tối đa cho phép +Coliforms (MPN/100ml) 0