Tình hình nhiễm độc tố nấm (Aflatoxin B1, Ochratoxin A, Citrinin) trên gạo tại Nha Trang

Trường Đại học Thủy sản<br /> <br /> Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản Số 2/2006<br /> <br /> TÌNH HÌNH NHIỄM ĐỘC TỐ NẤM (AFLATOXIN B1, OCHRATOXIN A, CITRININ)<br /> TRÊN GẠO TẠI NHA TRANG<br /> Nguyễn Minh Trí – Khoa Chế biến<br /> Tóm tắt<br /> Bằng phương pháp tách chiết với acetonitrile/ nước (9/1), tinh chế lỏng-lỏng, định lượng trên<br /> HPLC, chúng tôi phân tích đồng thời các độc tố nấm Aflatoxin B1 (AFB1), Citrinin (CIT), Ochratoxin A<br /> (OTA) trên gạo, với giới hạn định lượng theo thứ tự là 0,15 ; 0,17 ; 0,26 ng/g. Chúng tôi tiến hành định<br /> lượng các độc tố này trên 64 mẫu gạo thu thập từ 4 chợ lớn ở Nha Trang. Nhiễm AFB1 là chủ yếu. Tỷ<br /> lệ nhiễm AFB1 36/64 (41%), chủ yếu trong mùa mưa (84%), và loại gạo rẻ tiền (100%), mẫu nhiễm<br /> cao nhất là 7,2 ng/g.<br /> 1. Đặt vấn đề<br /> Hiện nay chúng ta quan tâm nhiều đến chất<br /> lượng thực phẩm, bởi chất lượng thực phẩm<br /> ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ con người.<br /> Có rất nhiều mối quan tâm, bên cạnh vấn đề giá<br /> trị dinh dưỡng, vấn đề an toàn thực phẩm được<br /> đặc biệt chú trọng, trong đó nhiễm các chất gây<br /> hại cho người như kim loại nặng, thuốc trừ sâu,<br /> dư lượng phân bón, các độc tố khác nhau …<br /> Trong điều kiện khí hậu của nước ta, khí<br /> hậu gió mùa, chế độ mưa ẩm cao. Điều kiện bảo<br /> quản lúa gạo đã được quan tâm, tuy nhiên vẫn<br /> còn ở quy mô lớn, ở các kho lúa gạo lớn của cả<br /> nước, ở các kho xuất khẩu, còn đối với các địa<br /> phương, các kho nhỏ lẻ chưa được quan tâm và<br /> hiểu về nó chưa đúng mức, hậu quả sẽ ảnh<br /> hưởng không nhỏ đến chất lượng thực phẩm<br /> cung cấp cho người dân. Trong điều kiện như<br /> vậy, nấm mốc có thể phát triển sinh độc tố được<br /> gọi là độc tố nấm (mycotoxin), gây ảnh hưởng<br /> đáng kể đến sức khoẻ người tiêu dùng, đặc biệt<br /> là gây ung thư. Trong đó có thể kể đến Aflatoxin<br /> B1 (AFB1), Ochratoxine A (OTA), Citrinine (CIT).<br /> Để đánh giá mức độ nhiễm, chúng tôi tiến<br /> hành điều tra mức độ nhiễm độc tố nấm ở gạo<br /> (AFB1, OTA, CIT) bán ở các chợ tại Nha Trang.<br /> Độc tố<br /> Aflatoxin B1<br /> Ochratoxin A<br /> Citrinin<br /> <br /> ma (g/mol)<br /> 312<br /> 403<br /> 250<br /> <br /> 2.4. Định lượng AFB1, OTA và CIT trên<br /> HPLC<br /> Sử dụng thiết bị HPLC của Nhật<br /> Để tối ưu hoá độ nhạy cảm khi phân tích<br /> AFB1, OTA, CIT sử dụng các thông số huỳnh<br /> quang kích thích và phát xạ khác nhau (AFB1<br /> 365 440 nm ; OTA 335 và 465 nm ; CIT 331 và<br /> 500 nm). Phân tích được tiến hành trên cột C18<br /> (3µm C18, 0,46 x 25 cm).<br /> Hệ thống được phân tích với phase động<br /> H3PO4 (0,33 M)/ acetonitrile/ propanol-2<br /> <br /> 26<br /> <br /> 2. Vật liệu và phương pháp<br /> 2.1. Thu thập mẫu<br /> 64 mẫu gạo được lấy ngẫu nhiên tại 4 chợ<br /> tại Nha Trang : Chợ Đầm, Chợ Xóm Mới, Chợ<br /> Vĩnh Hải, chợ Phước Thái. Mẫu được lấy 2 lần<br /> vào mùa mưa và mùa khô.<br /> 2.2. Hoá chất<br /> Tất cả hoá chất (chlorua kali, acid<br /> chlohydric, acid phosphoric, …) ở mức PA. Tất<br /> cả dung môi (methanol, chloroform, acetonitrile,<br /> propanol-2-ol, n-hexane) ở mức HPLC. Nước<br /> khử ion được sử dụng để chuẩn bị các dung<br /> dịch dùng trong quá trình tách chiết, tinh chế và<br /> phân tích trên HPLC.<br /> 2.3. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn<br /> Các dung dịch chuẩn được chuẩn bị 10 mg<br /> AFB1, OTA hay CIT/ml methanol. Một loạt các<br /> dung dịch chuẩn từ 0,3 đến 100 ng AFB1, OTA,<br /> CIT/ml được chuẩn bị bằng pha loãng. Nồng độ<br /> của dung dịch chuẩn gốc được xác định bằng độ<br /> hấp phụ tia cực tím (A) theo công thức :<br /> <br /> ρ (µg / ml ) =<br /> <br /> Dung môi<br /> Methanol<br /> Methanol<br /> Methanol<br /> <br /> λmax<br /> 360<br /> 333<br /> 321<br /> <br /> 1000ma A<br /> ε<br /> <br /> ε (cm mol )<br /> 21800<br /> 5440<br /> 5490<br /> 2<br /> <br /> -1<br /> <br /> (650/400/50) ; tốc độ dòng 0,5 ml/ phút. Thời<br /> gian lưu đối với từng độc tố nấm : AFB1 là 14<br /> phút, CIT là 28 phút, và OTA là 56 phút. Các sắc<br /> ký đồ được phân tích dựa vào phần mềm ClassLC10 của Shimadzu version 1.60.<br /> - Chiết xuất: Thêm 10 ml dung dịch KCl 4%<br /> (pH 1,5) vào 20 g mẫu đã được nghiền nhỏ. Rồi<br /> được thêm vào 90 ml acetonitrile, lắc 20 phút.<br /> Chất chiết được lọc qua giấy lọc nhờ hút chân<br /> không.<br /> - Tinh chế: 100 ml n-hexane được thêm vào<br /> dịch lọc, lắc 5 phút, sau khi để lắng, bỏ lớp trên,<br /> <br /> Trường Đại học Thủy sản<br /> <br /> Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản Số 2/2006<br /> <br /> lặp lại bước này 1 lần nữa. Thêm vào lớp dưới<br /> 50 ml nước khử ion, và 100 ml chloroform. Lớp<br /> dung môi trên được chiết lại 2 lần với 50 ml<br /> chloroform. Trộn chung chloroform chiết được.<br /> Cho bay hơi trong cô quay cho đến khi gần<br /> 0<br /> khô ở 40 C, tránh ánh sáng. Bình chứa<br /> chloroform được tráng rửa bằng choloroform<br /> <br /> Mẫu gạo nhiễm<br /> <br /> chuyển sang ống nghiệm và làm khô dưới khí<br /> nitơ. 2ml methanol được thêm vào, đánh siêu<br /> âm, lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ lọc nhỏ<br /> hơn 0,45 µm. Làm khô dưới khí nitơ. 500 µl<br /> methanol được thêm vào và đem phân tích trên<br /> HPLC.<br /> <br /> Gạo không nhiễm<br /> + độc tố nấm<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ mẫu gạo nhiễm độc tố và mẫu gạo không nhiễm+độc tố chuẩn.<br /> 3. Kết quả và thảo luận<br /> 3.1. Đánh giá khả năng tách chiết và tinh<br /> chế của phương pháp.<br /> Dựa vào tính chất tan trong dung môi hữu<br /> cơ giống nhau của các độc tố nấm phân tích<br /> (AFB1, OTA, CIT) chúng tôi đưa ra được<br /> phương pháp tách chiết và tinh chế như trên.<br /> Đánh giá khả năng tách chiết và tinh chế dựa<br /> <br /> vào khả năng thu hồi. Khả năng thu hồi được<br /> xác định bằng cách thêm độc tố (AFB1, OTA,<br /> CIT) vào các mẫu gạo sạch, sau đó định lượng<br /> các độc tố này trong các mẫu gạo đã gây nhiễm.<br /> Xác định tỷ lệ phần trăm định lượng được. Mỗi<br /> thí nghiệm lặp lại 3 lần. Kết quả được trình bày<br /> trong bảng 1.<br /> <br /> Bảng 1: Tỷ lệ thu hồi và độ lệch chuẩn tương đối RSD của các độc tố khảo sát<br /> Độc tố<br /> AFB1<br /> CIT<br /> OTA<br /> <br /> Nồng độ gây nhiễm<br /> 2 ng/g<br /> 2 ng/g<br /> 2 ng/g<br /> <br /> Tất cả kết quả thí nghiệm đều nằm trong<br /> khoảng giới hạn cho phép của Châu Âu (Số<br /> 472/2002 và 26/2002), nồng độ gây nhiễm giữa<br /> 1-10 ng/g, tỷ lệ thu hồi chấp nhận trong khoảng<br /> 70-110% và RSD nhỏ hơn 20%.<br /> 3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định<br /> lượng<br /> <br /> Tỷ lệ thu hồi (%)<br /> 96,9<br /> 84<br /> 101,9<br /> <br /> RSD (%)<br /> 2,7<br /> 5,2<br /> 5,7<br /> <br /> Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định<br /> lượng (LOQ) được xác định bằng cách lấy 3,3<br /> và 10 lần độ lệch chuẩn (theo thứ tự) chia cho<br /> độ dốc của đường cong chuẩn từng loại độc tố.<br /> Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 2.<br /> <br /> 27<br /> <br /> Trường Đại học Thủy sản<br /> <br /> Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản Số 2/2006<br /> <br /> Bảng 2 : Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các độc tố thử nghiệm<br /> <br /> LOD (ng/g)<br /> LOQ (ng/g)<br /> <br /> AFB1<br /> 0,048<br /> 0,144<br /> <br /> CIT<br /> 0,056<br /> 0,168<br /> <br /> OTA<br /> 0,086<br /> 0,260<br /> <br /> Với kết quả này chúng ta thấy phương pháp này khá nhạy, cho phép phát hiện được độc tố nấm<br /> quan tâm dưới 0,1 ng/g; và giới hạn định lượng dưới 0,3 ng/g.<br /> 3.3. Kết quả phân tích<br /> Kết quả phân tích 64 mẫu gạo tại 4 chợ lớn ở Nha Trang trình bày trên bảng 3, 4, 5, 6.<br /> Bảng 3: Kết quả phân tích trên mẫu gạo ở Chợ Đầm<br /> Kí hiệu<br /> 1(a)<br /> 2(a)<br /> 3(a)<br /> 4(a)<br /> 5(b)<br /> 6(b)<br /> 7(b)<br /> 8(b)<br /> 9(a)<br /> 10(a)<br /> 11(a)<br /> 12(a)<br /> 13(b)<br /> 14(b)<br /> 15(b)<br /> 16(b)<br /> <br /> Thời điểm<br /> lấy mẫu<br /> Mùa mưa<br /> Mùa mưa<br /> Mùa mưa<br /> Mùa mưa<br /> Mùa mưa<br /> Mùa mưa<br /> Mùa mưa<br /> Mùa mưa<br /> Mùa khô<br /> Mùa khô<br /> Mùa khô<br /> Mùa khô<br /> Mùa khô<br /> Mùa khô<br /> Mùa khô<br /> Mùa khô<br /> <br /> Độc tố (ng/g)<br /> AFB1<br />