Tóm tắt Luận văn tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Sử dụng thịt đầu tôm thẻ chân trắng để chế biến phẩm giàu protein

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

76
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu chính của nghiên cứu trong luận án là xác định chế độ thích hợp cho quá trình phân hủy protein từ thịt đầu tôm thẻ bằng enzyme protease nội tại và enzyme thương mại để thu nhận dịch chế phẩm dịch protein thủy phân.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Sử dụng thịt đầu tôm thẻ chân trắng để chế biến phẩm giàu protein

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã ngành: 62 54 01 01 HÀ THỊ THỤY VY SỬ DỤNG THỊT ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) ĐỂ CHẾ BIẾN CHẾ PHẨM GIÀU PROTEIN Cần Thơ, năm 2019
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn: PGS. TS Nguyễn Văn Mười Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Phòng bảo vệ luận án tiến sĩ, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc……..giờ, ngày …….tháng……năm…….. Phản biện 1: ………………………………………….. Phản biện 2: ………………………………………….. Phản biện 3: ………………………………………….. Có thể tìm hiểu Luận án tại - Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc và Nguyễn Văn Mười, 2016. Ảnh hưởng của dung môi và thời gian kết tủa đến hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tôm. Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Số chuyên đề: Nông nghiệp (2016)(1): 9-17. 2. Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc và Nguyễn Văn Mười, 2018. Khảo sát đặc điểm enzyme protease thịt đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) sau quá trình tinh sạch sơ bộ. Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Số 54(1B) (2018): 28-36. 3. Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc và Nguyễn Văn Mười, 2018. Nghiên cứu kích hoạt enzyme protease nội tại từ thịt đầu tôm thẻ (Litopenaeus vannamei). Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Số 54(3B) (2018): 67-74. 4. Ha Thi Thuy Vy, Tran Thanh Truc and Nguyen Van Muoi, 2018. Opitimazation of protein hydrolysis condition from shrimp head meat (Litopenaeus vannamei) using commercial alcalase and flavourzyme enzymes. Can Tho University Journal of Science. Vol 54, Special issue: 16-25. 5. Nguyễn Văn Mười và Hà Thị Thụy Vy, 2018. Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme alcalase thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ chân trắng. Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Số chuyên đề 54(3B): 148-156.
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Năm 2007, Việt Nam gia nhập WTO - một tổ chức thương mại lớn nhất thế giới. Đây là cơ hội tốt cho những bước tiến của kinh tế Việt Nam, nhưng cũng không thể tránh được những thách thức mà tổ chức này đặt ra cũng như sự cạnh tranh gay gắt của các thành viên khác trong tổ chức làm ảnh hưởng đến nhiều lĩnh vực kinh tế, đặc biệt là đối với lĩnh vực xuất khẩu thủy sản của nước ta. Một trong các giải pháp nâng cao năng lực cạnh tranh của các doanh nghiệp là cải thiện quy trình chế biến, nâng cao năng suất, tận dụng triệt để nguồn phụ phẩm mà theo quan điểm trong sản xuất hiện đại gọi là nguyên liệu còn lại để chế biến các sản phẩm có giá trị gia tăng. Trong các nguyên liệu còn lại phải kể đến đầu và vỏ tôm thải ra trong quá trình sản xuất tôm đông lạnh, thường chiếm 50÷70% nguyên liệu ban đầu (Đỗ Văn Nam và ctv., 2005; Shahidi and Synowiecki, 1991). Năm 2017, sản lượng tôm thẻ đạt 470,5 nghìn tấn (61,41%), tôm sú 230,5 nghìn tấn (38,59%) (http://www.vasep.com.vn), với lượng phụ phẩm thải ra trong quá trình sản xuất chiếm khoảng 45-55% khối lượng tôm nguyên liệu. Đây là nguồn nguyên liệu tiềm năng trong chế biến và có giá trị dinh dưỡng tốt (Murueta et al., 2007). Gần đây, việc thu hồi protein từ các nguyên liệu thủy sản đã trở nên phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm do nguồn phụ phẩm rẻ tiền và dồi dào. Thủy phân protein làm giảm kích thước các peptit, dịch thủy phân là nguồn axit amin có sẵn cho quá trình sinh tổng hợp protein (Gildberg and Stenberg, 2001), là nguồn peptit có hoạt tính sinh học mang đến tiềm năng đáng kể trong dược phẩm như khả năng chống oxy hóa, khả năng kiểm soát enzyme gây cao huyết áp (Dey and Dora., 2014a; Holanda et al., 2006; Ganugula et al., 2008) hay khả năng chống đột biến gen có khả năng gây ung thư (Babu et al., 2008; Wilson-Sanchez et al., 2010; López-Saiz et al.,2016). Trong các phương pháp được sử dụng để thu hồi protein thì biện pháp sinh học, đặc biệt là bổ sung enzyme thương mại điển hình như enzyme alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, neutrase, protamex, flavourzyme (Chakrabarti, 2002; Gunasekaran et al., 2015; Randriamahatody et al., 2011; 2009; Dey and Dora, 2014a) nhằm rút ngắn thời gian thủy phân và nâng cao hiệu quả thủy phân protein cũng như chất lượng của dịch thủy phân thu nhận ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu của Hà Thị Thụy Vy và ctv. (2016) đã xác định trong đầu tôm chứa hệ enzyme protease có khả năng hoạt động khá mạnh . Do vậy, việc áp dụng mô hình kết hợp giữa enzyme thương mại và enzyme nội tại giúp sản xuất protein thủy phân có hiệu suất cao và nâng cao tính chất chức năng của dịch protein thu nhận được, và sử dụng chế phẩm thủy phân giàu protein trong chế biến thực phẩm là hướng đi đầy triển vọng. Nghiên cứu xây dựng được quy trình cho hoạt động thủy phân protein của tổ hợp enzyme sẽ mở ra một hướng đi mới trong việc cải tiến khả năng thu hồi và nâng cao chất lượng sản phẩm protein có hoạt tính sinh học, đồng thời giảm đáng kể chi phí sản xuất nhằm dần dần cải thiện giá trị thương mại của phụ phẩm tôm. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chính của nghiên cứu trong luận án là xác định chế độ thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ bằng enzyme protease nội tại và 1
enzyme thương mại (enzyme alcalse/flavourzyme) để thu nhận dịch chế phẩm dịch protein thủy phân. Trên cơ sở đó, enzyme protease nội tại được kết hợp với enzyme thương mại trong thủy phân thịt đầu tôm thẻ nhằm gia tăng hiệu suất quá trình thủy phân và nâng cao tính chất chức năng của dịch protein thu nhận được. Sau khi xử lý, chế phẩm thủy phân giàu protein từ thịt đầu tôm thẻ được thử nghiệm như nguồn nguyên liệu bổ sung nhằm cải thiện chất lượng cho một số thực phẩm chế biến tiêu biểu ở đồng bằng sông Cửu Long. Nội dung - Xác định một số tính chất cơ bản của enzyme protease thô thu nhận được bằng việc trích ly từ nguồn nguyên liệu thịt đầu tôm thẻ và sau khi tinh sạch sơ bộ. - Khảo sát các yếu tố cơ bản có ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân protein của thịt đầu tôm bằng việc sử dụng protease nội tại. - Xác định điều kiện thủy phân protein (pH, nhiệt độ thủy phân, nồng độ enzyme) từ thịt đầu tôm bằng enzyme protease ngoại bào (alcalase, flavourzyme) phù hợp. Từ đó, đề xuất biện pháp kết hợp enzyme protease thương mại và enzyme nội tại nhằm gia tăng hiệu quả thủy phân protein trong thịt đầu tôm. - Xây dựng quy trình chế biến chế phẩm protein thủy phân và đánh giá khả năng bảo quản sản phẩm. - Ứng dụng chế phẩm thủy phân giàu protein vào việc nâng cao chất lượng của nước mắm và cải thiện khả năng bảo quản khô cá lóc một nắng. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án Là công trình nghiên cứu mới được thực hiện một cách có hệ thống, tận dụng được nguồn protein và enzyme protease nội tại tự nhiên để thu nhận sản phẩm an toàn, đóng góp những dẫn liệu khoa học quan trọng về kích hoạt hoạt động của hệ enzyme nội tại và sử dụng nguồn protein giàu dinh dưỡng của phụ phẩm vào trong chế biến thực phẩm. Dựa trên các điều kiện hoạt động của enzyme nội tại, cùng với điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme thương mại trên thịt đầu tôm thẻ để tiến hành khảo sát khả năng kết hợp enzyme protease nội tại và enzyme thương mại. Nghiên cứu cũng đã xác định được phương pháp kết hợp và các thông số tối ưu cho quả trình tạo dịch thủy phân cô đặc vừa có giá trị dinh dưỡng vừa có hoạt tính sinh học (hoạt tính chống oxy hóa); đề xuất phương pháp ứng dụng dịch giàu đạm trong sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa từ thịt đầu tôm thẻ vào quá trình sản xuất. Kết quả nghiên cứu là giải pháp thiết thực từ thực tế sản xuất của ngành chế biến tôm đông lạnh, tạo sản phẩm có giá trị gia tăng từ nguồn phụ phẩm tôm, góp phần phát triển bền vững công nghiệp tôm của Việt Nam. Điểm mới của luận án Kết quả nghiên cứu làm phong phú thêm những hiểu biết về đặc điểm cũng như các thông số hoạt động của enzyme nội tại hiện diện trong thịt đầu của tôm thẻ chân trắng. Từ đó, kích hoạt có hiệu quả nguồn enzyme nội tại an toàn có sẵn trong thịt đầu tôm thẻ để thu nhận dịch thủy phân giàu chất dinh dưỡng và hoạt tính chống oxy hóa cao. Đồng thời, luận án đã đưa ra phương pháp kết hợp nhằm tận dụng các ưu điểm của enzyme thương mại dựa trên các thông số tối ưu cho hoạt động của enzyme alcalase và enzyme flavourzyme trên cơ chất thịt đầu tôm thẻ, kết hợp hiệu 2
quả enzyme nội tại và enzyme thương mại trong thủy phân protein của thịt đầu tôm, xây dựng được quy trình cho hoạt động thủy phân protein của tổ hợp enzyme. Sử dụng chế phẩm cô đặc giàu protein và khả năng chống oxy hóa vào một số quy trình chế biến thực phẩm có hiệu quả. Qua đó, luận án đã góp phần định hướng cho việc ứng dụng nguồn phụ phẩm trong quá trình chế biến tôm đông lạnh ở nước ta nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường, nâng cao sức cạnh tranh cũng như giá trị mặt hàng tôm thẻ đông lạnh. Kết cấu của luận án Luận án bao gồm 3 phần: Chương 1: Giới thiệu (3 trang); Phần nội dung gồm 3 chương chính (1) Chương 2: Tổng quan tài liệu (30 trang), (2) Chương 3: Phương pháp nghiên cứu (27 trang với 18 thí nghiệm), (3) Chương 3: Kết quả - Thảo luận (81 trang); Phần Kết luận và đề xuất (2 trang). Trong nội dung chính có 46 bảng và 72 hình. Bài viết sử dụng 255 tài liệu tham khảo, bao gồm 209 tài liệu tiếng Anh, 46 tài liệu tiếng Việt. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tôm thẻ chân trắng và phụ phẩm trong chế biến tôm đông lạnh Tôm thẻ chân trắng Tôm thẻ có tên khoa học là Litopenaeus vannamei, trước đây là Penaeus vannamei (Hernandez et al.,1997). Tên thường dùng là tôm thẻ chân trắng, tôm trắng hoặc tôm trắng Thái Bình Dương. Ở Việt Nam, tôm phân bố ở vịnh Bắc bộ, ven biển miền Trung và Nam bộ. Hiện nay, tôm được nuôi ở nhiều nước trên thế giới như Đài Loan, Trung Quốc, Việt Nam. Thành phần dinh dưỡng Thành phần sinh hóa là thước đo để đánh giá chất lượng dinh dưỡng của các nguồn thực phẩm. Tôm thẻ chân trắng có giá trị dinh dưỡng cao do trong thịt tôm chứa nhiều protein, chất béo thấp cùng với các khoáng chất thiết yếu cho cơ thể như canxi, natri, kali, phosphor. Trong thành phần protein của tôm thẻ chân trắng có tổng số 18 axit amin đã được xác định, trong đó các axit amin thiết yếu bao gồm arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, lysine và valine. Ngoài ra, còn có các axit amin không thiết yếu như alanine, asparagine, aspartic axit, cysteine, glutamic axit, glycine, proline, serine và tyrosine (Gunalan et al., 2013). Trong đó, valine (23,72%) chiếm tỷ lệ tối đa, tiếp theo là lysine (13,42%) có vai trò quan trọng trong việc hấp thu canxi, tạo cơ bắp, phục hồi sau chấn thương, phẫu thuật đồng thời tổng hợp các hóc môn, enzyme và các kháng thể. Methionine (13,06%) có gốc lưu huỳnh giúp trung hòa các gốc tự do làm giảm một số bệnh tật của người già và lão hóa (Hoshi et al., 2001). Ngoài ra, hàm lượng sắt trong tôm thẻ chân trắng có vai trò quan trọng đối với cơ thể giúp ngăn ngừa tình trạng thiếu sắt hoặc mắc các chứng bệnh thiếu máu, mệt mỏi hoặc khó thở. Mặc dù chất béo chiếm tỷ lệ thấp nhưng chủ yếu là các axit béo không no rất tốt cho sức khỏe như eicosapentaenoic axit (EPA, 20:5n-3) và docosahexaenoic axit (DHA, 22:6n-3) ngăn ngừa hình thành các cholesterol (Pedrazzoli et al., 1998). Như vậy, từ các peptit và axit amin thu được thông qua quá trình thủy phân protein có thể dẫn 3
đến sự phát triển của các thực phẩm chức năng có ảnh hưởng tích cực trong việc duy trì sức khoẻ con người. Phụ phẩm tôm thẻ chân trắng trong quá trình chế biến Theo báo cáo tổng kết hàng năm của Tổng cục thủy sản và số liệu của VASEP, cơ cấu xuất khẩu của mặt hàng tôm sú và tôm thẻ trong những năm gần đây có sự thay đổi (Bảng 2.1). Bảng 2.1 Diện tích nuôi và sản lượng tôm sú và thẻ qua các năm Diện tích nuôi (ha) Sản lượng (ngàn tấn) Năm Tôm sú Tôm thẻ Tôm sú Tôm thẻ 2013 601,0 65,0 268,0 273,0 2014 602,5 106,0 264,0 395,0 2015 603,0 89,6 268,3 327,0 2016 600.4 94,2 260.0 390,0 2017 595,8 101,1 270,5 430,5 Nguồn: https://tongcucthuysan.gov.vn; http://www.vasep.com.vn Sản lượng tôm thẻ chân trắng tăng vượt bậc theo từng năm, sản lượng tăng đồng nghĩa với sản lượng phụ phẩm từ tôm thẻ ngày càng gia tăng. Với thành phần đầu tôm chiếm khoảng 25-30% khối lượng nguyên liệu nên hàng năm có khoảng trên 100 ngàn tấn đầu tôm thẻ được loại ra trong quá trình chế biến tôm thẻ đông lạnh. Trong thịt đầu tôm thẻ, hàm lượng protein chiếm khoảng 47,4% (Ngô Thị Hoài Dương, 2015), rõ ràng đây là nguồn nguyên liệu quan trọng để thu hồi protein. Ứng dụng phụ phẩm trong sản xuất Trong thập kỷ qua, xu hướng tận dụng phụ phẩm tôm để thu hồi protein làm tăng giá trị của các thành phần trong phụ phẩm đã và đang được các nhà khoa học trong cũng như ngoài nước quan tâm. Phụ phẩm từ tôm được sử dụng để phát triển các sản phẩm chất lượng cao có thể sử dụng làm thức ăn cho con người hoặc thậm chí để tạo ra các thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng. Đặc biệt, phụ phẩm từ tôm được nghiên cứu khả năng sản xuất các oligopeptit và các axit amin có chức năng chống oxy hóa, hạn chế tăng huyết áp, kháng khuẩn,... 2.1.4.1 Trong lĩnh vực thực phẩm Đối với lĩnh vực thực phẩm, Khan and Nowsad (2012) cũng đã sử dụng bột tôm thu được từ phụ phẩm tôm đem sấy khô và nghiền mịn để bổ sung vào bánh cracker, phát triển sản phẩm giàu protein từ phụ phẩm. Karnataka (2011) sử dụng các phụ phẩm để sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng giàu protein với 3 sản phẩm chính đó là súp tôm (prawn soup), bánh quy tôm lạt (prawn chilly biscuits) và bánh quy tôm mặn (prawn salt biscuits). Với phần thịt từ đầu tôm sú chiếm khoảng 15% khối lượng đầu tôm nguyên liệu (Nguyễn Văn Mười và ctv., 2013), tận dụng thịt đầu tôm giàu protein được tách ra từ đầu tôm, kết hợp với thịt tôm thứ phẩm theo tỷ lệ 30% thịt đầu đầu tôm và 70% thịt tôm thứ phẩm đã tạo được khối paste có cấu trúc không khác biệt so với paste được chế biến từ tôm thịt thứ phẩm trong quá trình chế biến xúc xích. Nghiên cứu này đã mở ra hướng mới trong việc nâng cao giá trị thương phẩm của tôm, đa dạng các sản phẩm chế biến từ tôm. Ngoài ra, Nguyễn Văn Mười và ctv. (2014) đã nghiên cứu chế biến và bảo quản bột thịt đầu tôm sú tạo tiền đề sử 4
dụng bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm khác. Dịch ép tách protein từ đầu tôm thẻ (Penaeus vannamei) trong sản xuất chitin được, bổ sung vào chượp lên men trong sản xuất nước mắm (Nguyễn Minh Trí và ctv. (2009). 2.1.4.2 Trong lĩnh vực thức ăn chăn nuôi Tận dụng phụ phẩm tôm sau quá trình chế biến làm thức ăn cho vật nuôi đã được thực hiện từ rất lâu, đây là sản phẩm chính của đầu tôm sau quá trình thu hồi chitin và chitosan. Protein thu hồi theo hình thức thủy phân có thể được sử dụng như là chất mùi, điển hình Randriamahatody et al. (2011) thủy phân các phụ phẩm tôm từ Madagascar. Patcharee and Nongnuch (1995) sản xuất các sản phẩm mùi từ đầu tôm, sản phẩm thu được đưa vào các loại thực phẩm có nguồn gốc từ cá, thức ăn cho nuôi trồng thuỷ sản hoặc nguồn nitơ trong môi trường cho sự phát triển của các vi sinh vật (Cavalheiro et al., 2007) và thức ăn gia súc (Coward - Kelly et al., 2006). 2.1.4.3 Trong lĩnh vực dược Sản phẩm sau thủy phân của đầu tôm là nguồn peptit có hoạt tính sinh học mang đến tiềm năng đáng kể trong dược phẩm (Gildberg and Stenberg, 2001). He et al. (2006) nghiên cứu khả năng sản xuất các thành phần thực phẩm chức năng thông qua chức năng ức chế hoạt động của enzyme chuyển đổi angiotensin-I (angiotensin- I-converting enzyme, ACE) và hoạt động chống oxy hóa trong dịch thủy phân oligopeptit làm giàu từ Acetes chinensis. Dịch thu hồi sau thủy phân được chứng minh có hoạt tính sinh học rất cao, có khả năng chống oxy hóa, khả năng kiểm soát enzyme gây cao huyết áp (Dey and Dora, 2014a; Ganugula et al., 2008). Gần đây một số nhà nghiên cứu đã thu được phức hợp carotenoid-protein từ đầu tôm và sử dụng như nguồn carotenoids và sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh nhằm thu được thành phần antimutagenic, có khả năng chống đột biến gen gây ung thư (Babu et al., 2008; Wilson-Sanchez et al., 2010; López-Saiz et al.,2016). Tổng quan về protease Enzyme là chất xúc tác sinh học có khả năng đẩy nhanh tiến độ các phản ứng hóa học và là công cụ hỗ trợ giúp nâng cao chất lượng thực phẩm cũng như hiệu suất chế biến. Trong số các enzyme được sử dụng trong chế biến thực phẩm, enzyme thủy phân chiếm tỷ lệ lớn nhất (Rao et al., 1998), khoảng 97% doanh số enzyme công nghiệp toàn cầu (Haard and Simpson, 2000). Trong đó, protease là enzyme thủy phân có giá trị thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% tổng giá trị thương mại enzyme công nghiệp được cung cấp trên thị trường thế giới với nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm đặc biệt trong y học hiện đại (Joo and Chang, 2006; Tunga et al., 2003). Sử dụng enzyme thủy phân như một tác nhân hỗ trợ dựa trên một số ưu điểm hơn so với sử dụng hóa chất, trong đó có độ đặc hiệu cao, hiệu quả của xúc tác ở nhiệt độ vừa phải và thân thiện với môi trường. Hệ enzyme protease trong thủy sản Hệ enzyme protease trên đầu tôm bao gồm cả endoprotease và exoprotease nhưng thành phần và điều kiện hoạt động của chúng thay đổi theo giống loài, độ tuổi và khu vực sinh sống. Các protease tìm thấy trong tôm bao gồm carboxypeptidases A và B, trypsin, chymotrypsin, cathepsin, và collagenase (Honjo 5
et al., 1990; Liu et al, 1999; Roy et al., 1996; Tsai et al., 1986; Worrnhoudt et al., 1992). Hệ enzyme nội tại của tôm thẻ Ấn Độ (Penaeus indicus) hoạt động ở khoảng pH thích hợp dao động từ 7,2 đến 8,5; trong đó trypsin là 7,5 - 8,0; chymotrypsin là 7,2 - 7,8 và elastase là 6,8 – 8,5. Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsine hoặc protease serine dạng trypsine và có khả năng hoạt động rất cao (Omondi, 2005). Hệ protease trên đầu tôm thẻ Trachypena curvirostris có hoạt lực tương đương một số protease thương mại, tuy nhiên chúng rất dễ bị tổn thất theo lượng protein hòa tan. Đặc biệt, enzyme nội tại trong động vật là chất hữu cơ không bền, chúng dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài, dễ bị hư hỏng khi bảo quản. Hơn thế nữa, enzyme là protein và protein enzyme luôn đi cùng những loại protein không phải enzyme nhưng lại có tính chất hóa lý rất giống protein enzyme. Do đó, việc tách protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp những khó khăn nhất định. Enzyme thương mại Hiện nay, nhiều protease thương mại từ động vật, thực vật và các nguồn vi sinh vật đã được sử dụng để sản xuất các peptide chống oxy hóa như alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, neutrase, protamex, flavourzyme. Trong các loại enzyme alcalase và flavourzyme được sử dụng có hiệu quả tốt trên cơ chất protein của tôm (Chakrabarti, 2002; Dey and Dora, 2014a). Việc xác định loại enzyme được sử dụng trong quá trình thủy phân protein rất quan trọng vì chúng quyết định các mẫu phân cắt của liên kết peptit, ảnh hưởng đến kích thước, số lượng và thành phần axit amin của các peptide, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của các chất thủy phân. Các nghiên cứu có liên quan Nghiên cứu ngoài nước Xu hướng sử dụng phụ phẩm tôm để chiết tách enzyme protease hay thu hồi protein làm tăng giá trị của các thành phần trong phụ phẩm đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm thực hiện. Cavalheiro et al. (2007) nghiên cứu thu hồi protein theo hình thức thủy phân có thể được sử dụng làm chất mùi và bổ sung vào các loại sản phẩm thức ăn có nguồn gốc từ cá, thức ăn cho nuôi trồng thuỷ sản hoặc nguồn nitơ trong môi trường cho sự phát triển của các vi sinh vật; Gildberg and Stenberg (2001) thu hồi sản phẩm thủy phân là nguồn peptit có hoạt tính sinh học mang đến tiềm năng đáng kể trong dược phẩm; Synowiecki and Khateeb (2000) tiến hành nghiên cứu nhằm tạo ra các sản phẩm giá trị gia tăng từ những phụ phẩm trong chế biến tôm, bao gồm cả việc chiết xuất chitin; Coward- Kelly et al. (2006) thủy phân protein để sử dụng trong thực phẩm và thức ăn gia súc; (He et al., 2006) nghiên cứu khả năng sản xuất các thành phần thực phẩm chức năng thông qua quá trình thủy phân phụ phẩm và phế liệu tôm cũng đã được đề xuất bởi các báo cáo nghiên cứu gần đây về ức chế hoạt động của enzyme chuyển đổi angiotensin-I (angiotensin-I-converting enzyme, ACE) và hoạt động chống oxy hóa trong thủy phân oligopeptit làm giàu từ Acetes chinensis, một loài tôm ít sử dụng; Karnataka (2011) sử dụng các phụ phẩm để sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng; Randriamahatody et al. (2011) thủy phân các phụ phẩm tôm từ Madagascar; Patcharee and Nongnuch (1995) sản xuất các sản phẩm mùi từ đầu tôm. Nghiên cứu 6
gần đây của Randriamahatody et al. (2011) khi thủy phân tôm bởi enzyme protease thương mại có tính kiềm hoặc axit thành phần thu được chủ yếu là các phân tử peptit nhỏ, trên 80% có khối lượng phân tử dưới 1.000 Da, ngoài ra còn xác định chi tiết có 14÷15 axit amin; Zhao et al. (2011) sử dụng enzyme alcalase thủy phân tôm đã thu được 18 axit amin, trong đó có hầu hết các các axit amin cần thiết (trừ Triptophane) mà cơ thể không tự tổng hợp được. Trong điều kiện hoạt động tối ưu enzyme alcalase như: pH 8,2, nhiệt độ 45,4°C và tỉ lệ enzyme/cơ chất (E/S) là 1,8% tạo ra sản phẩm có DH, DPPH và FRAP (ferric reducing antioxidant power) lần lượt là 40,31%, 38,93% và 8,21 μM Fe (II)/g, cho thấy phụ phẩm đầu tôm (Metapenaeus dobsoni) là một nguồn protein cho quá trình sản xuất ra các peptit và axit amin có hoạt tính chống oxy hóa tiềm năng (Gunasekaran et al., 2015). Latorres et al. (2017) đã nghiên cứu thủy phân tôm thẻ chân trắng bằng enzyme alcalase 2,4 L và protamex tạo ra các axit amin như axit glutamic, axit aspartic, arginine, glycine, lysine, proline có nồng độ cao nhất. Ứng dụng các hoạt tính sinh học này để chế biến thực phẩm chức năng cũng như chất chống oxy hóa tự nhiên trong hệ thống thực phẩm giàu béo là hướng đi triển vọng trong tương lai. Nghiên cứu trong nước Các nghiên cứu sử dụng enzyme để thu hồi đạm ứng dụng vào sản xuất nước mắm, nước tương (Trần Thị Luyến, 2000) đến các nghiên cứu thủy phân đạm với mục tiêu xử lý chất thải hay làm công đoạn tiền xử lý nguyên liệu cho quá trình chế biến tiếp theo. Ngô Thị Hoài Dương và ctv. (2008) đã nghiên cứu đưa ra giải pháp tiền xử lý bằng axit formic trong quy trình sản xuất chitosan từ đầu tôm nhằm giảm thiểu lượng hóa chất và chất thải gây ô nhiễm môi trường. Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) đã nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu vỏ tôm bằng các phương pháp sinh học (sử dụng bromelanin trong dịch ép vỏ dứa); Phan Thị Bích Trâm và Phạm Thu Cúc (2004) xử lý vỏ đầu tôm với rỉ đường và enzyme dùng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm. Trịnh Ngọc Vinh (2006) tiến hành ủ chua đầu vỏ tôm có thêm vi khuẩn Lactobacillus spp giúp quá trình lên men được nhanh hơn, tạo ra sản phẩm thức ăn gia súc có chất lượng cao hơn, có tính phổ biến rộng rãi, giá trị kinh tế cao và giảm thiểu việc gây ô nhiễm môi trường. Bùi Xuân Đông và Phạm Thị Mỹ (2017) tiến hành nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân từ vỏ đầu tôm bằng enzyme alcalase ứng với nhiệt độ môi trường, pH môi trường, tỷ lệ enzyme và cơ chất, thời gian phản ứng enzyme lần lượt là 55oC; 8; 1,5% và thời gian 80 phút thu được hiệu suất thu hồi đạm là 61,28±0,5% được tận dụng làm thức ăn chăn nuôi. Với phần thịt từ đầu tôm sú chiếm khoảng 15% khối lượng đầu tôm nguyên, khi bổ sung với thịt tôm thứ phẩm theo tỷ lệ 30% thịt đầu và 70% thịt tôm thứ phẩm tạo được khối paste có cấu trúc không khác biệt so với paste được chế biến từ tôm thịt thứ phẩm (Nguyễn Văn Mười và ctv., 2013). Tận dụng nguồn protein này trong chế biến thực phẩm đã mở ra hướng mới trong việc nâng cao giá trị thương phẩm của tôm sú ở đồng bằng sông Cửu Long. Nguyễn Văn Mười và ctv. (2014) đã nghiên cứu chế biến và bảo quản bột thịt đầu tôm sú. Một nghiên cứu tận thu chế phẩm enzyme protease và ứng dụng nó thủy phân hai đối tượng cũng là phế liệu chế biến thủy sản là hỗn hợp máu, gan cá basa và đầu, vỏ tôm (Nguyễn Lệ Hà, 2011), Trần Thanh Trúc và ctv. (2015) 7
thu được sản phẩm dịch thủy phân thịt đầu tôm sú bằng enzyme thương mại alcalase đã xác định được 14 axit amin. Điểm qua tình hình nghiên cứu thực tế hiện nay, có thể thấy rằng việc thu hồi protein từ phụ phẩm tôm thẻ chân trắng để tạo ra chế phẩm dịch protein thủy phân có cả giá trị dinh dưỡng và chức năng sinh học là khả thi. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện nghiên cứu Địa điểm, thời gian Tiến hành thí nghiệm và thu nhận số liệu cho luận án được thực hiện từ tháng 11/2014 đến tháng 11/2017 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ và các phòng thí nghiệm có liên quan. Thiết bị, hoá chất Dụng cụ - thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu: máy quang phổ so màu (Model 722, Trung Quốc); thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp (Rotana 46 R, Đức; Herlme Z323K); máy đo pH 2 số lẻ, độ chính xác 0,01 (HANA pH 212, Trung Quốc); máy khuấy từ Toshiba (Magnestir MG-10, Nhật); bộ điều nhiệt (Memmert, Đức, điều chỉnh đến cận 100°C, độ chính xác 0,1°C)… Hóa chất: Na2HPO4, NaH2PO4 (Merck, Đức); Tyrosine; Trichloacetic axit (TCA); Folin; casein dạng bột (Merck, Đức); DPPH (2,2 –Diphenyl–1– picrylhydrazyl) (Merck, Đức),... Phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Nguyên liệu thịt đầu tôm thẻ được phân tách tại nhà máy Chế biến thủy sản xuất nhập khẩu Hòa Trung (huyện Cái Nước, tỉnh Cà Mau), bảo đảm mẫu được giữ lạnh ở nhiệt độ dưới 4ºC và thời gian tối đa 2 giờ từ công đoạn tách đầu đến khi thu nhận thịt đầu tôm. Sau đó, cấp đông ở nhiệt độ -35°C đến -40°C, sau khi đạt nhiệt độ tâm -18°C thì tiến hành trữ đông. Phương pháp trích ly và tinh sạch sơ bộ Sau khi nghiền, mẫu được cân định lượng rồi tiến hành trích ly bằng dung môi glycine-NaOH pH 9,0; nhiệt độ 50°C với tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 4 (w/v) trong thời gian 40 phút để rút chiết enzyme (Trần Thanh Trúc và ctv., 2014). Quá trình trích ly enzyme được thực hiện bằng máy khuấy từ liên tục với tốc độ 200 rpm nhằm làm tăng khả năng trích ly. Sau quá trình trích ly, mẫu được ly tâm ở tốc độ 6.000 rpm trong thời gian 20 phút, sau đó loại bỏ phần cặn, thu nhận phần dịch trong, gọi là dịch chiết enzyme protease thô (Castillo-Yaneza et al., 2004). Tiến hành kết tủa bằng ethanol 99,5% và được làm lạnh đến nhiệt độ -18°C, tỷ lệ giữa dịch trích protease thô và dung môi ethanol sử dụng tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa là 1:3 (v/v), lắc nhẹ và để ổn định ở 0 ÷ 4°C trong thời gian 30 phút (Hà Thị Thụy Vy và ctv., 2016). Sau khi kết tủa, hỗn hợp được ly tâm 6.000 rpm trong 20 phút ở 4°C, thu được phần kết tủa. Phần kết tủa được hòa tan bằng dung dịch đệm phosphate pH 7,6; nhiệt độ 30 C, với thể tích dung dịch đệm bổ sung vào tủa sao 8
cho bằng thể tích dịch trích sử dụng để kết tủa (Trần Thanh Trúc và ctv., 2014). Xác định hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch sơ bộ. Phương pháp thủy phân Sau khi nghiền, mẫu được cân định lượng rồi tiến hành thủy phân bằng dung môi là nước với tỷ lệ 1:1. Nhiệt độ, pH, nồng độ và thời gian thủy phân bằng enzyme alcalase/enzyme flavourzyme được điều chỉnh tùy theo điều kiện khảo sát. Quá trình thủy phân được thực hiện bằng máy khuấy từ liên tục, tốc độ 200 rpm nhằm tăng khả năng thủy phân. Sau quá trình thủy phân, mẫu được ly tâm ở tốc độ 6.000 rpm trong thời gian 20 phút, loại bỏ phần cặn, thu nhận phần dịch trong, gọi là dịch thủy phân protein. Tiến hành xác định mức độ thủy phân (DH%) và hoạt tính chống oxy hóa (DPPH%) nhằm chọn được điều kiện thủy phân protein từ thịt đầu tôm tốt nhất Phương pháp phân tích Các phương pháp phân tích được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1 Phương pháp phân tích STT Chỉ tiêu Phương pháp 1 Độ ẩm (%) Phương pháp NMKL số 57-1994 2 Protein tổng số (%) Kjeldahl method, FAO, 14/7, 1986, p221 3 Lipit tổng số (%) Soxhlet method FAO, 14/7, 1986, p212 4 Chỉ số peroxide TCVN 6127:2010 5 Hàm lượng protein hòa tan Xác định bằng phương pháp Bradford (Bradford, 1990). (mg/kg) 6 Hoạt tính protease (UI/g) Phương pháp Anson cải tiến (Anson, 1938) 7 Hiệu suất thủy phân (%) Phương pháp OPA ((Nielsen, et al, 2001) 8 Hàm lượng N-NH3 Xác định hàm lượng nitơ base bay hơi sử dụng hệ thống chưng cất với chất kiềm hóa là MgO (AOAC 973.46, 1990) 9 Khả năng loại bỏ gốc tự do Phương pháp so màu hình thành từ phản ứng với dung dịch (%) và IC50 DPPH trong methanol (Zhao et al., 2011). 10 Màu (L*, a*, b*) Đo bằng thiết bị đo màu NH300 (Trung Quốc) với hệ màu CIE bằng đèn D65 11 Cảm quan Phương pháp phân tích mô tả định lượng QDA (Stone et al, 1974) với các thuộc tính tham khảo dựa trên TCVN 5277:1990 và TCVN 5090: 90. 12 Chỉ tiêu vi sinh QCVN: 8-3:2012/BYT (Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm) 13 Xác định axit amin Chromatography AB55 (1999) Phương pháp xử lý số liệu Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một, hai hoặc ba nhân tố và được lặp lại ba lần. Kết quả tối ưu của thí nghiệm trước được sử dụng cho thí nghiệm kế tiếp. thí nghiệm được phân tích và thống kê sử dụng chương trình Statgraphics Centrution 16.1; phần mềm Prism 5.0 và Microsoft Excel 2007. Số liệu được phân tích Statgraphics Centrution 16.1phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết luận sự khác biệt giữa trung bình các nghiệm thức. 9
Nội dung ngiên cứu Thí nghiệm được khảo sát với 5 nội dung chính theo sơ đồ tổng hợp ở hình 3.1. Tôm thẻ chân trắng Lạnh đông Thân tôm Xử lý Vỏ tôm Xuất khẩu Đầu tôm thẻ Vỏ đầu tôm Sản xuất chitosan Thịt đầu tôm thẻ (Xác định thành phần hóa lý) Trữ đông (Thí nghiệm 1) Trích ly và tinh sạch Vô hoạt enzyme Nội dung 2: Kích hoạt sơ bộ protease nội tại protease nội tại (Tối ưu Nội dung 3: Xác định điều kiện thủy điều kiện tiền xử lý) phân tối ưu bằng protease ngoại bào Nội dung 1: Xác định tính chất protease nội tại Thủy phân protein (Thí nghiệm 4 -5) (Thí nghiệm 2 -3) Flavourzyme Alcalase (Thí nghiệm 6-8) (Thí nghiệm 9-11) Nội dung 4: Xây dựng quy trình chế biến chế Tối ưu điều kiện kết hợp 2 phẩm protein thủy phân và đánh giá khả năng bảo enzyme ngoại bào (Thí quản sản phẩm (Tối ưu điều kiện thủy phân bằng nghiệm 12 -13) enzyme nội tại + ngoại bào) (Thí nghiệm 14) Dịch thủy phân Cô đặc (Thí nghiệm 15) Bảo quản Nội dung 5: Ứng dụng chế phẩm dịch protein (Thí nghiệm 16) thủy phân trong sản xuất thực phẩm Khô cá lóc Nước mắm Tỷ lệ chế phẩm bổ sung (Thí nghiệm 18) Tỷ lệ chế phẩm bổ sung (Thí nghiệm 17) Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 10
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tính chất của nguyên liệu và khả năng trữ đông thịt đầu tôm Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm thẻ chân trắng Các thông số hoá lý chính và hoạt tính protease nội tại của nguyên liệu được thể hiện ở Bảng 4.1. Bảng 4.1 Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm Thành phần Giá trị Độ ẩm (% 83,24±0,68 pH 7,78±0,02 Protein tổng (%) 12,80±0,25 Hoạt tính protease (UI/g CKNL*) 0,82±0,09 *CKNL: chất khô nguyên liệu Kết quả từ Bảng 4.1 cho thấy, hàm lượng protein tổng số khá cao và hoạt tính của enzyme nội tại mạnh là điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân thu hồi chế phẩm dịch protein thủy phân. Tuy nhiên, hàm lượng protein cao và pH hơi kiềm là điều kiện thích hợp cho vi sinh vật gây hư hỏng phát triển, làm tăng sự phân giải protein và làm giảm hoạt tính sinh học. Khả năng trữ đông thịt đầu tôm đến sự ổn định của hiệu quả thủy phân protein bằng protease nội tại Sự thay đổi hiệu suất thủy phân và hoạt tính protease theo thời gian bảo quản lạnh đông thịt đầu tôm được thể hiện ở Hình 4.1. Kết quả cho thấy hoạt tính enzyme protease trong đầu tôm ổn định ở điều kiện lạnh đông từ tuần 1 đến tuần 6, dao động từ 0,85÷0,89 UI/gCKNL và không có khác biệt ý nghĩa thống kê. Từ tuần thứ 7 đến tuần thứ 9, hoạt tính enzyme nội tại bất đầu giảm (0,73 UI/gCKNL). Sự ổn định hoạt tính enzyme protease trong 6 tuần là điều kiện thuận lợi cho quá trình kích hoạt hoạt động enzyme nội tại để thủy phân protein. Hình 4.1 Hiệu suất thủy phân protein và hoạt tính enzyme protease nội tại theo thời gian bảo quản 11
Đặc điểm của enzyme protease nội tại Độ bền nhiệt Nhiệt độ cao thường được sử dụng trong các quá trình chế biến thực phẩm nhưng lại là nguyên nhân gây bất hoạt enzyme, ngay cả protease, vì thế ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng enzyme này. Do vậy, bên cạnh việc xác định nhiệt độ hoạt động tối ưu thì độ bền nhiệt của protease cũng là kênh thông tin không kém phần quan trọng trong việc ứng dụng enzyme này vào thực tiễn (Sajjaanantakul and Pitifer, 1991). Kết quả từ đồ thị ở Hình 4.2 cho thấy mức độ vô hoạt nhiệt enzyme protease từ thịt đầu tôm thẻ phụ thuộc lớn vào nhiệt độ xử lý. Quá trình xử lý nhiệt càng cao thì enzyme bị vô hoạt càng nhiều. Hình 4.2 Độ bền nhiệt của enzyme protease thịt đầu tôm thẻ sau tinh sạch sơ bộ Tốc độ vô hoạt nhiệt tăng khi nhiệt độ xử lý tăng từ 55 đến 70 °C. Khi tăng nhiệt độ lên 55 °C hoạt tính enzyme giảm chỉ còn 92,47% so với hoạt tính ban đầu và giảm đáng kể ở nhiệt độ 65÷75 °C và gần như hoàn toàn mất hoạt tính ở 80 °C chỉ còn 7,44% so với hoạt tính ban đầu. Động học Km và Vmax Bên cạnh nhiệt độ, pH thì hằng số tốc độ phản ứng Km và tốc độ phản ứng cực đại Vmax là hai thông số đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Cố định các yếu tố hóa học và vật lý có thể tác động đến phản ứng enzyme thì tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Giá trị Vmax có vai trò quan trọng trong việc lựa chọn nồng độ enzyme và cơ chất thích hợp trong các quá trình ứng dụng. Các thông số động học Km, Vmax được xác định theo phương pháp Lineweaver – Burk (1934) bằng cách lập đồ thị 1/V = f(1/[S]), dựa trên các giá trị nghịch đảo 1/V và 1/[S] được thể hiện trong Hình 4.3. Thông qua phương trình Lineweaver-Burk y = 0,0068.x + 0,0855 (R2 = 0,9885) hay 1/v = 0,0068(1/[S]) + 0,0855 Giá trị Km và Vmax của protease khảo sát được xác định: 1/Vmax = 0,0855; Km/Vmax = 0,0068 12
Hình 4.3 Phương trình Lineweaer- Burk của protease trên cơ chất thịt đầu tôm Như vậy, enzyme protease nội tại từ thịt đầu tôm thẻ có giá trị Vmax đạt 11,70 11,70 µM/phút và Km là 0,0795 g/mL. Giá trị Km là hằng số Michaelis-Menten đặc trưng cho ái lực giữa enzyme và cơ chất, giá trị Km càng nhỏ cho thấy ái lực giữa enzyme và cơ chất càng lớn nên tốc độ xúc tác enzyme càng cao và ngược lại. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả thủy phân protein của thịt đầu tôm bằng việc sử dụng protease nội tại Tối ưu hóa quá trình kích hoạt enzyme protease nội tại Dựa trên các thông số động học thu nhận được ở mục 4.2 cho thấy, các nhân tố nhiệt độ có sự chi phối đáng kể đến hoạt động của enzyme protease, điều này có thể là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến việc thay đổi hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ. Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của Hà Thị Thụy Vy và ctv. (2018) cho thấy, hoạt tính enzyme protease có giá trị thay đổi theo các giá trị pH đã khảo sát và hoạt tính cao ở khoảng pH 7-8. Điều kiện hoạt động (X1: nhiệt độ kích hoạt (oC) X2: pH và X3: thời gian kích hoạt (phút)) tối ưu của quá trình tiền xử lý với 3 hàm mục tiêu Y1 - Hiệu suất thủy phân (DH (%); Y2 - Hoạt tính chống oxy hóa (DPPH (%)) và Y3 - IC50 (mg/100 ml), thu được các phương trình hồi qui (1), (2) và (3): Y1 = -396,63 + 3,39X1 + 75,7535X2 + 38,0091X3 – 0,0291308X1^2 – 0,122X1X2 + 0,2135X1X3 – 3,96075 X2^2 – 3,61333X2X3- 3,3255 X3^2 (1), R2 = 98,1994% Y2 = -393,75 + 3,45189X1 + 75,3786X2 + 35,2798X3 - 0,0259798 X1^2 - 0,185847X1X2 + 0,215676X1X3 - 3,510044X2^2 - 3,91411X2X3- 2,72794 X3^2 (2), R2 = 96,2364% Y3 = 399,614 - 2,98549X1- 66,8268X2 - 37,4297X3 + 0,0209468X1^2 + 0,160796X1X2 - 0,129854X1X3 + 3,03517X2^2 + 4,16763X2X3 + 2,19321X2^2 Bảng 4.2 Kết quả tối ưu hóa điều kiện đáp ứng 3 hàm mục tiêu Y1, Y2 và Y3 Nhân Chế độ Chế độ tối ưu Giá trị tối ưu tố Thấp Cao Y1 Y2 Y3 Y1 Y2 Y3 X1 43.2 76.8 57.5 55.3 55.33 X2 5.3 8.8 6.95 7.2 7.17 36.03 30.41 13.28 X3 2.3 5.7 3.78 3.5 3.51 Giá trị tối ưu cao nhất của từng hàm mục tiêu (hiệu suất thủy phân, hoạt tính chống oxy hóa và giá trị IC50) đạt được của quá trình tiền xử lý enzyme nội tại thể 13
hiện Bảng 4.2. Để dịch thủy phân đáp ứng cả 3 hàm mục tiêu, kết quả phân tích thống kê thể hiện qua Hình 4.4 và Bảng 4.3. Hình 4.4 Tương tác của nhiệt độ, pH và thời gian kích hoạt đến cả 3 hàm mục tiêu Bảng 4.3 Kết quả tối ưu hóa điều kiện thủy phân đáp ứng 3 mục tiêu Y1, Y2 và Y3 Chế độ: Chế độ Giá trị tối ưu Nhân tố Thấp Cao tối ưu Y1 Y2 Y3 X1 43,18 76,82 56,19 X2 5,32 8,68 7,04 36,00 30,39 14,61 X3 2,32 5,68 3,62 Kết quả thực nghiệm phù hợp tốt với các giá trị dự đoán theo phương trình. Thông số tối ưu cho tiền xử lý nguyên liệu là nhiệt độ 56,19°C; thời gian 3,62 phút ở pH 7,04. Xác định hiệu suất thủy phân của protease nội tại theo thời gian Từ kết quả thể hiện ở Bảng 4.4 cho thấy hiệu suất thủy phân tăng (2,69÷43,07%) khi tăng thời gian thủy phân từ 0 đến 8 giờ, hiệu suất thủy phân tăng nhanh ở giai đoạn đầu của quá trình thủy phân và tăng chậm sau 6 giờ của quá trình thủy phân. Hàm lượng protein hòa tan thu nhận được cũng gia tăng theo thời gian thủy phân từ 0÷6 giờ đầu và giảm ở các thời gian thủy phân kế tiếp (Bảng 4.4). Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi dịch thủy phân Thời Hiệu suất Hoạt tính Protein Hàm lượng IC50 (mg/ gian thủy phân, chống oxy hòa tan, NH3, 100 mL) (giờ) %DH hóa, g/100g mg/100g %DPPH(*) CKNL 0 2,69a±0,73 16,66a±0,20 2,90a±0,78 7,93a±0,60 27,62a±0,33 1 13,61b±1,22 19,87b±0,24 14,67b±1,31 10,75b±0,49 23,16b±0,27 2 18,55c±1,40 22,58c±0,17 19,67c±1,53 14,33c±1,04 20,37c±0,15 3 24,24d±1,09 26,56d±0,34 26,14d±1,18 17,50d±0,55 17,32d±0,16 4 36,08e±0,81 26,37d±0,37 38,89f±0,87 22,97e±0,74 17,45d±0,23 5 38,81f±0,55 31,48e±0,37 41,84g±0,60 24,78f±0,57 14,62e±0,17 6 41,12g±0,63 34,46g±0,03 44,33h±0,98 30,08g±0,88 13,35g±0,01 7 41,48gh±1,34 32,52f±0,37f 33,72e±1,18 36,65h±0,39 14,15f±0,16f 8 43,07h±0,40 31,33e±0,41 26,76d±0,91 44,60i±1,18 14,69e±0,19 Hàm lượng protein hòa tan đạt giá trị cao nhất sau 6 giờ thủy phân (44,33 mg/100 g) và hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân thu được là 34,46%. Về phương 14
diện cảm quan, với thời gian thủy phân 6 giờ, dịch thủy phân chưa có mùi lạ nhưng nếu tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân mặc dù hiệu suất thủy phân vẫn tăng nhưng dịch thủy phân có mùi hôi và xuất hiện bọt khí. Điều kiện thủy phân protein từ thịt đầu tôm bằng enzyme protease ngoại bào (alcalase, flavourzyme) phù hợp Điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme alcalase đến hiệu quả thủy phân protein 4.4.1.1 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ Dựa trên các khảo sát trước về tác động riêng lẻ của từng yếu tố nhiệt độ, pH và thời gian đến khả năng thủy phân của enzyme alcalase cho thấy, các nhân tố này đều có sự chi phối đáng kể đến hoạt động của enzyme alcalase. Điều này có thể là nguyên nhân chính có ảnh hưởng đến việc thay đổi hiệu quả quá trình thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ. Trong số các enzyme alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, neutrase, protamex, flavourzyme,…thì alcalase cho hiệu quả thủy phân protein tốt nhất (Chakrabarti, 2002; Dey and Dora, 2014a). Các thông số tối ưu nhiệt độ và pH để enzyme alcalase thủy phân protein trên đầu tôm thẻ có giá trị X4 trong khoảng từ 0 ÷ 1 (50 ÷ 70 C) và X5 -pH (7,5÷8,5). Dựa trên kết quả phân tích ANOVA, phương trình hồi qui thể hiện sự tương quan của điều kiện thủy phân đến hiệu suất thuỷ phân được thiết lập và sử dụng để dự đoán hiệu quả việc thuỷ phân protein. Hàm mục tiêu Y4 – %DH, Y5 - % DPPH và Y6 – IC50 của quá trình thủy phân bằng enzyme alcalase được xác định bằng cách thay các biến với giá trị thực vào phương trình sau: Y4- DH (%) = -552,328 + 8,00772X4 + 90,7747X5 – 0,0595288X4^2 – 0,127144 X4 X5 – 5,41016 X5^2 (4) Y5-DPPH (%) = -511,237 + 5,60728X4 + 97,6543X5 – 0,0458047X4^2 – 0,0339033X4X5 – 6,28411X5^2 (5) Y6 - IC50 (mg/100ml) = 803,496 - 8,28489 X4 - 142,168 X5 + 0,0690832X4^2 + 0,0354187 X4X5 + 9,13448 X5^2 (6) Giải phương trình (4) (5) và (6) cho giá trị tối ưu đối với DH (%); DPPH(%) và IC50. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.5 và Hình 4.3. Hình 4.3 Tương tác của nhiệt độ và pH đến ba hàm mục tiêu Y4, Y5 và Y6 15
Bảng 4.5 Kết quả tối ưu hóa điều kiện thủy phân đáp ứng 3 mục tiêu Y4, Y5 và Y6 Chế độ Chế độ Giá trị tối ưu: Nhân tố Thấp Cao tối ưu Y4 Y5 Y6 X4 6,5 8,5 7,67 33,27 24,14 18,07 X5 50,0 70,0 57,99 Hiệu suất thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa của quá trình thủy phân protein bằng enzyme alcalase đạt được ở điều kiện pH và nhiệt độ tốt nhất là 33,33% và 24,15%. Kết quả thu được phù hợp với kết quả của Dey and Dora (2014a) khi sử dụng mô hình bề mặt đáp ứng RMS để tối ưu hóa điều kiện thủy phân phụ phẩm tôm thẻ chân trắng bằng enzyme alcalase thương mại, hiệu suất thủy phân đạt 33,13% ở nhiệt độ 59,37 oC và pH 8,25. Huang et al. (2011) khi tiến hành thủy phân protein từ phụ phẩm tôm bằng enzyme alcalase ở điều kiện pH 8, nhiệt độ 50oC đạt giá trị IC50 là 500 μg/mL. 4.4.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alcalase Kết quả thống kê được trình bày ở Bảng 4.6. Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alcalase (UI/g) đến hiệu suất thủy phân, hoạt tính chống oxy hóa và IC50 Hiệu suất Nồng độ enzyme alcalase thủy phân Hoạt tính chống oxy IC50, (UI/g) DH (%) hóa DPPH (%) (*) (mg/100mL) Đối chứng 21,67a±0,94 16,32a±0,33 18,20a±0,57 10 33,59b±0,24 23,81b±0,73 19,33b±0,60 20 35,05c±0,11 32,72c±0,39 14,07c±0,17 30 33,46b±0,29 32,66c±0,87 14,10c±0,39 40 33,33b±0,35 32,06c±0,99 14,36c±0,44 50 33,23b±1,09 31,61c±1,39 14,57c±0,65 Kết quả cho thấy, sử dụng nồng độ enzyme alcalase 20 UI/g là điều kiện thích hợp để đạt hiệu suất thủy phân cao (37,6%) và hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân tốt (31,57%). 4.4.1.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Thời gian thủy phân protein từ đầu tôm bằng enzyme alcalase cũng được thể hiện ở Hình 4.4 Hình 4.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân protein bằng enzyme alcalase 16
Đồ thị Hình 4.4 thể hiện sự phụ thuộc đáng kể của thời gian thủy phân đến hiệu suất thủy phân protein và hoạt tính chống oxy hóa từ dịch thủy phân. Khi thời gian thủy phân tăng từ 1 đến 4 giờ, hiệu suất thủy phân tăng từ 19,58% lên 37,60% và hoạt tính chống oxy hóa tăng từ 16,54% lên 31,57%. Tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân đến 5 và 6 giờ, hiệu suất thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa đều giảm dần. Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần thủy phân đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc. Tuy nhiên, thời gian thủy phân càng kéo dài khi cơ chất đã hết thì các sản phẩm của quá trình thủy phân tiếp tục phân cắt làm giảm hiệu suất thủy phân (See et al., 2011). Do đó, thời gian thủy phân 4 giờ là thích hợp nhất. Điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme flavourzyme đến hiệu quả thủy phân protein 4.4.2.1 Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ Enzyme thương mại flavourzyme cũng là một enzyme được sử dụng nhiều trong ứng dụng thủy phân protein có nguồn gốc thủy sản. Đây là enzyme chứa cả thuộc tính exopeptidase và endopeptidase. Tuy nhiên, flavourzyme thường được biết đến trong vai trò là enzyme mang tính chất exopeptidase. Cũng giống như các loại enzyme thương mại khác, flavourzyme có khoảng pH và nhiệt độ hoạt động nhất định. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme flavourzyme bao gồm nhiệt độ =X6 (40 ÷ 60 C) và X7 = pH (6,0÷8,0). Phương trình hồi qui cho các hàm mục tiêu: Hiệu suất thủy phân (Y7); hoạt tính chống oxy hóa (Y8) và IC50 (Y9) lý thuyết) được xác định: Y7 - DH%= - 148,758 + 1,92953X6 + 36,6758X7 – 0,0207833X6^2 + 0,0414167X6X7 – 2,835X7^2, (R2 = 0,9594) (7) Y8 - DPPH%= - 400,987 + 2,46842X6 + 104,281X7 – 0,0311167X6^2+ 0,10675X6X7 – 7,86333X7^2, (R2 = 0,9819) (8) Y9 - IC50 = 481,778 - 113,801X6 - 2,58719X7 + 8,9563X6^2 - 0,21448 X6X7 do + 0,0389991X7^2 (9) Giải các phương trình hồi qui (7); (8) và (9), giá trị các biến tương ứng từng hàm mục tiêu (Y8) và IC50 (Y9). Kết quả được trình bày ở Bảng 4.7. Hình 4.5 Tương tác của nhiệt độ và pH đến ba hàm mục tiêu Y7, Y8 và Y9 17