Tóm tắt Luận văn Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) ở vùng Bắc Trung Bộ

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

54
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án nhằm nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên bằng cách sử dụng các kỹ thuật hiện đại nhằm phân tích, phân lập và xác định cấu trúc hiện đại. Đồng thời, thử nghiệm hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) ở vùng Bắc Trung Bộ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ NGẦN NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrll) VÀ NẤM VÂN CHI (Tramites cubensis (Mont.) Sacc.) Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 62. 44. 01. 14 Nghệ An-2015
2 Công trin ̀ h đƣơ ̣c hoàn thành ta ̣i: Trƣờng Đa ̣i ho ̣c Vinh, Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan Ngƣời hƣớng dẫn khoa ho ̣c: 1. PGS. TS. Trầ n Đin ̀ h Thắ ng 2. GS. TS. Tian Shung-Wu Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luâ ̣n án đƣơ ̣c bảo vê ̣ ta ̣i Hô ̣i đồ ng đánh giá luâ ̣n án cấ p Trƣờng họp tại: vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 1. Thƣ viê ̣n Quố c gia Viê ̣t Nam 2. Trung tâm Thông tin & Thƣ viê ̣n Nguyễn Thúc Hào – Trƣờng Đa ̣i học Vinh.
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thời tiết thuận lợi nên là một trong những quốc gia có sự đa dạng sinh học cao so với các quốc gia khác trên thế giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xƣơng sống đã đƣợc mô tả. Số loài nấm trên lãnh thổ Việt Nam ƣớc lƣợng gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao, khoảng 80.000 loài trong đó có 2500 loài nấm đã đƣợc định danh, nấm lớn chiếm 1400 loài thuộc 120 chi. Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ƣu thế với hơn 90% tổng số loài, nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% đã đƣợc ghi nhận. Nấm dƣợc liệu ở Việt Nam có khoảng hơn 700 loài trong đó có rất nhiều các loài dƣợc liệu quý nhƣ Linh chi (Ganoderma), nấm Vân chi (Trametes), đông trùng hạ thảo (Cordycep)… Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã cho thấy nấm lớn là nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có tác dụng dƣợc liệu (polysaccarit, polysaccarit-protein..) dùng để điều trị bệnh. Ở Việt Nam có ít nhất 651 loài thuộc 182 chi có chứa các hợp chất polysaccarit có tác dụng dƣợc liệu, chúng hầu hết là các glucan với nhiều kiểu liên kết glucosit khác nhau, những hợp chất này có khả năng chống ung thƣ, diệt virut HIV hay hỗ trợ cho hệ miễn dịch của cơ thể con ngƣời. Ngoài những hợp chất có khối lƣợng lớn, những hợp chất chuyển hoá thứ cấp có khối lƣợng nhỏ nhƣ triterpenoit, flavonoit,…đƣợc phân lập từ nấm lớn, nhiều hợp chất đã đƣợc ghi nhận có khả năng kháng ung thƣ, kháng khối u, kháng virut hay kháng khuẩn, kháng nấm. Nấm dƣợc liệu ở Việt Nam phong phú, nhiều loài là thuốc quý trong y học cổ truyền, là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá cho khoa học và thực tiễn nhƣng chƣa đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu nhiều, chỉ chủ yếu nghiên cứu về sự đa dạng sinh học. Hợp chất thiên nhiên đang tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong chƣơng trình tìm kiếm thuốc mới của ngành công nghiệp dƣợc và những ngành nghiên cứu khác. Một lý do quan trọng trong việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên nhƣ nguồn của các hợp chất dẫn đƣờng là phong phú và rất đa dạng cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập từ thiên nhiên. Hơn nũa, các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ thiên nhiên có thể dùng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác đƣợc dùng nhƣ chất dẫn đƣờng hoặc phân tử hiên đại
2 (mẫu) trong lĩnh vực tổng hợp và bán tổng hợp thuốc. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên và dẫn xuất của chúng chiếm 50% lƣợng thuốc điều trị lâm sàng. Trong đó các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật bậc cao chiếm 25%. Theo các nghiên cứu gần đây của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khoảng 80% dân số thế giới lựa chọn các bài thuốc y học cổ truyền nhằm chăm sóc sức khoẻ. Chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học của các loài nấm dƣợc liệu rất cần thiết, giúp cho chúng ta hiểu hơn về giá trị dƣợc học cũng nhƣ kinh tế và tầm quan trọng của nguồn nấm dƣợc liệu ở nƣớc ta. Chính vì vậy mà chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) ở vùng Bắc Trung Bộ” nhằm nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên bằng cách sử dụng các kỹ thuật hiện đại nhằm phân tích, phân lập và xác định cấu trúc hiện đại. Đồng thời, thử nghiệm hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thƣ và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất này. 2. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) đƣợc thu hái ở vùng Bắc Trung Bộ, Việt Nam. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết hỗn hợp các chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis); - Sử dụng các phƣơng pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của hai loại nấm trên; - Xác định cấu trúc của những hợp chất phân lập đƣợc; - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập đƣợc. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về đƣợc rửa sạch, sấy khô ở 40 C. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phƣơng pháp chiết chọn lọc với các dung 0 môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu đƣợc nêu ở phần thực nghiệm. - Phƣơng pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng các phƣơng pháp sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích và điều chế, sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau nhƣ silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích và điều chế trên các pha đảo, pha silica gel.
3 - Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất đƣợc phân lập đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp vật lý hiện đại nhƣ phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng va chạm electron (EI- MS), phổ khối lƣợng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau nhƣ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC. - Cấu trúc lập thể tƣơng đối của các hợp chất này đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY và phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray). - Thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thƣ và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. 5. Những đóng góp mới của luận án Đây là công trình nghiên cứu về thành phần hoá học và cả về hoạt tính sinh học của một số chất phân lập đƣợc từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) lần đầu tiên ở Việt Nam. * Từ dịch chiết quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) đã phân lập và xác định cấu trúc 11 hợp chất: - 04 hợp chất secquiterpenoit: nigrofomin A, nigrofomin B, madolin A và dehydrovomifoliol. Nigrofomin A và nigrofomin B là các hợp chất mới; - 02 hợp chất steroit: ergosterol và ergosterol peroxit; - 03 hợp chất phenolic: trans-p-hydroxycoumaric, metyl ferulat và (2- hydroxy-phenyl) axetat; - 01 hợp chất lacton: γ-(4-metyphenyl)-γ-metyl-γ-butyrolacton; - 01 hợp chất axit benzoic; Các hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài nấm này. * Xác định đƣợc các thông số cấu trúc tinh thể của hợp chất nigrofomin A. Các số liệu về tinh thể học của hợp chất này hiện đƣợc lƣu trữ tại Trung tâm dữ liệu Cambridge. * Hai hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B đều có khả năng gây độc các dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp tính (Jurkat), ung thƣ biểu bì vòm họng ở ngƣời (NPC-TW01), ung thƣ phổi (NCI-H661). * Từ dịch chiết quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) phân lập đƣợc 8 hợp chất: - 04 hợp chất triterpenoit: tramecubin A, tramecubin B, axit eburicoic, 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic. Tramecubin A và tramecubin B là các hợp chất mới;
4 - 02 hợp chất steroit: ergosterol, ergosterol peroxit; - 02 hợp chất coumarin: oospolacton và oospoglycol; Các hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài nấm này. * Hợp chất mới tramecubin A và tramecubin B tiến hành thử hoạt tính khả năng gây độc tế bào ung thƣ gan (Hep-G2), ung thƣ phổi (Lu), ung thƣ biểu mô liên kết (RD); hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn Gr (-) (ATCC 25922), vi khuẩn Gr (+) (ATCC 25923); hoạt tính kháng nấm với chủng nấm sợi (439, M42), nấm men (ATCC 7754, SH 20) với các kết quả âm tính. Kết quả thử sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập gợi mở khả năng ứng dụng là nguồn nguyên liệu cho thực phẩm chức năng. 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 131 trang với 21 bảng số liệu, 39 hình và 5 sơ đồ với 127 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phƣơng pháp và thực nghiệm (25 trang), kết quả và thảo luận (61 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (13 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 110 phổ của một số hợp chất chọn lọc. Chƣơng 1: TỔNG QUAN Luận án đã tiến hành tổng quan tài liệu các nội dung: 1. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn - Giới thiệu về nấm lớn. - Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn: kháng khuẩn và kháng nấm; khả năng kháng virut; gây độc tế bào, chống ung thƣ và tăng cƣờng hệ thống miễn dịch và những hoạt tính khác. 2. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) - Đặc điểm và sự phân bố. - Thành phần hoá học và hoạt tính của các chất đã đƣợc phân lập 3. Nấm vân chi (Trametes cubensis) - Đặc điểm và sự phân bố. - Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học. Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ THƢ̣C NGHIỆM 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1. Phƣơng pháp lấy mẫu: Mẫu nấm đƣợc thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tƣơi sau khi lấy về đƣợc rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 40-600C. Bảo quản ở điều kiện thích hợp dùng để thí nghiệm.
5 2.1.2. Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc: Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích và điều chế; sắc ký cột thƣờng (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích và điều chế; các phƣơng pháp kết tinh. 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lƣợng (EI-MS), (ESI- MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tƣơng của các hợp chất này đƣợc xác định các phƣơng pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY và phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray). 2.1.4. Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học Quá trình thử hoạt tính ở Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane; quá trình tiến hành ở Đại học Y Trung Quốc, Đài Loan đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Hansen. 2.2. Hóa chất và thiết bị 2.2.1. Hoá chất: Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). 2.2.2. Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lƣợng (MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR); phổ X-ray; điểm nóng chảy; độ quay cực riêng 2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) 2.3.1. Mẫu nấm Quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) đƣợc thu hái ở Vƣờn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An vào tháng 11/2009. Mẫu đƣợc định danh bởi PGS. TS. Ngô Anh (khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế). Tiêu bản (ký hiệu Vinh- TSWu 200901) đƣợc lƣu tại khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Vinh. 2.3.2. Phân lập các hợp chất Quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) (1350 g) thu hái tại Vƣờn Quốc gia Pù Mát đƣợc rửa sạch, phơi khô ở điều kiện thƣờng, xay nhỏ cho vào chiết 3 lần với hệ dung môi cloroform: metanol (CHCl3:MeOH = 1:1) ở nhiệt độ thƣờng. Dịch chiết sau khi cất quay chân không thu đƣợc cao chiết NDM (78,0 g).
6 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -1, -2, -3, -4, -8 và -9 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -7, -8, -9, -10, -11
7 2.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 hợp chất NDM-1, NDM-2 Tác dụng gây độc tế bào đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp MTT (Micoroculture Tetrazolium Assay) của Hansen. Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc thử nghiệm cho hai hợp chất nigrofomin A (NDM-1) và nigrofomin B (NDM- 2) phân lập từ nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) với dòng tế bào bệnh bạch cầu (Jurkat), ung thƣ phổi (NCI H226) và ung thƣ biểu mô vòm họng ở ngƣời (NPC-TW01). 2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) 2.4.1. Mẫu nấm Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) đƣợc thu hái vào tháng 08/2012 ở huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An. Mẫu đƣợc định danh bởi PGS. TS. Ngô Anh (khoa Sinh, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế). Tiêu bản (ký hiệu Vinh- TSWu 201208) đƣợc lƣu giữ tại khoa Hoá học, Trƣờng Đại học Vinh. 2.4.2. Phân lập các chất Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) (6,4 kg) đƣợc thu hái, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 40-50oC trong 48 giờ, toàn bộ mẫu nấm vân chi đƣợc ngâm chiết bằng dung môi metanol trong 14 ngày. Dịch lọc thu đƣợc sau khi ngâm chiết đƣợc cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao tổng metanol (580 g). Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) 1.Chiết với dung môi MeOH 2. Cất giảm áp loại dung môi Cao MeOH (580 g) 1. Phân bố trong H2O. 2.Chiết lần lƣợt với hexan, EtOAc. 3. Cất giảm áp loại dung môi. Cao DQH (80 g) Cao DQE (380 g) Sơ đồ 2.3. Sơ đồ chiết quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis)
8 Sơ đồ 2.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất DQE-2, DQE-6, DQE-7, DQE-8 Sơ đồ 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất DQE-3, DQE-4, DQE-5
9 2.4.3. Thử hoạt tính các hợp chất phân lập từ quả thể nấm vân chi 2.4.3.1. Thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất DQE-1 Hợp chất triterpenoit đƣợc phân lập từ quả thể nấm Vân chi (Trametes cubensis) tramecubin A (DQE-1) đƣợc tiến hành thử hoạt tính in vitro với ba dòng tế bào ung thƣ trên ngƣời: ung thƣ gan (Hep-G2-Hepatocellular Carcinoma), ung thƣ phổi (Lu-Human Lung Adenocarcinoma) và ung thƣ mô liên kết (RD-Human Rhabdomycosarcoma). Tác dụng gây độc tế bào đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Skehan. 2.4.3.2. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật của hợp chất DQE-1 Hợp chất mới tramecubin A (DQE-1) đƣợc phân lập từ quả thể nấm Vân chi (Trametes cubensis), ngoài tiến hành thử hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thƣ còn tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật với các dòng vi khuẩn: khuẩn Gr (-) (Escherichia coli-ATCC25922; Pseudomonas aeruginosa- ATCC25923); khuẩn Gr (+) (Bacillus subtillis- ATCC11774; Staphylococcus aureus subsp. Aureus- ATCC 11632);Hoạt tính kháng nấm với các chủng nấm: nấm sợi (Aspergillus nige- 439; Fusarium oxysporum- M42); nấm men (Cadida albicans- ATCC 7754; Saccharomyces cerevisiae- SH 20). Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) 3.1.1. Mẫu nấm Quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) đƣợc thu hái ở Vƣờn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An vào tháng 11/2011. Mẫu đƣợc định danh bởi PGS.TS Ngô Anh (khoa Sinh, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế). Tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại khoa Hoá, Trƣờng Đại học Vinh. 3.1.2. Phân lập các hợp chất Từ dịch chiết metanol của quả thể nấm đa niên lỗ đen bằng cách kết hợp các phƣơng pháp chiết, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích và điều chế với các hệ dung môi rửa giải khác nhau phù hợp với từng phân đoạn. Bảng 3.1. Các hợp chất phân lập từ quả thể nấm đa niên lỗ đen STT Ký hiệu Tên hợp chất Công thức Khối phân tử lƣợng (mg) 1 NDM-1 nigrofomin A C15H18O6 13,2 2 NDM-2 nigrofomin B C15H18O5 8,7 3 NDM-3 trans-p-hydroxycoumaric C9H8O3 32 4 NDM-4 metyl ferulat C11H12O4 15
10 5 NDM-5 -(4-methylphenyl)--methyl-- C12H15O2 37 butyrolacton 6 NDM-6 Dehydrovomifoliol C13H22O2 76 7 NDM-7 madolin A C15H22O2 43 8 NDM-8 Ergosterol C28H44O 45 9 NDM-9 ergosterol peroxit C28H44O3 23 10 NDM-10 axit benzoic C7H8O3 128 11 NDM-11 metyl (2-hidroxyphenyl) axetat C9H10O3 750 3.1.3. Xác định cấu trúc các hợp chất 3.1.3.1. Hợp chất NDM-1 (chất mới) Chất NDM-1 là chất dạng tinh thể, không màu, nhiệt độ nóng chảy 208- 210 C, [α]D25 -31,4° (c = 0,1, MeOH). Phổ ESI-MS (positive) của hợp chất 0 NDM-1 xuất hiện pic m/z 317 [M+Na]+. Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS của NDM-1 xuất hiện tín hiệu pic tại m/z 317,1002 [M+Na]+ theo tính toán là công thức C15H18O6Na m/z 317,1001 [M+Na]+, khẳng định công thức phân tử của NDM-1 là C15H18O6. Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon bao gồm 1 cacbon nhóm xeton vòng (δC 210,9 ppm); 1 cacbon nhóm cacbonyl của vòng lacton (δC 174,0 ppm); 2 cacbon olefin ở δC 126,3 ppm và 136,3 ppm; 4 cacbon bậc 4 (δC 82,1; 76,7; 60,0; và 45,7 ppm); 1 cacbon nhóm metin (δ C 106,6 ppm); 4 nhóm metylen (δC 73,0, 52,5, 40,8 và 32,6 ppm) và 2 nhóm metyl (δC 25,4 ppm và 26,5 ppm). Phổ 1H-NMR, HSQC của hơp chất NDM-1 cho thấy tín hiệu singlet tại δH 1,31; 1,15 ppm của proton 2 nhóm metyl của H-13, H-14; 1 tín hiệu singlet tại δH 6,02 ppm (H-7) của proton liên kết đôi; nhóm metylen liên kết với oxi có tín hiệu doublet tại δH 4,79 ppm (1H) với giá trị J=10,4 Hz và 1 proton có tín hiệu doublet tại δH 4,50 ppm (1H) với J=10,4 Hz là tín hiệu của 2 proton H- 12 và H-12β; tín hiệu proton tại δH 3,53 ppm (1H, d, J= 13,2 Hz, H-1α), 2,19 ppm (1H, d, J= 13,2 Hz, H-1β); 1 nhóm metylen tín hiệu proton tại δH 3,08 (1H, d, J=3,8 Hz), 1,91 (1H, dd, J=3,8 Hz) là của hai proton H-3β, H-3α; tín hiệu singlet tại δH 2,60 ppm (2H) là tín hiệu của nhóm CH2 ở vị trí C-6; ngoài ra tín hiệu singlet của proton axetal tại δH 5,62 ppm (s,H-11). Các tín hiệu proton trên kết hợp với phổ 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu tại δH 25,4; 26,5; 126,3; 40,8; 52,5; 70,3 và 32,6 ppm, so sánh với tài liệu cho thấy hợp chất này thuộc lớp chất secquiterpen có kiểu khung drimane và hợp phần dioxabixiclooctan rất hiếm gặp.
11 Phổ HMBC cho thấy vị trí chính xác các nhóm thế trong cấu trúc của NDM-1: tƣơng tác của proton H-3 (δH 3,10 ppm, 1,91 ppm)/ C-2 (δC 210,9 ppm), C-4 (δC 45,7 ppm), C-5 (δC 76,7 ppm), C-13 (δC 25,4 ppm), C-14 (δC 26,5 ppm) và H-13 (δH 3,31 ppm), H-14 (δH 1,15 ppm)/C-3 (δC 52,5 ppm), C-4 (δC 45,7 ppm), C-5 (δC 76,7 ppm). Độ dịch chuyển trƣờng thấp của C-5 và C-9 chứng tỏ có sự liên kết với nhóm OH. Hơn thế, hợp phần dioxabicyclooctan gồm C-8 (δC 136,3 ppm), C-9 (δC 82,1 ppm) và C-10 đƣợc xác định do có tín hiệu tƣơng tác xa trong phổ HMBC của H-11 (δH 5,62 ppm)/C-8, C-12 (δC 73,0 ppm), C-15 (δC 174,0 ppm); H-12 (δH 4,79; 4,50 ppm)/C-7 (δC 126,3 ppm), C- 8, C-9, và H-1/C-2, C-5, C-9, C-10, C-15. Phổ NOESY của chất NDM-1 cho thấy sự tƣơng quan giữa H-14/H-3α, H- 3β, H-6; H-13/H-3α; H-6/H-7. Sự tƣơng quan giữa các proton trong phân tử NDM-1 đƣợc khẳng định chắc chắn thêm bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X. Một số thông số về hình học của tinh thể NDM-1 Bảng 3.2: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-1 STT DEPT δC (ppm) δH (ppm) 1 2,19 (1H, d, J=13,2 Hz, H-1β) CH2 40,8 3,53 (1H, d, J=13,2 Hz, H-1α) 2 C=O 210,9 3 1,91 (1H, d, J=3,8 Hz, H-3β) CH2 52,5 3,08 (1H, d, J=3,8 Hz, H-3) 4 C 45,7 5 C 76,7 6 CH2 32,6 2,60 (2H, br s) 7 CH 126,3 6,02 (1H, br s) 8 C 136,3 9 C 82,1 10 C 60,0 11 CH 106,6 5,62 (1H, s) 12 4,50 (1H, d, J=10,4 Hz, H-12β) CH2 73,0 4,79 (1H, d, J=10,4 Hz, H-12) 13 CH3 25,4 1,31 (3H, s) 14 CH3 26,5 1,15 (3H, s) 15 C=O 174,0 H (Đo ở 400 MHz trong CD3OD), C (Đo ở 100 MHz trong CD3OD)
12 Dƣ̃ liêụ tinh thể Hê ̣ tinh thể : Orthorhombic Dc = 1,448 mg/m3 Nhóm điểm không gian : P 21 Z=4 21 21 a = 6.9722(2) Å T = 100 (2) K b = 10.8015(3) Å F000 = 624 c = 17.9302(4) Å Dạng bức xạ CuK\a  = 90o λ = 1,54178 Å β = 90o θ = 4,78 – 71,63o  = 90o  = 0,943 mm-1 V = 1350.33(6) Å3 Kích thƣớc tinh thể: 0,68 x 0,34 x 0,14 mm3 Ghi nhâ ̣n dƣ̃ liêụ Máy nhiễu xạ Bruker APEX Rint = 0,0218 DUO Nguồ n bƣ́c xa :̣ fine-focus sealed R1 = 0,0384 với I > 2 (I) tube Phản xạ đã dùng 5000 θmax = 71,63o Phản xạ tự do 2584 θmin = 4,78o Máy đơn sắc: graphite h = -8  5 Dạng hiệu chỉnh hấp thụ : k = -12  13 multi-scan T = 100 K l = -21  20 Hình 3.10: Cấu trúc X-ray của hợp chất NDM-1 Kết hợp dữ liệu của các loại phổ ESI-MS, HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT, COSY, NOESY, HSQC, HMBC, NOESY và X-ray xác định đƣợc cấu trúc lập thể của NDM-1 là một chất mới đặt tên là nigrofomin A. H O 11 O O O 15 9 12 1 2 10 8 3 5 OH 7 4 6 OH H3C CH3 14 13 Nigrofomin A (NDM-1)
13 3.1.3.2. Hợp chất NDM-2 Chất NDM-2 là chất dạng tinh thể không màu, nhiệt độ nóng chảy 208- 210 C, [α]D25 -94,0° (c = 0,1, MeOH). Phổ ESI-MS (positive) của hợp chất 0 NDM-2 xuất hiện pic ở m/z 301 [M+Na]+. Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS của NDM-2 cho tín hiệu tại m/z 301,1053 [M+Na]+ , theo tính toán tƣơng ứng với công thức C15H18O5Na m/z 301,1052, khẳng định công thức phân tử của NDM-2 là C15H18O5. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất NDM-2 tƣơng đồng với chất NDM- 1 cho thấy tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon bao gồm 1 cacbon nhóm xeton (δ C 210,7 ppm); 1 cacbon nhóm cacbonyl của vòng lacton (δ C 175,0 ppm); 2 cacbon olefin (C=C) ở δC 129,8 ppm và 135,6 ppm; 4 nhóm metylen (CH2) (δC 73,0; 56,7; 43,0 và 26,0 ppm); 2 nhóm metyl (CH3) liên kết với cacbon bậc 4 (δC 32,3 ppm và 23,6 ppm). Sự khác nhau giữa NDM-1 và NDM-2 là trong phân tử NDM-2 có 3 cacbon bậc 4 ở (δC 80,8; 49,0; 39,5 ppm), trong đó có 1 cacbon liên kết với nhóm hydroxyl (OH) tại (δC 80,8 ppm) ; 2 nhóm metin (δC 107,8 ppm và 42,0 ppm). So sánh dữ liệu phổ với tài liệu và hợp chất NDM-1 cho thấy hợp chất NDM-2 cũng là hợp chất secquiterpen có kiểu khung drimane với phần dioxabixiclooctan (Hình 3.16). Phổ 1H-NMR của chất NDM-2 đã chứng minh các sự có mặt của các proton trong phân tử NDM-2 giống nhƣ các proton trong phân tử NDM-1. Trên phổ 1H-NMR, có 2 tín hiệu singlet của proton nhóm metyl (CH3) tại δH 1,21 ppm và 1,19 ppm của proton ở vị trí C-13 và C-14 (HSQC); một tín hiệu singlet của proton olefin duy nhất trong phân tử tại δH 6,14 ppm; 2 tín hiệu doublet của 2 proton ở trƣờng cao tại δH 4,79 ppm (J=10.8 Hz) và δH 4,47 ppm (J=10,5 Hz) thuộc về 2 proton liên kết với C-12. Phổ HMBC giữa H-5/C-3 (δC 56,7 ppm), C-9 (δC 80,8 ppm), C-15 (δC 175,0 ppm) cho thấy rằng nhóm hydroxyl (OH) không liên kết với cacbon ở vị trí C-5 của hợp chất này. So sánh với khối lƣợng phân tử, theo phổ HR-ESI- MS với tín hiệu pic ion phân tử tại 301,1053 thì phân tử NDM-1 nhiều hơn phân tử NDM-2 một nguyên tử oxi và công thức phân tử của NDM-2 là C15H18O5. Tín hiệu tƣơng tác xa giữa các proton trên phổ NOESY (hình 3.16) của hợp chất NDM-2: H-11(δH 5,67 ppm) /H-3α (δH 2,20 ppm), H-12α; H-5 (δH 3,19 ppm)/H-3α; H-3β (δH 2,57 ppm)/H-14 (δH 1,19 ppm); H-3α /H-13 (δH 1,21 ppm); H-3α (δH 2,20 ppm), H-6α (δH 2,48 ppm)/H-13. Chính vì vậy mà
14 cấu trúc không gian của hợp chất NDM-2 tƣơng tự với cấu trúc của hợp chất NDM-1. Bảng 3.3: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-2 STT DEPT δC (ppm) δH (ppm) 2,27 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-1) 1 CH2 43,0 2,19 (1H, d, J=13,2 Hz, H-1β) 2 C=O 210,7 2,57 (1H, d, J=12,8 Hz; H-3β) 3 CH2 56,7 2,20 (1H, dd, J=12,8; 2,0 Hz, H-3α) 4 C 39,5 5 CH 42,0 3,19 (1H, d, J=10,8 Hz) 2,49 (1H, d, J=12,0 Hz, H-6α) 6 CH2 26,0 2,30 (1H, d, J= 12,3 Hz, H-6β) 7 CH 129,8 6,02 (1H, br s) 8 C 135,6 9 C 80,8 10 C 49,0 11 CH 107,8 5,62 (1H, s) 4,79 (1H, d, J=10,4 Hz, H-12α) 12 CH2 73,0 4,50 (1H, d, J=10,4 Hz, H-12β) 13 CH3 23,6 1,21 (3H, s) 14 CH3 30,8 1,15 (3H, s) 15 C=O 175,0 H (Đo ở 400 MHz trong CD3OD), C (Đo ở 100 MHz trong CD3OD) Kết hợp tín hiệu của các loại phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS, HR-ESI- MS, COSY, HSQC, HMBC, NOESY và X-ray ta xác định đƣợc cấu trúc của chất NDM-2, đây là một chất mới đƣợc đặt tên là nigrofomin B. H O 11 O 15 O O 9 12 1 2 10 8 3 5 HO 7 4 6 H H 3C CH 14 13 3 Nigrofomin B (NDM-2) 3.1.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B Kết quả cụ thể của quá trình thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 chất trên với các dòng tế bào bệnh bạch cầu (Jurkat), ung thƣ phổi (NCI H226) và ung
15 thƣ biểu mô vòm họng ở ngƣời (NPC-TW01) đƣợc tiến hành ở Trƣờng Đại học Y Trung Quốc, Đài Loan thể hiện qua bảng 3.12. Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B STT Ký hiệu Tên chất Dòng tế bào (IC50 μM) mẫu Jurkat NPC-TW01 NCI-H226 1 NDM-1 nigrofomin A 124,91±6,22 237,53±28,50 158,52±11,54 2 NDM-2 nigrofomin B 99,44±5,20 246,32±20,57 188,46±14,04 3 Methot 1,25±0,55 0,1±0,0 10,25±2,30 rexate Từ kết quả ở bảng 3.12 cho thấy, 2 hợp chất nigrofomin A, nigrofomin B có hoạt tính với hai dòng tế bào bệnh bạch cầu (Jurkat) và ung thƣ biểu mô vòm họng (NCI-H226) với các giá trị IC50 tƣơng ứng: 124,91±6,22; 158,52±11,54; 99,44±5,20; 188,46±14,04. Khả năng gây độc với dòng tế bào Jurkat, hợp chất nigrofomin B mạnh hơn hợp chất nigrofomin A. Đối với dòng NCI-H226, khả năng gây độc của nigrofomin A lại mạnh hơn. 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm vân chi Từ dịch chiết etylaxetat của quả thể nấm vân chi bằng cách kết hợp các phƣơng pháp chiết, sắc ký bản mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các hệ dung môi rửa giải phù hợp với từng phân đoạn. Kết quả của quá trình phân lập thể hiện ở bảng 3.13. Bảng 3.13: Các hợp chất phân lập từ quả thể nấm vân chi S Ký Tên hợp chất Công Khối T hiệu thức lƣợng T phân tử hợp chất (mg) 1 DQE-1 Tramecubin A C30H46O6 1230 2 DQE-2 Tramecubin B C32H50O5 22 3 DQE-3 Oospolacton C11H10O3 7 4 DQE-4 Ergosterol C24H44O 20 5 DQE-5 Ergosterol peroxit C24H44O3 34 6 DQE-6 Oospoglycol C11H10O5 57 7 DQE-7 Axit eburicoic C31H50O3 8 8 DQE-8 Axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic C30H48O3 10 3.2.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập 3.2.3.1. Hợp chất DQE-1 (Chất mới)
16 Hợp chất DQE-1 thu đƣợc dƣới dạng chất rắn không màu. Trên phổ HR- ESI-MS (negative) (Hình 3.20) của hợp chất DQE-1 xuất hiện pic ở m/z 501 [M-H]+ phù hợp với công thức C30H46O6. Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS (positive) cho pic ion giả phân tử với giá trị m/z 525,3197 [M + Na]+ cho biết công thức phân tử tƣơng ứng C32H50O5Na, từ đó khẳng định công thức phân tử của DQE-2 là C32H50O5. Phổ 13C-NMR, DEPT khẳng định sự có mặt của 30 cacbon trong phân tử DQE-1 trong đó có hai tín hiệu của cacbon nhóm cacbonyl (C=O) của axit (COOH) tại C 178,4 ppm và 170,3 ppm; 4 tín hiệu của cacbon của hai liên kết đôi C=C ở C 141,5, 134,7, 133,2 và 127,9 ppm trong đó có 1 nhóm metin (CH) ở 141,5 ppm (theo phổ DEPT); 2 tín hiệu của cacbon nhóm metin (CH) liên kết với nhóm hydroxyl (OH) ở C 78,2 ppm và 72,5 ppm. Theo phổ DEPT, những cacbon còn lại có 6 nhóm metyl (CH3), 9 nhóm metilen (CH2) và 2 nhóm metin (CH). Từ các tín hiệu cacbon trên phổ 13C-NMR và DEPT kết hợp so sánh với các tín hiệu cacbon của chất DQE-7 và DQE-8 ở trên phổ 13C-NMR, DEPT của hai chất này, mặc dù có sai lệch chút ít giữa độ dịch chuyển của cacbon ở DQE-1 với cacbon ở 2 chất DQE-7, DQE-8 do chúng đƣợc đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ở các dung môi khác nhau (DQE-7, DQE-8 dùng pyridine, DQE-1 dùng hệ CHCl3:CH3OH-1:3), kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [13] ta có thể cho rằng chất DQE-1 là một lanostan có 30 nguyên tử cacbon với hệ thống 4 vòng và có 2 liên kết đôi. Phổ 1H-NMR xác nhận sự có mặt của 1 nhóm metin (CH) của liên kết đôi tại H 6,55 ppm (H-24) với tín hiệu triplet và J= 7,2 Hz do sự tƣơng tác của 2 proton ở vị trí 23; 2 tín hiệu tri doublet của 2 nhóm metin (CH) liên kết với nhóm hydroxyl (OH) xuất hiện tại H 2,99 ppm với J=5,6; 4,4 Hz, so sánh với tài liệu đây là H-3 (nhóm hydroxyl liên kết với C-3) và xuất hiện tại H 3,99 ppp; ngoài ra còn xuất hiện 4 tín hiệu singlet của 6 nhóm metyl (CH3) tại H 1,62, 0,80, 0,75, 0,62 ppm tƣơng ứng với proton ở các vị trí H-26, H-29, H-19, H-18, H-28, H-30. Vị trí các nhóm thế cũng nhƣ công thức trên đƣợc khẳng định bằng sự tƣơng tác xa H→C trên phổ HMBC (Hình 3.25): proton của nhóm metyl (CH3) gắn với C-10 (H 0,8 ppm) (H-19) tƣơng tác với C-1 (C 37,4 ppm), C-5 (C 50,0 ppm), C-8 (C 133,2 ppm), C-10 (C 36,7 ppm) khẳng định nhóm metyl gắn với C-10; proton của các nhóm metyl liên kết với C-4 (C 38,5 ppm) gồm H-29 (H 0,8 ppm) và H-30 (H 0,62 ppm) tƣơng tác với C-3 (C 78,2 ppm), C- 4, C-5 khẳng định có hai nhóm metyl liên kết với C-4; proton của nhóm metyl
17 liên kết với C-13 (C 44,4 ppm) là H-18 (H 0,75 ppm) tƣơng tác xa với C-13, C-14 (C 51,0 ppm), C-16 (C 27,0 ppm), C-17 (C 45,4 ppm) khẳng định vị trí của nhóm metyl liên kết với C-13; proton của nhóm metyl liên kết với C-14 (H-28) tƣơng tác xa với C-9 (C 134,7 ppm), C-12 (C 72,5 ppm), C-13, C-14 và với tín hiệu tƣơng tác xa của H-19/C-9; H-28/C-8 khẳng định vị trí liên kết đôi thứ nhất ở giữa vòng thứ 2 và thứ 3 tại C-8 và C-9; proton của nhóm metyl liên kết với C-25 (C 127,9 ppm) là H-26 tƣơng tác xa với C-24 (C 141,5 ppm), C-27 (COOH, C 170,3 ppm) khẳng định vị trí nhóm metyl liên kết với C-25. Ngoài ra H-24 (H 6,55 ppm) tƣơng tác với C-27, C-26 (C 11,7 ppm) khẳng định vị trí của liên kết đôi C=C ở vị trí C-24 và C-25, và với sự tƣơng tác của H-25, H-24 với C-27 (COOH) khẳng định nhóm cacboxyl (COOH) liên kết với C-25. Sự tƣơng quan 1H-1H xuất hiện trên phổ COSYcũng góp phần khẳng định cấu trúc của hợp chất DQE-1. Phổ NOESY của hợp chất DQE-1 cho thấy sự tƣơng tác của proton H-3 với H-5 và H-12 với H-22. Bảng 3.14: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất DQE-1 STT DEPT C (ppm) H (ppm) 1 CH2 37,4 1,82-1,73 (1H, m) 2 CH2 29,0 1,58-1,51 (1H, m) 1,18 (1H, td, J=16,5, 9,5 Hz) 3 CH 78,2 2,99 (1H, td, J=5,6; 4,4 Hz) 4 C 38,5 5 CH 50,0 0,83 (1H, d, J=15 Hz) 6 CH2 17,9 1,58-1,51 (1H, m) 1,38-1,27 (1H, m) 7 CH2 26,5 1,48-1,38 (1H, m) 8 C 133,2 9 C 134,7 10 C 36,7 11 CH2 20,2 1,82-1,73 (2H, m) 12 CH 72,5 3,99 (1H, td, J=5,6; 4,0 Hz) 13 C 44,4 14 C 51,0 15 CH2 30,9 1,48-1,38 (2H, m) 16 CH2 27,0 2,06-1,96 (2H, m) 17 CH 45,4 2,06-1,96 (1H, m)
18 18 CH3 16,7 0,75 (3H, s) 19 CH3 18,6 0,80 (3H, s) 20 CH 47,5 2,06-1,96 (1H, m) 21 C=O 178,4 22 CH2 35,3 1,08-1,00 (2H, m) 23 CH2 26,2 2,06-1,96 (2H, m) 24 CH 141,5 6,55 (1H, t, J=7,2 Hz) 25 C 127,9 26 CH3 11,7 1,62 (3H, s) 27 C=O 170,3 28 CH3 15,8 0,62 (3H, s) 29 CH3 27,4 0,80 (3H, s) 30 CH3 15,0 0,62 (3H, s) H (Đo ở 400 MHz trong CDCl3), C ( Đo ở 100 MHz trong CDCl3) Kết hợp dữ liệu của các loại phổ ESI-MS, HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT, COSY, NOESY, HSQC, HMBC với cấu trúc lập thể đã đƣợc xác định bằng phổ NOESY, chúng tôi xác định đƣợc cấu trúc của chất DQE-1, đây là một chất mới đƣợc đặt tên là tramecubin A. 21 26 22 HOOC 24 CH3 23 OH 18 25 20 CH3 17 19 12 COOH 11 13 27 CH3 9 14 16 1 8 2 15 10 3 5 7 CH 28 3 4 6 HO H3C CH3 30 29 tramecubin A (DQE-1) 3.2.3.2. Hợp chất DQE-2 Hợp chất DQE-2 thu đƣợc dƣới dạng chất lỏng màu vàng nhạt. Trên phổ ESI-MS của chất DQE-2 xuất hiện pic ở m/z 513,4 [M-H]+ (negative) phù hợp với công thức phân tử C32H50O5. Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS (negative) cho pic ion giả phân tử với giá trị m/z 513,3587 [M-H]+ khẳng định công thức phân tử của DQE-2 là C32H50O5. Phổ 13C-NMR của DQE-2 xác nhận sự có mặt của 32 cacbon trong phân tử DQE-2, trong đó có 2 tín hiệu cacbon cacbonyl (C=O) tại C 182,8 ppm (của nhóm –COOH) và 171,0 ppm (của nhóm –COO-); 4 cacbon olefin (C=C)