Tóm tắt Luận văn Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:23

Thêm vào BST

Báo xấu

46
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của rễ củ hà thủ ô đỏ tạo cơ sở xây dựng quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt chất phân lập được, ứng dụng vào đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong một số mẫu dược liệu này. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------------------- NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2021
2 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Nguyễn Tiến Đạt Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Hải Đăng Phản biện 1: ................................................................................................................... Phản biện 2: ................................................................................................................... Phản biện 3: ................................................................................................................... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 2021. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia
3 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Ngày nay, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên đang có xu hướng tăng mạnh, do đó cần có biện pháp quản lý chất lượng dược liệu từ khâu nguyên liệu đến sản phẩm. Chất lượng dược liệu phần lớn phụ thuộc vào thành phần hoạt chất, những chất hoá học có hoạt tính sinh học đóng góp vào tác dụng dược lý của dược liệu đó. Có nhiều nguyên nhân có thể ảnh hưởng đến thành phần hoạt chất trong dược liệu bao gồm nguồn gốc nguyên liệu không đảm bảo; địa hình địa lí trồng trọt, thu hoạch và bảo quản dược liệu. Cũng có thể do quá trình chế biến dược liệu không đúng kỹ thuật dẫn đến mất hoạt chất hoặc biến đổi hoạt chất, từ hoạt chất có lợi thành chất gây hại cho con người. Ngoài ra, hoá chất độc hại cũng có thể được sử dụng trong bảo quản dược liệu. Thậm chí, một số dược liệu có thành phần hoạt chất thấp hoặc dược liệu giả mạo cũng được bán trên thị trường với danh nghĩa là dược liệu quý... Do vậy dược liệu nói chung cần được kiểm tra chất lượng sản phẩm đặc biệt là hàm lượng các hoạt chất có trong thành phần dược liệu nhằm đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng, bảo vệ sức khỏe con người. Hà thủ ô đỏ là một loại dược liệu phổ biến sử dụng trong chế biến thuốc đông dược. Dược liệu này được sử dụng trong các sản phẩm đông dược dùng làm thuốc bổ, nhuận tràng, trị thần kinh suy nhược, các bệnh về thần kinh, bổ máu, làm đen râu tóc... Ở Việt Nam, hà thủ ô đỏ được coi là một vị thuốc quý và an toàn do quan niệm dân gian và có nguồn gốc tự nhiên. Ngày nay, hà thủ ô đỏ đã được chế ở rất nhiều dạng khác nhau như: dược liệu miếng hà thủ ô chế, bột hà thủ ô, trà hà thủ ô, viên thuốc hà thủ ô đỏ... Các sản phẩm này được bày bán tại các hiệu thuốc tây y, hiệu thuốc đông y và có thể mua một cách dễ dàng. Điều này khẳng định dược liệu hà thủ ô đỏ đỏ được coi là sản phẩm an toàn. Tuy nhiên, trên sản phẩm, hàm lượng các hoạt chất của dược liệu được công bố không chi tiết và không có cảnh báo dùng trong bao lâu. Do vậy có thể dẫn đến hàm lượng hoạt chất không đủ để cải thiện trình trạng bệnh, hoặc tác dụng tích cực là không đáng kể. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính, quy trình phân tích định tính định lượng các hoạt chất của hà thủ ô đỏ. Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu khoa học về hà thủ ô đỏ còn khá khiêm tốn. Một số nghiên cứu được tiến hành trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, song kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở phân tích định tính và định lượng một số ít hoạt chất chính của hà thủ ô đỏ. Để đánh giá đúng chất lượng của hà thủ ô đỏ, cần thiết phải xác định thành phần hóa học và thực hiện quá trình phân tích định lượng nhiều hoạt chất trong loại dược liệu này. Tuy nhiên, ở Việt Nam đến nay vẫn chưa có nhiều công trình công bố quy trình định lượng đồng thời nhiều hợp chất trong dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu hà thủ ô đỏ. Dược điển Việt Nam V chưa đưa quy trình định lượng đồng thời nhiều hoạt chất trong hà thủ ô đỏ. Sự hạn chế này một phần là do chúng ta còn thiếu các chất sạch làm chỉ thị phân tích trong khi ở một số nước khác có các ngân hàng chất sạch, có thể cung cấp phục vụ rộng rãi cho các nghiên cứu. Mặt khác, gần đây đã và đang có một số báo cáo khoa học công bố về một số tác dụng phụ có liên quan đến hà thủ ô đỏ. Các công bố này chủ yếu đưa ra các cảnh báo về các tác dụng phụ do sử dụng các chế phẩm hà thủ ô đỏ trong thời gian dài. Tuy cơ chế gây độc chưa được làm sáng tỏ nhưng đã cảnh báo rằng khi liều dùng không phù hợp sẽ gây lên những tác động xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng. Vì vậy, nhằm sử dụng dược liệu một cách an toàn và hiệu quả cần tăng cường quản lý chất lượng thông qua đánh giá hàm lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ. Để góp phần đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ trên thị trường Việt Nam, trước tiên phải xác định rõ thành phần hoá học của chúng, phân lập và
4 xác định cấu trúc của những hoạt chất chính. Từ đó thiết lập các điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm phân tích định tính và định lượng các hoạt chất của các mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của rễ củ hà thủ ô đỏ. Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt chất phân lập được. Ứng dụng quy trình phân tích đã thiết lập đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong một số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ. Các kết quả nghiên cứu đạt được làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái tại Hà Giang, Việt Nam. Thiết lập một số điều kiện phân tích sắc ký HPLC trên thiết bị HPLC-DAD-MS từ chất sạch phân lập được. Lập đường chuẩn định lượng và thẩm định quy trình phân tích đã thiết lập theo tiêu chuẩn của hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức AOAC. Ứng dụng quy trình phân tích đã thiết lập phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt chất trên một số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ đang lưu hành trên thị trường Việt Nam, so sánh và đưa ra kết luận. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chi Fallopia 1.2. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ 1.3. Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ trên thế giới 1.3.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học 1.3.2. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học 1.3.3. Các nghiên cứu về khả năng gây độc gan của hà thủ ô đỏ 1.3.4. Các nghiên cứu về phân tích định tính, định lượng hoạt chất của hà thủ ô đỏ 1.4. Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ tại Việt Nam 1.5. Tổng quan về thẩm định phương pháp phân tích CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ được thu hái tại huyện Phó Bảng, tỉnh Hà Giang vào tháng 10 năm 2014. Kích cỡ củ tươi trong khoảng 2-5 x 15-20 cm, khoảng 3÷4 năm tuổi. Tên khoa học được xác định bởi TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ được thu hái tự nhiên hoặc được thu mua từ các thị trường dược liệu và được mã hóa. Mẫu HG là mẫu được sử dụng để tiến hành phân lập và xác định cấu trúc thành phần hóa học các hợp chất trong hà thủ ô đỏ. Đồng thời các chất được phân lập từ mẫu HG được sử dụng làm chất chuẩn sử dụng trong quá trình định lượng. Mẫu TT6 được sử dụng trong nghiên cứu xác định độ thu hồi của phương
5 pháp định lượng. Các mẫu còn lại được sử dụng nhằm định lượng các hoạt chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ từ nhiều nguồn khác nhau trên thị trường Việt Nam. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất Sắc ký lớp mỏng (TLC): sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn TLC Silica gel 60 F254 (Merck 1,05715), RP-18 F254S (Merck). Vị trí chất trên bản mỏng được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến hiện màu. Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với pha tĩnh là silica gel pha thường và pha đảo, sephadex LH-20 hoặc nhựa trao đổi diaion HP-20 (Sigma). Bột sắc ký silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merck). Bột sắc ký silica gel pha đảo RP-C18 có cỡ hạt 12 nm. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được là sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm: Phương pháp phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên hệ máy Agilent 1260 series LC-MS single quadrupole 6120 của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phương pháp phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): phổ khối phân giải cao được đo trên máy Mass Spectrometter LTQ Orbitrap XL tại khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (tetramethyl silan). Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được bao gồm: + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY và NOESY. Điểm nóng chảy (Mp): đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Độ quay cực riêng [α]D: đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.3. Phương pháp xử lí mẫu Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ sau khi thu hái hoặc thu mua được thái lát mỏng, phơi khô trong bóng râm rồi nghiền nhỏ. Mẫu phân tích định tính, định lượng được chiết siêu âm với dung môi methanol, chiết lặp lại 3 lần nhằm chiết tách tối ưu các hoạt chất trong mẫu. Lọc dịch chiết qua giấy lọc và chuyển vào bình định mức và định mức đến vạch. 2.2.4. Phương pháp phân tích định tính, định lượng các hợp chất Hàm lượng các hợp chất được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và được thực hiện trên thiết bị HPLC-DAD-MS Agilent Technologies 1260 của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất chuẩn sử dụng khi thiết lập đường chuẩn là chất sạch được phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang. Chất sạch sau khi phân lập được chạy kiểm tra độ tinh khiết để đảm bảo độ sạch cho thiết bị HPLC.
6 2.3. Phân lập các hợp chất Quá trình tiến hành thực nghiệm được mô tả theo hình 2.2, 2.3 và 2.4: Củ hà thủ ô khô (FM) (3,5 kg) Ngâm chiết methanol (10 Lít x 3 lần) Cặn chiết methanol (430,0 g) Hòa với 2 lít nước, chiết với 1 lít n-hexane (3 lần), cất loại dung môi Cặn n-hexane Lớp nước (FMH, 51,7 g) Chiết với 1 lít ethyl acetate (3 lần), cất loại dung môi Cặn ethyl acetate Dịch nước (FME, 214,5 g) (FMW) CC, diaion HP-20, M/W (gradient) M/W-0/100 M/W-25/75 M/W-100/0 CC: Column chromatography M: methanol W: nước FMWA FMWB FMWC (28,8 g) (62,9 g) Hình 2.2. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu củ hà thủ ô đỏ FMWC (62,9 g) CC, silica gel Gradient, 100%D → 100%M FMWC2 FMWC5 FMWC6 FMWC7 (189,8 mg) (1,1 g) (5,0 g) (8,0 g) CC, silica gel CC,YMC-RP18 CC, silica gel H/E-5/1 FMWC4 CC, silica gel (1,2 g) A/W-1/1,5 D/M-6/1 D/M-6/1 FM1 CC, silica gel FMW5.1 FMW7.1 (90,4 mg) FMW6.2 D/M-7/1 CC, LH-20 CC,YMC-RP18 CC,YMC-RP18 M/W-1/1 FMW4.2 A/W-1/2 A/W-1/3 FMW4.1 (1,4 mg) FM3 CC,YMC-RP18 (8 mg) A/W-1/1,5 FMW6.2.A FM4 FMW7.1.A FMW7.1.B (4,5 mg) CC, LH-20 CC, LH-20 CC, silica gel FMW4.2.1 M/W-1/1,2 M/W-1/1 D/M-6/1 A: acetone CC, LH-20 FM8 D: dichloromethane M/W-1/1,2 FMW7.1.A.1 (6,8 mg) E: ethyl acetate FM5 FM6 H: hexane (12,8 mg) (5,4 mg) CC, silica gel FM2 M: methanol (370 mg) D/M/W-5/1/0,01 W: nước FM7 CC: column chromatography (6,0 mg) Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn FMWC mẫu củ hà thủ ô đỏ
7 FME (214,5 g) CC, silica gel Gradient, 100%H → 100%A FME1 FME2÷FME7 FME8 CC, silica gel H/A-4/1 FME8A FME8B CC, silica gel CC, silica gel D/M-16/1 D/M-16/1 FM9 FME8B1 (3,4 mg) CC, LH-20 M/W-1/1 CC: Column chromatography FM10 FME8B1A A: acetone (28,1 mg) D: dichloromethane CC, silica gel H: hexane H/A-1/1 M: methanol FM11 W: nước (90,8 mg) Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn ethyl acetate mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Như vậy, tiến hành phân lập mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang thu được tổng số 11 hợp chất sạch. Các hợp chất được kí hiệu từ FM1 đến FM11. 2.4. Hằng số vật lí và các dữ kiện phổ của các hợp chất 2.4.1. Hợp chất FM3: 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic acid 8-O-β-D- glucopyranoside (chất mới) Chất dạng bột màu vàng nhạt. Độ quay cực riêng [a]24 o 𝐷 = +23,4 (c = 0,05, CH3OH). HR-ESI-MS m/z 433,1110 [M+Na]+. Tính toán lí thuyết cho công thức C19H22NaO10, 433,1111. Công thức phân tử: C19H22O10. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,30 (3H, s, 3-CH3), 3,45 (1H, m, H-4′), 3,56 (1H, m, H-5′), 3,54 (1H, m, H-3′), 3,58 (1H, m, H-2′), 3,77 (1H, dd, J = 12,5, 5,5 Hz, Hb-6′), 3,88 (3H, s, OCH3), 3,96 (1H, dd, J = 12,5, 2,5 Hz, Ha-6′), 5,12 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 7,03 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 7,05 (1H, m, H-4). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 153,8 (C-1), 123,9 (C-2), 135,5 (C-3), 120,3 (C-4), 102,5 (C-5), 160,4 (C-6), 104,4 (C-7), 157,2 (C-8), 110,3 (C-9), 139,1 (C- 10), 171,0 (C-11), 55,9 (6-OCH3), 20,2 (3-CH3), 104,1 (C-1′), 74,9 (C-2′), 78,1 (C-3′), 71,3 (C-4′), 78,8 (C- 5′), 62,4 (C-6′). 2.4.2. Hợp chất FM4: 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (chất mới) Chất dạng bột màu vàng cam. Độ quay cực riêng [a]24 o 𝐷 = +12,6 (c = 0,05, CH3OH). HR-ESI-MS m/z 549,1578 [M+Na]+, tính toán lí thuyết cho công thức C24H30NaO13, 549,1584. Công thức phân tử: C24H30O13. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,28 (3H, s, 3-CH3), 2,60 (3H, s, CH3CO), 3,36 (2H, m, H-5″), 3,45 (1H, m, H-4′), 3,51 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-3′), 3,57 (1H, m, H-2′), 3,68 (1H, m, H-5′), 3,70 (1H, m, Hb-6′), 3,80 (1H, d, J = 9,5 Hz, Hb-4″), 4,01 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2″), 4,04 (1H, d, J = 9,5 Hz, Ha- 4″), 4,12 (1H, d, J = 9,5 Hz, Ha-6′), 5,05 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-1″), 5,07 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,72 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 6,91 (1H, s, H-4), 7,00 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 154,0 (C-1), 123,2 (C-2), 135,2 (C-3), 119,6 (C-4), 105,5 (C-5), 158,1 (C-6), 104,9 (C-7), 157,4
8 (C-8), 109,7 (C-9), 139,3 (C-10), 208,2 (CH3CO), 32,6 (CH3CO), 20,2 (3-CH3), 104,3 (C-1′), 74,9 (C-2′), 78,1 (C-3′), 71,5 (C-4′), 77,6 (C-5′), 68,6 (C-6′), 111,0 (C-1″), 78,1 (C-2″), 80,5 (C-3″), 75,1 (C-4″), 65,7 (C-5″). 2.4.3. Hợp chất FM1: Emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone) Chất dạng kết tinh hình kim màu vàng cam. ESI-MS m/z 269,0 [M-H]-. Công thức phân tử: C15H10O5. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,36 (3H, s, 3-CH3), 6,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,04 (2H, br s, H-4, 7), 7,37 (1H, br s, H-5). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 161,2 (C-1), 123,7 (C-2), 147,9 (C-3), 120,1 (C-4), 107,6 (C-5), 165,3 (C-6), 108,5 (C-7), 164,2 (C-8), 189,3 (C-9), 180,9 (C- 10), 134,8 (C-11), 108,6 (C-12), 113,0 (C-13), 132,5 (C-14), 21,2 (3-CH3). 2.4.4. Hợp chất FM2: 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-gluopyranoside Chất dạng bột vô định hình màu nâu. ESI-MS m/z 429,0 [M+Na]+. Công thức phân tử: C20H22O9. H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 3,85-3,44 (6H, m, 6H của phân tử đường), 4,53 (1H, d, J = 8,0 1 Hz, H-1″), 6,28 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-4), 6,79 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′), 6,64 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 7,47 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′), 6,95 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-β), 7,73 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-α). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 121,6 (C-1), 137,8 (C-2), 151,9 (C-3), 103,5 (C-4), 155,8 (C-5), 108,1 (C- 6), 133,6 (C-α), 130,8 (C-β), 130,0 (C-1′), 129,1 (C-2′), 116,4 (C-3′), 158,2 (C-4′), 116,4 (C-5′), 129,1 (C- 6′), 102,7 (C-1″), 75,4 (C-2″), 77,8 (C-3″), 70,7 (C-4″), 78,1 (C-5″), 62,0 (C-6″). 2.4.5. Hợp chất FM5: Pleuropyrone A Chất dạng bột màu vàng cam. ESI-MS m/z 419,1 [M+H]+. Công thức phân tử: C21H22O9. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,14 (3H, s, 2-CH3), 2,73 (3H, s, 5-CH3), 3,26 (1H, m, H-4′), 3,35 (2H, m, H-3′, 5′), 3,50 (1H, m, H-2′), 3,54 (1H, m, Hb-6′), 3,72 (1H, d, J = 11,0 Hz, Ha-6′), 5,05 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 6,18 (1H, s, H-2), 6,76 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 6,79 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-9), 7,26 (1H, s, H-6). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 156,0 (C-1b), 164,0 (C-2), 111,7 (C-3), 178,6 (C-4), 116,8 (C- 4a), 134,7 (C-5), 124,5 (C-6), 138,1 (C-6a), 102,8 (C-7), 158,9 (C-8), 102,4 (C-9), 156,2 (C-10), 107,8 (C- 10a), 19,1 (2-CH3), 22,9 (5-CH3), 100,6 (C-1′), 73,6 (C-2′), 77,0 (C-3′), 69,4 (C-4′), 76,9 (C-5′), 60,5 (C- 6′). 2.4.6. Hợp chất FM6: Physcionin (Physcion 8-β-D-glucopyranoside) Chất dạng bột màu vàng. ESI-MS m/z 469,1 [M+Na]+. Công thức phân tử C22H22O10. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,41 (3H, s, 3-CH3), 3,17 (1H, m, H-4′), 3,35 (1H, m, H-3′), 3,46 (2H, m, H-2′, Hb-6′), 3,73 (1H, dd, J = 10,0, 5,5 Hz, Ha-6′), 3,95 (3H, s, 6-OCH3), 5,16 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 7,17 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 7), 7,35 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5), 7,47 (1H, br s, H-4). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 161,6 (C-1), 124,2 (C-2), 147,1 (C-3), 119,3 (C-4), 106,5 (C-5), 164,7 (C-6), 107,3 (C-7), 160,6 (C-8), 186,4 (C-9), 181,8 (C-10), 136,3 (C-11), 114,4 (C-12), 114,4 (C-13), 132,0 (C-14), 21,4 (3-CH3), 56,0 (6-OCH3), 100,6 (C-1′), 73,2 (C-2′), 76,5 (C-3′), 69,8 (C-4′), 77,4 (C-5′), 60,7 (C-6′). 2.4.7. Hợp chất FM7: Benzyl gentiobioside Chất dạng bột màu trắng. ESI-MS m/z 431,2 [M-H]-. Công thức phân tử: C19H28O11. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 3,26 (2H, m, H-2′, 2″), 3,29 (1H, m, H-3′), 3,30 (2H, m, H-4″, 5″), 3,38 (1H, m, H-3″), 3,30 (1H, m, H-4′), 3,48 (1H, m, H-5′), 3,68 (1H, m, Hb-6″), 3,83 (1H, m, Hb-6′), 3,89 (1H, m, Ha- 6″), 4,19 (1H, dd, J = 11,5, 1,5 Hz, Ha-6′), 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 4,44 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 4,68 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-7), 4,94 (1H, d, J = 12,0 Hz, Ha-7), 7,28 (1H, br d, H-4), 7,34 (2H, br d, H-3, 5), 7,44 (2H, br d, H-2, 6). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 138,9 (C-1), 129,3 (C-2, 6), 129,2 (C-
9 3, 5), 128,7 (C-4), 72,0 (C-7), 103,3 (C-1′), 75,0 (C-2′, 2″), 77,9 (C-3′, 3″, 5″), 71,4 (C-4′), 77,0 (C-5′), 69,7 (C-6′), 104,8 (C-1″), 71,5 (C-4″), 62,6 (C-6″). 2.4.8. Hợp chất FM8: emodin-8-β-D-glucopyranoside Chất dạng bột màu vàng cam. ESI-MS m/z 455,0 [M+Na]+. Công thức phân tử C21H20O10. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,40 (3H, s, 3-CH3), 3,16 - 3,44 (4H, m, H của đơn vị đường), 3,52 (1H, dd, J = 11,5, 5,0 Hz, Hb-6′), 3,73 (1H, dd, J = 5,0 Hz, Ha-6′), 5,04 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 7,00 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,14 (1H, br s, H-7), 7,27 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5), 7,45 (1H, br s, H-4). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 161,6 (C-1), 124,1 (C-2), 146,7 (C-3), 119,1 (C-4), 108,4 (C-5), 164,1 (C-6), 100,8 (C-7), 161,1 (C-8), 186,3 (C-9), 182,1 (C-10), 136,4 (C-11), 113,0 (C-12), 114,4 (C-13), 132,0 (C- 14), 21,3 (3-CH3), 100,8 (C-1′), 73,2 (C-2′), 76,3 (C-3′), 69,4 (C-4′), 77,2 (C-5′), 60,5 (C-6′). 2.4.9. Hợp chất FM9: Resveratrol Chất dạng bột vô định hình màu vàng cam. ESI-MS m/z 229,1 [M+H]+. Công thức phân tử: C14H12O3. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-4), 6,47 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 6), 6,77 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′), 6,83 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-β), 6,99 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-α), 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 141,2 (C-1), 105,7 (C-2, 6), 159,6 (C-3, 5), 102,6 (C-4), 129,4 (C-α), 127,0 (C-β), 130,4 (C-1′), 128,7 (C-2′, 6′), 116,4 (C-3′, 5′), 158,3 (C-4′). 2.4.10. Hợp chất FM10: Torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside Chất dạng kết tinh hình kim màu vàng chanh. ESI-MS m/z 431,1 [M+Na]+. Công thức phân tử: C20H24O9. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,29 (3H, s, 3-CH3), 2,59 (3H, s, CH3CO), 3,46 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-4′), 3,52 (1H, m, H-5′), 3,56 (1H, m, H-2′), 3,58 (1H, m, H-3′), 3,77 (1H, dd, J = 1,0, 12,5 Hz, Hb-6′), 3,86 (3H, s, OCH3), 3,95 (1H, d, J = 1,0 Hz, Ha-6′), 5,10 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,81 (1H, br s, H-5), 7,00 (1H, s, H-4), 7,00 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 153,6 (C-1), 123,9 (C-2), 135,4 (C-3), 120,3 (C-4), 102,4 (C-5), 160,3 (C-6), 104,3 (C-7), 157,1 (C-8), 110,2 (C- 9), 139,0 (C-10), 208,2 (CH3CO), 32,5 (CH3CO), 55,9 (6-OCH3), 20,2 (3-CH3), 104,2 (C-1′), 74,8 (C-2′), 78,0 (C-3′), 71,2 (C-4′), 78,7 (C-5′), 62,3 (C-6′). 2.4.11. Hợp chất FM11: (+)-Catechin Chất dạng tinh thể màu trắng. ESI-MS m/z 289,1 [M-H]-. Công thức phân tử: C15H14O6. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz), H (ppm): 4,60 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-2), 4,00 (1H, m, H-3), 2,53 (1H, dd, J = 8,5, 16,5 Hz, Ha-4), 2,87 (1H, dd, J = 5,5, 16,0 Hz, Hb-4), 5,70 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 5,96 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8), 6,86 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 6,79 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,74 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6'). 13C- NMR (CD3OD, 125 MHz), C (ppm): 82,8 (C-2), 68,8 (C-3), 28,4 (C-4), 156,9 (C-5), 95,5 (C-6), 157,5 (C- 7), 96,3 (C-8), 157,8 (C-9), 100,8 (C-10), 132,2 (C-1'), 115,2 (C-2'), 146,2 (C-3'), 146,1 (C-4'), 116,1 (C- 5'), 120,0 (C-6'). 2.5. Kết quả thiết lập điều kiện phân tích cho hệ thống HPLC Trong số 11 hợp chất sạch đã phân lập được từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang, các chất sạch đảm bảo độ sạch và cung cấp đủ lượng chất cho quá trình định lượng được lựa chọn nhằm thiết lập quy trình định lượng trên thiết bị HPLC. Kết quả đã lựa chọn được 7 chất sạch bao gồm FM1, FM2, FM3, FM4, FM5, FM6 và FM8. Các chất này được sử dụng là chất tham chiếu cho quá trình định lượng. Các điều kiện HPLC được nghiên cứu bao gồm: thể tích bơm mẫu, cột sắc ký, bước sóng detector, pha động và thành phần pha động, thời gian lưu và độ tinh khiết chất phân tích và khảo sát hệ thống LC/MS.
10 Sau quá trình khảo sát thu được các kết quả sau: Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại các chất tham chiếu được trình bày trong bảng 2.2: Bảng 2.2. Bước sóng hấp thụ cực đại của các chất tham chiếu Kí hiệu chất FM1 FM2 FM3 FM4 FM5 FM6 FM8 Bước sóng (nm) 280 320 320 320 280 280 280 Các chất FM2, FM3 và FM4 hấp thụ cực đại tại bước sóng 320 nm; FM1, FM5, FM6 và FM8 hấp thụ cực đại tại bước sóng 280 nm. Để đảm bảo độ nhạy cho phép phân tích, lựa chọn hai bước sóng 280 nm và 320 nm để định lượng đồng thời bảy hợp chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ. Điều kiện chạy sắc kí: Cột tách sắc ký: cột XDB C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút Thể tích bơm mẫu: 1 µL Thành phần pha động: MeOH - nước (0,1% axit acetic), chạy hệ gradient như sau: Thời gian (phút) % MeOH % H2O (0,1% axit acetic) 0 30 70 35 100 0 40 100 0 Kết quả thời gian lưu và độ tinh khiết chất tham chiếu được trình bày trong bảng 2.3: Bảng 2.3. Kết quả thời gian lưu và độ tinh khiết các chất tham chiếu Kí hiệu chất Thời gian lưu (phút) Độ tinh khiết (%) FM2 12,7 ÷ 12,8 97,9 FM4 15,7 ÷ 15,8 96,8 FM5 16,4 ÷ 16,5 95,5 FM3 21,0 ÷ 21,1 95,2 FM8 24,3 ÷ 24,4 98,4 FM6 26,5 ÷ 26,6 96,2 FM1 35,3 ÷ 35,4 97,1 Độ sạch các chất tham chiếu đều đạt ≥ 95%. Vì vậy, các chất trên có độ sạch phù hợp làm chất chuẩn trong phép phân tích định lượng trên thiết bị HPLC. Pic ion giả phân tử được lựa chọn trong hệ LC/MS được trình bày trong bảng 2.4: Bảng 2.4. Pic ion giả phân tử các chất tham chiếu trên hệ thống LC/MS STT Chất phân tích Pic ion giả phân tử 1 FM1 269,0 [M-H]- 2 FM2 429,0 [M+Na]+ 3 FM3 433,1 [M+Na]+ 4 FM4 549,1 [M+Na]+ 5 FM5 419,0 [M+H]+ 6 FM6 469,1 [M+Na]+ 7 FM8 455,0 [M+Na]+ Trong quá trình phân tích mẫu, hệ thống MS phát hiện các chất nhờ pic ion giả phân tử tương ứng. Qua đó khẳng định tính chọn lọc của phương pháp phân tích.
11 2.6. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng Sử dụng các chất sạch tham chiếu đã được kiểm tra và đạt độ tinh khiết cần thiết pha dung dịch chuẩn. Chạy HPLC theo quy trình đã thiết lập thu được phương trình đường chuẩn định lượng cho từng chất tham chiếu, trình bày trong bảng 2.6: Bảng 2.6. Kết quả phương trình đường chuẩn định lượng 7 hợp chất TT Ký hiệu chất Phương trình đường chuẩn R2 1 FM1 y = 6,62295x - 35,495370 0,99990 2 FM2 y = 6,13790x + 3,965890 0,99995 3 FM3 y = 0,92796x + 2,408150 0,99991 4 FM4 y = 1,02181x + 0,786697 0,99994 5 FM5 y = 2,33173x + 6,822620 0,99995 6 FM6 y = 2,06170x + 9,318620 0,99976 7 FM8 y = 4,08608x + 21,567050 0,99991 2.7. Quy trình xử lí mẫu phân tích Mẫu dược liệu phân tích ở các dạng khác nhau được cắt nhỏ đến kích thước ≤ 3 mm rồi phơi khô tự nhiên. Cân chính xác 5 gam mẫu, chiết với 25 mL MeOH trong ống falcon 50 mL, đặt trong máy siêu âm 20 phút, lọc dịch chiết bằng giấy lọc thường chuyển vào bình định mức 100 mL. Chiết lặp lại 3 lần, thu tất cả dịch lọc chuyển vào bình định mức 100 mL, định mức bằng MeOH đến vạch. Dùng xilanh hút dịch chiết từ bình định mức 100 mL bơm qua màng lọc mẫu kích thước 0,45 µm. Dịch lọc được chuyển vào lọ chứa mẫu rồi đưa vào hệ thống HPLC. 2.8. Kết quả thẩm định phương pháp định tính, định lượng 2.8.1. Kết quả xác định tính chọn lọc của phương pháp Trong sắc ký lỏng sử dụng detector DAD, có thể xác định tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết của pic sắc kí. Độ tinh khiết của pic được xác định bằng cách so sánh phổ UV của pic phát hiện trên sắc ký đồ với pic của chất tham chiếu. Mặt khác, hệ thống HPLC thực nghiệm được kết nối với hệ thống MS. Do vậy độ chọn lọc của phương pháp còn được xác định thông qua việc so sánh phổ MS của chất phân tích với phổ MS của chất tham chiếu tương ứng. 2.8.2. Kết quả xác định LOD, LOQ Tiến hành phân tích mẫu chuẩn các chất tham chiếu ở nồng độ thấp gần giá trị nồng độ nhỏ nhất của đường chuẩn. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 10 lần, tính độ lệch chuẩn SD. Khi đó giá trị LOD và LOQ được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn SD. Tiến hành thí nghiệm phân tích với mẫu chuẩn các chất có nồng độ 10 µg/mL, kết quả xác định LOD và LOQ được trình bày trong bảng 2.7: Bảng 2.7. Kết quả xác định LOD và LOQ Ký hiệu Nồng độ LOD LOQ TT SD chất (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) 1 FM2 10 0,9498 0,5106 1,5474 2 FM4 10 0,4211 1,3600 4,1212 3 FM5 10 1,0128 1,4333 4,3435 4 FM3 10 0,4424 1,5736 4,7684
12 5 FM8 10 0,6187 0,4997 1,5143 6 FM6 10 0,4591 0,7349 2,2269 7 FM1 10 1,0240 6,6000 19,8000 Kết quả thực nghiệm cho thấy LOD và LOQ có giá trị nhỏ, giá trị LOD các chất đạt trong khoảng 0,4997 ÷ 6,6000 µg/mL, giá trị LOQ trong khoảng 1,51143 ÷ 19,8000 µg/mL. Các giá trị LOQ đều nhỏ hơn giá trị nồng độ nhỏ nhất của đường chuẩn chứng tỏ phương pháp định tính và định lượng đã thiết lập có độ nhạy cao. 2.8.3. Kết quả xác định độ chụm Độ chụm bao gồm độ lặp và độ tái lặp. Sử dụng các chất sạch tham chiếu, pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp 7 chất với các nồng độ khác nhau trong khoảng làm việc của đường chuẩn: 500 µg/ml; 125 µg/ml; 25 µg/ml. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần trên cùng một mẫu (mỗi lần bắt đầu từ cân mẫu chuẩn). Độ tái lặp được thực hiện trên 3 ngày thực nghiệm, mỗi ngày cách nhau 3 ngày. Tính độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Kết quả thực nghiệm cho thấy: các dung dịch thử của các chất với nồng độ 25 µg/mL có giá trị RSD nằm trong khoảng 0,5160 ÷ 3,4721%, nhỏ hơn 7,3%; các phép đo có nồng độ 125 µg/mL và 500 µg/mL có RSD trong khoảng 0,1215 ÷ 1,4881%, nhỏ hơn 5,3%. Điều này cho phép kết luận phương pháp định tính định lượng đồng thời 7 hợp chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ có độ tái lặp tốt, phù hợp yêu cầu của AOAC. 2.8.4. Kết quả xác định độ đúng Để đánh giá độ đúng phương pháp phân tích đã thiết lập, tiến hành thực nghiệm xác định độ thu hồi. Thí nghiệm xác định độ thu hồi được tiến hành trên mẫu thực, ký hiệu mẫu TT6. Cân chính xác 5,0 gam mẫu, Thêm chất chuẩn ở ba mức nồng độ là thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc. Nồng độ chuẩn thêm vào mẫu lần lượt là 25 µg/mL; 125 µg/mL và 500 µg/mL. Kết quả tính độ thu hồi mẫu R(%) dao động trong khoảng 90,3% đến 101,6%. Theo tiêu chuẩn AOAC, khi nồng độ các chất đạt khoảng 100 µg/mL, độ thu hồi yêu cầu trong khoảng 90% ÷ 107%; khoảng 80% ÷ 110% khi nồng độ chất thử đạt cỡ 10 µg/mL. Đối chiếu tiêu chuẩn của AOAC, độ thu hồi của các chất đều nằm trong khoảng cho phép. 2.9. Kết quả phân tích mẫu Mẫu sau khi được xử lí được đưa vào hệ thống HPLC-DAD-MS. Chạy HPLC mẫu theo quy trình đã thiết lập thu được các giá trị diện tích pic ứng với mẫu tương ứng. Nồng độ của các hoạt chất trong mẫu phân tích được tính dựa vào phương trình đường chuẩn và diện tích pic ứng với mỗi chất trong sắc ký đồ của từng mẫu. Nồng độ chất tham chiếu trong mẫu được tính theo công thức: C1 .V.10−3 100 C (mg⁄g) = G . Q (2.7) Trong đó: C1 là nồng độ chất tham chiếu tính theo đường chuẩn (µg/mL) G là khối lượng mẫu (g); V là thể tích mẫu, V = 100 mL; Q là độ sạch các chất tham chiếu (Bảng 2.3) . Các mẫu được tiến hành phân tích lặp lại 3 lần. Tiến hành đo mẫu ở các bước sóng hấp thụ cực đại thu được các giá trị diện tích pic tương ứng với các hợp chất định lượng. Từ phương trình đường chuẩn, tính được giá trị nồng độ chất tham chiếu. Kết quả hàm lượng các hợp chất có sự khác biệt giữa các mẫu trong đó mẫu thu hái tự nhiên thường cao hơn nhóm mẫu còn lại.
13 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ hà thủ ô đỏ Từ rễ hà thủ ô đỏ Hà Giang đã phân lập và xác định được cấu trúc của 11 hợp chất bao gồm 3 hợp chất anthraquinone (FM1, FM6, FM8); 4 hợp chất phenolic (FM2, FM7, FM9, FM11) và 4 hợp chất glycoside (FM3, FM4, FM5, FM10). Hợp chất FM3: 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic acid 8-O-β-D- glucopyranoside (chất mới) Hợp chất FM3 thu được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt. Dựa trên phổ HR-ESI-MS với sự xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 433,1110 [M+Na]+ (tính toán lí thuyết cho công thức C19H22NaO10: 433,1111). Kết hợp với phổ 13C-NMR xác định được công thức phân tử của hợp chất FM3 là C19H22O10, khối lượng phân tử M = 410. Phổ 1H-NMR của FM3 xuất hiện 3 tín hiệu proton vòng thơm trong đó có một proton tại [H 7,05 (1H, s, H-4)], hai proton ghép cặp meta tại [δH 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5) và 7,03 (2H, d, J = 2,0 Hz, H- 7)]. Cũng trên phổ 1H-NMR, tại vùng trường mạnh xuất hiện tín hiệu một nhóm methyl tại [δH 2,28 (3H, s, 3-CH3)], tín hiệu cao hơn các nhóm methyl thông thường nên dự đoán nhóm methyl này gắn trực tiếp với vòng thơm. Tín hiệu phổ proton của một nhóm methoxy tại [δH 3,88 (3H, s, 6-OCH3)], tín hiệu cao hơn các nhóm methoxy thông thường nên dự đoán nhóm methyl này gắn trực tiếp với vòng thơm. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR còn quan sát thấy tín hiệu của các proton thuộc vùng đường ở δH 3,44 ÷ 4,85 và tín hiệu của 1 proton anome tại [δH 5,12 (1H, d, H-1′]. Đơn vị đường glucose có cấu trúc β do giá trị hằng số tương tác lớn (J1,2 = 7,5 Hz). Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của FM3 cho thấy sự có mặt của 19 nguyên tử carbon, bao gồm một nhóm methoxy tại C 55,2; một nhóm methyl tại C 19,4; một nhóm methylene tại C 62,4; 4 nhóm methine tại C 71,3 74,9, 78,1, 78,8; và 8 nhóm carbon không chứa hydro tại C 110,3, 123,9, 135,5, 139,1, 153,8, 157,2, 160,4, 171,0. Phân tích dữ liệu phổ 1H- và 13 C-NMR của hợp chất FM3, đồng thời so sánh dữ liệu phổ với torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside cho thấy so với hợp chất tham khảo là torachrysone 8-O-β-D- glucopyranoside có sự tương đồng về cấu trúc ngoại trừ sự thay thế nhóm acetyl bằng nhóm cacboxylic (δC 171,0). Giá trị trên phổ 13C-NMR của C-11 là C 171,0, trong khi C 204,3 là giá trị phổ trong hợp chất torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside. Phân tích các tương tác trên phổ HSQC cho phép ta gán tín hiệu của proton liên kết trực tiếp với carbon. Cấu tạo của FM3 được làm sáng tỏ thêm bằng các phân tích trên phổ COSY. Trên phổ COSY, khung naphtalene được khẳng định bởi tương tác của proton H-4 (δH 7,05) và H-7 (δH 7,03) với H-5 (δH 6,84). Các tương tác trên phổ COSY giữa proton H-1′ (δH 5,12) với H-2′ (δH 3,58); H-2′ (δH 3,58) với H-3′ (δH 3,54); H-3′ (δH 3,54) với H-4′ (δH 3,45); H-4′ (δH 3,45) với H-5′ (δH 3,56); H-5′ (δH 3,56) với H-6′ (δH 3,77; 3,96) khẳng định sự có mặt của một đơn vị đường β-D-glucopyranoside. Tương tác HMBC giữa proton thuộc nhóm methyl (δH 2,30) và C-2 (δC 123,9)/C-3 (δC 135,5)/C-4 (δC 120,3) chứng minh vị trí của nhóm methyl này tại C-3. Tương tự, tương tác HMBC giữa nguyên tử H
14 trong nhóm methoxy (δH 3,88) với C-6 (δC 160,4) khẳng định vị trí nhóm methoxy tại C-6. Mặt khác, tương tác HMBC giữa H-1′ (δH 5,12) với C-8 (δC 157,2) khẳng định vị trí của đơn vị đường glucose tại C-8. Hình 3.7. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM3 Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất FM3 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM3 và hợp chất tham khảo C δCd,b * δCa,b δHa,c (độ bội, J, Hz) 1 150,9 153,8 - 2 123,0 123,9 - 3 136,8 135,5 - 4 118,8 120,3 7,05 s 5 102,7 102,5 6,84 d (2,0) 6 158,2 160,4 - 7 103,0 104,4 7,03 d (2,0) 8 155,3 157,2 - 9 108,5 110,3 - 10 133,6 139,1 - 11 204,3 171,0 - 6-OCH3 55,2 55,9 3,88 s 3-CH3 19,4 20,2 2,30 s 1′ 101,1 104,1 5,12 d (7,5) 2′ 73,3 74,9 3,58 m 3′ 76,1 78,1 3,54 m 4′ 69,8 71,3 3,45 m 5′ 77,7 78,8 3,56 m 6′ 60,5 62,4 3,77 dd (12,5, 5,5)
15 3,96 dd (12,5, 2,5) a đo trong CD3OD, b 125MHz, c 500MHz, d đo trong DMSO-d6, *δ dữ liệu phổ 13C-NMR của hợp chất torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside Mặt khác, để khẳng định cấu hình tuyệt đối của hợp chất FM3, sử dụng phương pháp thủy phân axit. Hợp chất FM3 được lấy 1 mg, hòa tan trong 1 ml dioxan / HCl 1 N (1: 1 v/v) và đun nóng ở 80°C trong 3 giờ. Dung dịch axit được trung hòa bằng bạc cacbonat và chiết bằng CH2Cl2, tách loại dung môi. Lớp nước được cô đặc đến khô bằng khí nitơ. Sau đó, hòa tan trong 0,1 mL pyridin, tiếp theo thêm 0,1 mL L-cystein metyl este hydroclorid 0,06 M trong pyridin. Sau khi đun nóng ở 60°C trong 2 giờ, thêm vào dung dịch 0,1 mL trimethylsilylimidazole, đun nóng ở 60°C trong 1,5 giờ nữa. Sản phẩm khô được hòa tan đồng thời bằng n-hexan và nước (mỗi loại 0,1 mL). Sử dụng lớp hữu cơ phân tích GC trên hệ thống GC Agilent 7890B sử dụng cột SPB-1 (0,25 mm × 30 m), máy dò FID, nhiệt độ cột 210°C, nhiệt độ kim phun 270°C, nhiệt độ detector 300°C, sử dụng khí mang He. D-glucose được phát hiện ở 14,15 phút. Từ những phân tích trên kết luận được hợp chất FM3 là 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2- naphthoic acid 8-O-β-D-glucopyranoside, một chất mới lần đầu tiên được công bố. Hợp chất FM4: 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (chất mới) Hợp chất FM4 thu được dưới dạng chất bột màu vàng cam. Trên phổ khối phân giải cao HR-ESI- MS xuất hiện pic ion giả phân tử m/z 549,1578 [M+Na]+ (tính toán lí thuyết cho công thức C24H30NaO13: 549,1584). Kết hợp với phổ 13C-NMR, công thức phân tử của hợp chất FM4 được xác định là C24H30O13, khối lượng phân tử M = 526. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất FM4 gợi ý đây là một phenolic glycoside, bao gồm hai proton ghép cặp meta, 1 nhóm methyl và một nhóm acetyl. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của FM4 và 6- hydroxymusizin 8-O-β-D-glucoside, cho thấy chúng tương tự nhau. Sự khác nhau giữa hai chất này là FM4 có thêm một đơn vị đường apiose. Ngoài ra phổ 1H-NMR của hợp chất FM4 còn xuất hiện tín hiệu hai proton anome tại δH 5,05 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-1″) và 5,07 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′) gợi ý cho hai đơn vị đường apiosyl và glucosyl tương ứng. Đơn vị đường glucose có cấu hình β do giá trị hằng số tương tác lớn (J1,2 = 7,5 Hz), và đơn vị đường apiose được xác định cấu hình α (J1,2 = 2,5 Hz). Phổ 13C-NMR và DEPT của FM4 cho thấy sự có mặt của 24 carbon, bao gồm một nhóm methyl tại C 20,2; một nhóm methyl của nhóm acetyl tại C 32,6; 3 nhóm methylene tại C 65,7, 68,6, 75,1; 10 nhóm methine tại C 71,5, 74,9, 77,6, 78,1, 78,1, 104,3, 104,9, 105,5, 119,6, 111,0; và 9 nguyên tử carbon không liên kết với hyđro tại C 80,5, 109,7, 123,2, 135,2, 139,3, 154,0, 157,4, 158,1, 208,2. Phân tích các tương tác trên phổ HSQC cho phép ta gán tín hiệu của proton liên kết trực tiếp với carbon. Các tương tác HMBC giữa H-1″ (δH 5,05) và C-6′ (δC 68,6), H-1′ (δH 5,07) và C-8 (δC 157,4) khẳng định đơn vị đường apiose được gắn vào vị trí C-6′ của đơn vị đường glucose và C-1′ của đơn vị đường gắn tại vị trí C-8 của khung naphtalene. Ngoài ra, tương tác HMBC giữa proton trong nhóm acetyl (δH 2,60) và C-2 (δC 123,2) chứng minh vị trí của nhóm acetyl tại C-2. Tương tác HMBC giữa proton trong nhóm methyl (δH 2,28) và C-3 (δC 135,2)/C-2 (δC 123,2)/C-4 (δC 119,6) chứng minh vị trí của nhóm methyl tại C- 3.
16 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM4 Hình 3.15. Phổ HMBC của hợp chất FM4 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM4 và hợp chất tham khảo C * δCd,b δCa,b δHa,c (độ bội, J, Hz) 1 151,1 154,0 - 2 123,2 123,2 - 3 136,9 135,2 - 4 118,6 119,6 6,91 s 5 102,4 105,5 6,72 d (2,0) 6 158,2 158,1 - 7 103,3 104,9 7,00 d (2,0) 8 155,1 157,4 - 9 108,7 109,7 - 10 133,6 139,3 - CH3CO 204,3 208,2 - CH3CO 32,2 32,6 2,60 s 3-CH3 19,4 20,2 2,28 s 8-O-β-D-glucopyranoside 1′ 101,2 104,3 5,07 d (7,5) 2′ 72,2 74,9 3,57 m 3′ 75,8 78,1 3,51 t (8,5) 4′ 69,9 71,5 3,45 m 5′ 74,4 77,6 3,68 m 6′ 63,3 68,6 4,12 d (9,5)
17 3,70 m 6′-O-β-D-apiofuranoside 1″ - 111,0 5,05 d (2,5) 2″ - 78,1 4,01 d (2,5) 3″ - 80,5 - 4,04 d (9,5) 4″ - 75,1 3,80 d (9,5) 5″ - 65,7 3,36 s a đo trong CD3OD, 125MHz, 500MHz, đo trong DMSO-d6, δ dữ liệu phổ 13C-NMR của hợp chất 6- b c d * hydroxymusizin 8-O-β-D-glucoside Mặt khác, để khẳng định cấu hình tuyệt đối của hợp chất FM4, sử dụng phương pháp thủy phân axit tương tự đối với FM3. Kết quả, pic tín hiệu của D-glucose và D-apiose được phát hiện lần lượt ở 14,15 phút và 4,61 phút. Từ những phân tích trên kết luận được hợp chất FM4 là 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranoside, một hợp chất mới lần đầu tiên được công bố. 3.2. Thiết lập quy trình định tính, định lượng hoạt chất trong hà thủ ô đỏ Các hợp chất trong thành phần hóa học dược liệu hà thủ ô đỏ được phân tích định tính và định lượng đồng thời trên hệ thống HPLC-MS. Bảy hợp chất trong mẫu được lựa chọn phân tích bao gồm: emodin (FM1), 2,3,4′,5-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-gluopyranoside (FM2), 6-methoxy-3-methyl-1,6,8- trihydroxy-2-naphthoic acid 8-O-β-D-glucopyranoside (FM3), 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranoside (FM4), pleuropyrone A (FM5), physcionin (FM6) và emodin 8-O-β-D- glucopyranoside (FM8). Hoạt chất THSG (FM2) là hoạt chất có nhiều hoạt tính có giá trị của hà thủ ô đỏ. Theo kết quả nghiên cứu, các hợp chất khác được phân lập từ hà thủ ô đỏ cũng có hoạt tính có giá trị. Kết quả đánh giá hoạt tính cho thấy các hợp chất FM1 và FM6 có tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh trên các dòng ung thư phổi ở người (H1299) và ung thư gan ở người (Hep3B). Hợp chất FM1 còn có tác dụng mạnh trên dòng tế bào ung thư phổi (A549). Như vậy, đánh giá đồng thời nhiều hợp chất trong thành phần hóa học của hà thủ ô đỏ là cần thiết. Phân tích đồng thời nhiều hoạt chất sẽ góp phần đánh giá toàn diện về thành phần và chất lượng dược liệu trong cùng một quy trình định lượng. Đồng thời tiết kiệm chi phí cũng như thời gian phân tích. Vì vậy, xây dựng quy trình định lượng đồng thời và tiêu chuẩn dược liệu trong Dược điển đối với các hoạt chất này là rất cần thiết. Qua đó, căn cứ vào tiêu chuẩn và phương pháp trong Dược điển, các mẫu dược liệu sẽ được kiểm soát và đánh giá chất lượng. Căn cứ trên lượng chất sạch phân lập được từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang cũng như sự phù hợp về điều kiện phân tích HPLC 7 hợp chất đã được lựa chọn phân tích định tính và định lượng đồng thời. Các hợp chất định lượng bao gồm: FM2, FM4, FM5, FM3, FM8, FM6 và FM1. Các hợp chất trong mẫu được phân tích định tính dựa trên các thông số: thời gian lưu, phổ DAD và giá trị phổ MS trong hệ thống kết nối LC-MS. Đồng thời bảy hoạt chất này cũng được định lượng đồng thời dựa trên mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic thu được. Kết quả phương pháp định tính và định lượng đồng thời các hoạt chất trong mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ đã được thiết lập. Các chất tham chiếu sử dụng làm chất chuẩn được phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang. Do đó, chủ động được nguồn chất chuẩn sử dụng trong phân tích, khắc phục được những hạn chế trong việc tìm chất chuẩn sử dụng trong phân tích định lượng các hợp chất hữu cơ. Chất chuẩn sau khi
18 phân lập được xác định độ sạch bằng phân tích HPLC. Độ tinh khiết của các chất tham chiếu được sử dụng trong quá trình tính hàm lượng các hoạt chất trong mẫu nhằm đảm bảo tính chính xác các kết quả phân tích. Thời gian phân tích một mẫu tiến hành trong 40 phút, là khoảng thời gian phù hợp, tiết kiệm chi phí so với một số công bố trước đây. So sánh với phương pháp định lượng đã công bố của Y. Tao (thời gian phân tích là 55 phút) hay D.Q Han (thời gian phân tích là 45 phút), thời gian phân tích mẫu đã được rút ngắn. Do vậy thực hiện quy trình phân tích đã thiết lập giúp tiết kiệm thời gian và dung môi. Mặt khác, quy trình phân tích được thực hiện trên cột sắc ký pha đảo XDB C18 kích thước 150 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm là loại cột khá phổ biến cho quá trình thực nghiệm. Hệ dung môi lựa chọn cơ bản dễ tìm MeOH - nước (0,1% axit acetic), chạy hệ gradient đảm bảo quá trình phân tách chất. Tín hiệu chất trong quá trình định tính và định lượng được đo trên detector DAD ở bước sóng hấp thụ cực đại của mỗi chất, do đó đảm bảo độ nhạy cho phép phân tích. Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm kiểm soát chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ đã được nêu trong Dược điển Trung Quốc, Dược điển Hồng Kông và Dược điển Mỹ. Trong Dược điển Trung Quốc hàm lượng các hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ cũng được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng liệu năng cao. Trong đó, tiêu chuẩn đối với dược liệu được đưa ra là hàm lượng anthraquinone kết hợp không dưới 0,1% và hàm lượng THSG không dưới 1% tính theo dược liệu khô. Dược điển Hồng Kông chỉ đề cập đến tiêu chuẩn đối với THSG (FM2), dược liệu đạt tiêu chuẩn khi hàm lượng hoạt chất này ≥ 2,2% tính theo dược liệu khô. Trong Dược điển Mỹ, dược liệu đạt tiêu chuẩn khi được xác định hàm lượng anthraquinone kết hợp và hoạt chất THSG (FM2). Hai thành phần này được định lượng riêng bằng phương pháp HPLC với hệ dung môi: nước 0,1% axit formic và acetonitrile. Theo tiêu chuẩn này, hàm lượng hoạt chất THSG không nhỏ hơn 1,5% tính trên dược liệu khô. Như vậy các chuyên luận Dược điển đề cập trên đều quan tâm đến hàm lượng hoạt chất THSG trong dược liêu hà thủ ô đỏ. Trong khi đó chuyên luận Dược điển Việt Nam IV vẫn chưa có quy trình định lượng hoạt chất này. Quy trình định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ lần đầu tiên được đưa vào Dược điển Việt Nam V. Trong đó, hoạt chất định lượng là anthraquinone kết hợp gồm emodin và physcion với hệ dung môi là methanol - dung dịch axit phosphoric 0,1% (80:20), không có quy trình phân tích THSG. Theo chuẩn Dược điển Việt Nam V, hàm lượng anthraquinone kết hợp không dưới 0,1% tính theo dược liệu khô. 3.3. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu để kết quả phân tích đáng tin cậy. Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Phương pháp phân tích định tính định lượng đồng thời bảy hoạt chất trong loài hà thủ ô đỏ được thiết lập thuộc nhóm phương pháp không tiêu chuẩn. Vì vậy, thẩm định phương pháp đã xây dựng là cần thiết. Các tiêu chí đã thẩm định bao gồm: tính chọn lọc; LOD và LOQ; độ chụm (độ lặp và độ tái lặp) và độ đúng. Các kết quả thẩm định là tin cậy và thuộc giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn AOAC. Trong quá trình phân tích, các chất được định tính bằng phổ UV, thời gian lưu và phổ khối lượng MS. Phổ UV của các chất trong mẫu có độ trùng khít cao so với các chất chuẩn tham chiếu. Trên hệ thống LC, pic sắc ký của các chất được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu: FM2 (12,7 - 12,8) phút; FM4 (15,7 - 15,8) phút; FM5 (16,4 - 16,5) phút; FM3 (21,0 - 21,1) phút; FM8 (24,3 - 24,4) phút; FM6
19 (26,5 - 26,6) phút; FM1 (35,3 - 35,4) phút. Mặt khác, trong quá trình phân tích mẫu, sự có mặt của các chất còn được khẳng định qua thông tin trên phổ MS. Hệ thống MS phát hiện được pic ion giả phân tử của các chất tại thời điểm tương ứng. Điều này khẳng định phương pháp phân tích đã thiết lập có độ chọn lọc cao. Bảy hợp chất định tính và định lượng trong hà thủ ô đỏ có giá trị LOD và LOQ nhỏ: giá trị LOD dao động trong khoảng 0,4997 ÷ 6,6000 µg/mL; giá trị LOQ dao động từ 1,5143 ÷ 19,8000 µg/mL. Được xác định bằng thí nghiệm trên mẫu chuẩn có nồng độ nhỏ lặp lại 10 lần, các giá trị LOQ đều nhỏ hơn giá trị nhỏ nhất của đường chuẩn. Do đó khẳng định thêm độ tin cậy đối với đường chuẩn đã xây dựng. Sử dụng phương pháp phân tích đã thiết lập giúp định tính định lượng đồng thời bảy hoạt chất đạt độ nhạy cao. Độ chụm của phương pháp bao gồm độ lặp và độ tái lặp cũng đã được thẩm định. Kết quả thẩm định dựa trên các phép xác định trên chất tham chiếu với 5 lần lặp. Qua đó xử lí số liệu, tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD), từ đó đối chiếu với tiêu chuẩn AOAC nhằm đánh giá độ chụm của phương pháp. Kết quả thực nghiệm cho thấy, khi xác định độ lặp, giá trị RSD của các chất đạt 0,0671 ÷ 3,4528 %. Khi xác định độ tái lặp, giá trị RSD của các chất đạt 0,1215 ÷ 3,4721 %. So sánh với tiêu chuẩn AOAC, giá trị RSD của các chất đều thuộc giới hạn cho phép. Do vậy phương pháp định tính, định lượng đã thiết lập có độ chụm cao. Mặt khác phương pháp còn được thẩm định về độ đúng thông qua độ thu hồi. Độ thu hồi được xác định trên mẫu thực thêm chuẩn và được tiến hành lặp 6 lần. Kết quả thực nghiệm cho thấy giá trị thu hồi các chất đạt khoảng 90,3% đến 101,6%. So sánh với tiêu chuẩn AOAC ở các mức nồng độ tương ứng, giá trị độ thu hồi xác định được nằm trong giới hạn cho phép. Do đó khẳng định phương pháp định tính định lượng bảy hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ đạt yêu cầu về độ đúng. Như vậy, phương pháp định tính, định lượng đồng thời bảy hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ đã được thẩm định các thông số: tính chọn lọc; LOD và LOQ; độ chụm (độ lặp và độ tái lặp) và độ đúng. Các thông số được thẩm định đều đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn AOAC. Qua đó khẳng định phương pháp đã xây dựng có độ tin cậy, có thể áp dụng phân tích mẫu nhằm định lượng các hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ. 3.4. Hàm lượng hoạt chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Các mẫu phân tích được tiến hành xử lí mẫu tương tự nhau bao gồm gia công, chiết siêu âm, thời gian và số lần chiết như nhau bằng methanol rồi định mức thành 100 mL thu được dung dịch mẫu phân tích. Phân tích lần lượt các mẫu trên thiết bị HPLC theo quy trình đã xây dựng thu được sắc ký đồ và giá trị diện tích pic tương ứng. Dựa vào đường chuẩn đã lập và công thức tính, từ đó tính được hàm lượng (mg/g) các hợp chất trong mẫu. Kết quả hàm lượng hoạt chất trong mẫu được trình bày trong bảng 3.12: Bảng 3.12. Hàm lượng các hoạt chất trong 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ (mg/g) Chất Hàm lượng chất phân tích (mg/g) phân tích HG CU CE TT1 TT2 TT3 TT4 TT5 FM2 55,010±0,505 1,170±0,025 2,160±0,058 0,507±0,038 2,285±0,024 3,285±0,020 1,698±0,021 2,418±0,029 FM4 0,173±0,014 0,020±0,001 0,025±0,001 + 0,043±0,003 0,038±0,001 0,035±0,001 0,039±0,001 FM5 0,117±0,004 + + - - + + - FM3 0,398±0,006 + + - - - - - FM8 3,183±0,020 - + + + + + + FM6 1,404±0,028 + - + + + + + FM1 0,438±0,027 + + - + + 0,547±0,031 + (+): Có phát hiện nhưng không định lượng được (-): Không phát hiện
20 Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng các hoạt chất có sự chênh lệch giữa mẫu thu hái tự nhiên và nhóm các mẫu lưu hành trên thị trường. Hầu hết các hợp chất trong mẫu thu hái tự nhiên đều cao hơn các mẫu còn lại kể cả mẫu hà thủ ô đỏ dạng củ bán trên thị trường. Điển hình với FM2, một hoạt chất quan trọng với nhiều hoạt tính có giá trị của hà thủ ô đỏ, độ chênh lệch lên tới 110 lần. Một số thành phần khác như FM3, FM5, FM6 và FM8 chỉ định lượng được đối với mẫu Hà Giang, không định lượng được với nhóm các mẫu còn lại. FM3 là chất mới lần đầu tiên được phân lập từ hà thủ ô đỏ. Điều này gợi ý có thể sử dụng FM3 làm chất chỉ thị đặc trưng cho loại dược liệu này. Căn cứ vào tiêu chuẩn dược liệu trong các chuyên luận dược điển, các mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ được đánh giá như sau (Bảng 3.13): Bảng 3.13. Hàm lượng (%) THSG và anthraquinone kết hợp trong 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Chất Hàm lượng (%) Đánh giá Anthraquinone Dược điển Dược điển Dược điển Dược điển THSG kết hợp (FM1 + Trung Hồng Việt Nam Mỹ Mẫu FM6 + FM8) Quốc Kông V HG 5,50 0,50 Đạt Đạt Đạt Đạt CU 0,12 - KĐ KĐ KĐ KĐ CE 0,22 - KĐ KĐ KĐ KĐ TT1 0,05 - KĐ KĐ KĐ KĐ TT2 0,23 - KĐ KĐ KĐ KĐ TT3 0,33 - KĐ KĐ KĐ KĐ TT4 0,17 0,05 KĐ KĐ KĐ KĐ TT5 0,24 - KĐ KĐ KĐ KĐ (-): Không xác định KĐ: Không đạt Đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ theo chuẩn Dược điển cho thấy hầu hết các mẫu dược liệu không đạt tiêu chuẩn theo chuẩn Dược điển Việt Nam cũng như chuẩn dược điển Trung Quốc, Hồng Kông và dược điển Mỹ. Chỉ duy nhất mẫu HG, hàm lượng các hợp chất trong dược liệu đảm bảo đạt chuẩn theo các chuẩn dược điển. Như vậy, có thể nhận định mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ tự nhiên có chất lượng tốt hơn các mẫu dược liệu khác trên thị trường Việt Nam. Điều này có thể do vùng đất Hà giang có đặc điểm địa hình, địa chất và khí hậu phù hợp với loại cây này. Nằm trong vùng khí hậu cận nhiệt đới ẩm nhưng do địa hình cao nên khí hậu Hà Giang mang nhiều sắc thái ôn đới. Địa hình và khí hậu vùng này thích hợp cho trồng các loại cây dược liệu trong đó có hà thủ ô đỏ. Theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Hà Ly, hàm lượng các hợp chất THSG, emodin và physcion trên một số mẫu thuộc tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Hà Nội và Hưng Yên là rất khác nhau. Qua đó khẳng định các vùng trồng khác nhau có hàm lượng các hợp chất khác nhau, đặc biệt các mẫu trồng ở vùng núi cao có hàm lượng THSG cao hơn vùng đồng bằng. Mặt khác, theo kết quả phân tích, các mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ chế có hàm lượng các hoạt chất thấp hơn mẫu Hà Giang thậm chí thấp hơn các mẫu thị trường. Hoạt chất FM2 và FM4 được định lượng trên mẫu này có hàm lượng thấp, còn lại các hoạt chất khác thì chỉ phát hiện được nhưng không định lượng