zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh β- galactosidase từ sáp ong

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Báo xấu

1
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của nghiên cứu "Tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh β- galactosidase từ sáp ong" là tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic sinh βgalactosidase cao, dùng trong các chế phẩm probiotics, góp phần sản xuất ra sản phẩm sữa có hàm lượng lactose thấp sao cho mọi người đều có thể sử dụng được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh β- galactosidase từ sáp ong

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN LACTIC SINH β- GALACTOSIDASE TỪ SÁP ONG Nguyễn Thị Vân, Lớp K60B, Khoa Sinh học GVHD: TS. Trần Thị Thúy Tóm tắt: Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn hữu ích, được dùng chủ yếu trong các chế phẩm probiotics để cải tạo khu hệ vi sinh vật đường ruột ở người và động vật nuôi. Nhằm mục đích tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme β- galactosidase ứng dụng tạo chế phẩm probiotics, chủng vi khuẩn lactic LT12 đã được phân lập và tuyển chọn từ sáp ong ruồi (Apis andreniformis) tự nhiên ở tỉnh Điện Biên. Chủng vi khuẩn lactic LT12 có khả năng sinh enzyme β-galactosidase cao và ổn định, phổ kháng khuẩn rộng, ức chế được cả vi khuẩn G+ (Bacillus sp.), cả vi khuẩn G- (Salmonella sp. and E. coli). Chủng LT12 sinh enzyme β- galactosidase nội bào, hiệu suất sinh enzyme cao nhất sau 36 giờ nuôi cấy tĩnh (đạt 0,45 IU/mL) ở 30ºC trong môi trường MRS dịch thể. Enzyme β-galactosidase từ chủng này có hoạt tính tối ưu ở 30°C, pH 7. Nghiên cứu thay thế 25 – 50% (v/v) môi trường MRS dịch thể bằng nước chiết bắp cải, thu được hoạt tính enzyme khả quan (0,3 – 0,37 IU/mL). Do vậy, nước chiết bắp cải có thể được sử dụng để thay thế một phần môi trường MRS để giảm chi phí sản xuất. Từ khóa: β-galactosidase, vi khuẩn lactic, sáp ong, probiotics, lactose. I. MỞ ĐẦU Sữa là loại thực phẩm giàu protein và khoáng chất, đóng vai trò quan trọng trong chế độ dinh dƣỡng của mọi lứa tuổi. Khoảng 75% dân số thế giới, trong đó có khoảng 46% ngƣời ở độ tuổi 50 trở lên, gặp tình trạng bất dung nạp lactose hay còn gọi là thiểu năng chuyển hóa lactose (khi uống sữa, xuất hiện hiện tƣợng đầy hơi, chƣớng bụng, nôn, tiêu chảy). Lactose (β-D-galactopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranose) là loại đƣờng đôi (disaccharide) có trong sữa của hầu hết các động vật có vú. Sau khi sử dụng sữa, lactose đƣợc enzyme  -galactosidase trong ruột non của ngƣời xúc tác thủy phân thành glucose và galactose. Khả năng tổng hợp β-galactosidase ở ngƣời bị mất dần khi qua tuổi cai sữa. Kết quả là đại đa số ngƣời trƣởng thành và ngƣời già trên thế giới đều mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactose. Vì vậy, sản phẩm sữa cho những ngƣời không hấp thụ đƣợc lactose thƣờng phải đƣợc xử lí với enzyme β-galactosidase. β-galactosidase là một trong những enzyme đƣợc ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp chế biến cũng nhƣ trong nghiên cứu sinh học phân tử, đặc biệt là trong công nghiệp sữa. Enzyme β-galactosidase có thể đƣợc thu nhận từ động vật, thực vật cũng nhƣ vi sinh vật. Trong đó, β-galactosidase đƣợc sản xuất từ vi khuẩn lactic có năng suất và hoạt tính cao, ổn định hơn hẳn so với enzyme từ động vật và thực vật. Xuất phát từ thực tế trên, căn cứ vào khả năng nghiên cứu của cơ sở chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh β-galactosidase từ sáp ong”. Mục đích của nghiên cứu này là tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic sinh β- galactosidase cao, dùng trong các chế phẩm probiotics, góp phần sản xuất ra sản phẩm sữa có hàm lƣợng lactose thấp sao cho mọi ngƣời đều có thể sử dụng đƣợc. 147
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 II. NỘI DUNG 1. Nội dung nghiên cứu - Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ sáp ong. - Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh β-galactosidase cao. - Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và sinh tổng hợp β-galactosidase từ chủng vi sinh vật đã tuyển chọn. 2. Kết quả nghiên cứu 2.1. Kết quả phân lập Từ 8 mẫu sáp ong đƣợc thu tại các địa điểm khác nhau, chúng tôi đã phân lập đƣợc 61 chủng vi khuẩn lactic, 17 chủng nấm men và 4 chủng vi khuẩn có bào tử. 2.2. Kết quả tuyển chọn Từ 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc, tiến hành tuyển chọn sơ bộ các chủng có khả năng sinh enzyme β-galactosidase bằng chỉ thị X-gal. Kết quả tuyển chọn đƣợc 12 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme β-galactosidase: LT27, LT28, LT32, LT45, LT48, LT10, LT15, LT24 LT12, LT13, LT14, LT31. Căn cứ vào thời gian xuất hiện màu xanh của khuẩn lạc, để tiến hành xác định hoạt độ enzyme -galactosidase của 6 chủng có hoạt tính cao nhất trên cơ chất ONPG (Bảng 1). Bảng 1. Hoạt độ enzyme -galactosidase tổng số của 6 chủng tuyển chọn Tên chủng IU/mL LT10 0,04 LT12 0,26 LT13 0,13 LT14 0,13 LT31 0,23 LT24 0,08 Trong số 6 chủng trên, chủng vi khuẩn lactic LT12 có hoạt tính enzyme β- galactosidase mạnh nhất. Vì vậy, chọn chủng này cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.3. Xác định vị trí của enzyme β-galactosidase trong tế bào chủng vi khuẩn lactic LT12 Bảng 2. Vị trí của enzyme β- galactosidase trong tế bào chủng LT12 Vị trí enzyme Hoạt tính tổng số (IU/mL) Dịch ngoại bào 0% Xoang chu chất 0% Nội bào 67,96% Thành, màng tế bào 32,04% 148
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Kết quả ở Bảng 2 cho thấy: enzyme β-galactosidase của chủng LT12 đƣợc sinh tổng hợp nội bào, không có mặt ở xoang chu chất và dịch ngoại bào. Kết quả này phù hợp với các báo cáo của các tác giả khác về enzyme β-galactosidase của vi khuẩn lactic [5, 7, 9]. 2.4. Một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn lactic LT12 đƣợc tuyển chọn Tiến hành đánh giá đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lí, sinh hóa của chủng LT12 sau 24 giờ nuôi cấy ở 30°C trên môi trƣờng MRS dịch thể hoặc trên thạch đĩa. Kết quả thể hiện ở Bảng 3. Bảng 3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng LT12 Các chỉ tiêu của chủng LT12 Đặc điểm Hình dạng Que, cặp 1. Tế bào Nhuộm Gram G+ Hình dạng Tròn, lồi Màu sắc Trắng sữa 2. Khuẩn lạc Kích thƣớc khuẩn lạc, sau 48 giờ Đƣờng kính khuẩn lạc (d): nuôi cấy trên môi trƣờng MRS 1 - 1,5 mm 3. Sinh bào tử - 4. Hoạt tính catalase - 5. Khả năng sinh khí từ glucose + Bacillus subtilis + 6. Phổ ức chế với các Escherichia coli + VSV kiểm định Salmonella typhimurium + Lactobacillus plantarum - Chú thích: - : không; + : có Hình 1. Hình ảnh khuẩn lạc và hình ảnh tế bào của chủng vi khuẩn lactic LT12 Kết quả ở Bảng 4 cho thấy: Ở pH 4,5, chủng LT12 sinh trƣởng mạnh nhất. Ở dải pH từ 5 đến 8, chủng LT12 sinh axit mạnh (pH ban đầu đến pH cuối giảm từ 3,33 đến 1,02). Ở 149
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 pH 7, chủng LT12 cho hoạt tính enzyme lớn nhất, sau đó giảm dần. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hải Yến [2]: ở pH 7, hoạt tính enzyme của chủng BK16 lớn nhất, đạt 360,69 mU/mL và tác giả Nguyễn Thị Vân Linh và cộng sự [1] trong nghiên cứu Thu nhận và tinh sạch β-galactosidase từ Lactobacillus acodophilus: Ở pH 7-7,5 hoạt tính của enzyme là cao nhất, enzyme thô sau khi tinh sạch đạt 1,534 IU/mL. Theo Shaikh SA và cộng sự, ở pH 7, nấm Rhizomucor sp cũng cho hoạt tính enzyme cao nhất. 2.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, khả năng sinh axit và hoạt độ enzyme β-galactosidase của chủng LT12 Bảng 4. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, khả năng sinh axit và hoạt độ enzyme β-galactosidase của chủng LT12 pH pH cuối OD620 Số lƣợng tế bào Hoạt tính tổng số ban đầu tƣơng ứng IU/mL (x109) 3,5 3,41 3,071 ±0,003 1,86 0,02 ±0,008 4 3,67 4,931 ±0,013 2,98 0,12 ±0,017 4,5 3,87 5,603 ±0,007 3,38 0,44 ±0,019 5 3,98 5,533±0,002 3,34 0,25 ±0,003 5,5 4,1 4,614±0,011 2,79 0,33 ±0,002 6 4,09 3,915±0,004 2,36 0,15 ±0,019 6,5 4,27 4,262 ±0,009 2,57 0,33 ±0,006 7 4,35 3,633 ±0,012 2,19 0,47 ±0,017 7,5 4,48 3,442 ±0,006 2,09 0,38 ±0,018 8 4,67 3,572 ±0,017 2,16 0,37 ±0,020 Hình 2. Phổ ức chế của chủng LT12 với các VSV kiểm định 150
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, khả năng sinh axit và hoạt độ enzyme  -galactosidase của chủng LT12 OD620, pH cuối Hoạt tính tổng số (IU/ml) 7.0 0.5 6.0 0.4 5.0 0.3 4.0 3.0 OD OD620620 0.2 2.0 pH cuối 0.1 1.0 Hoạt tính tổng số 0.0 0.0 (IU/ml) 20 30 40 50 60 Nhiệt độ (°C) Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, khả năng sinh axit và hoạt độ enzyme của chủng LT12 Kết quả biểu diễn ở hình 3 cho thấy: Ở các nhiệt độ khác nhau, quá trình sinh tổng hợp enzyme gắn liền với quá trình sinh trƣởng của chủng LT12. Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme là 30°C, sau đó giảm dần khi nhiệt độ tăng, ngoài 45°C khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme giảm đáng kể. 2.7. Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp β-galactosidase của chủng LT12 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase của chủng LT12 (Hình 4) cho thấy: quá trình sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase tỉ lệ thuận với quá trình sinh trƣởng của chủng LT12 trong sƣốt thời gian nghiên cứu. Trong khoảng từ 2 giờ đến 10 giờ, cùng với sự tăng nhanh sinh khối tế bào là sự giảm nhanh pH của dịch nuôi (pH từ 6,21 xuống còn 4,42). Sau 16 giờ, quá trình sinh trƣởng trong dịch nuôi đi vào giai đoạn ổn định, sự tăng trƣởng chậm dần và dần đạt trạng thái cân bằng, pH của dịch nuôi giảm chậm và gần nhƣ không đổi trong suốt thời gian còn lại. Quá trình sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase tăng nhanh và đạt cực đại tại thời điểm 28 giờ, sau đó giảm dần. Enzyme β-galactosidase của chủng LT12 đƣợc sinh tổng hợp trong suốt pha cân bằng và đạt cực đại ở cuối pha cân bằng. Vì vậy, cần phải thu hoạch enzyme β-galactosidase trƣớc thời điểm 36 giờ là hiệu quả nhất. Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ kết quả nghiên cứu khác về thời gian sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase của các chủng vi khuẩn lactic đã đƣợc các tác giả khác báo cáo [1, 2]. 151
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 OD620 Hình 4. Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase của chủng LT12 2.8. Ảnh hưởng của các môi trường thay thế đến sinh trưởng, khả năng sinh axit và hoạt độ enzyme của chủng LT12 Sau 24 giờ nuôi cấy ở 30°C trên môi trƣờng MRS dịch thể (pH 7) và các môi trƣờng thay thế, chúng tôi thu đƣợc kết quả ở Bảng 5. Kết quả bảng 5 cho thấy: Ở môi trƣờng MRS, chủng LT12 sinh trƣởng mạnh nhất. Trong các môi trƣờng thay thế với mục đích giảm giá thành thì môi trƣờng nƣớc chiết bắp cải cho thấy chủng LT12 phát triển mạnh nhất. Chính vì thế, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sự ảnh hƣởng của các tỉ lệ môi trƣờng thay thế (MRS: bắp cải) đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme -galactosidase của chủng LT12. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 6. Bảng 5. Ảnh hưởng của các môi trường thay thế đến sinh trưởng, khả năng sinh axit và hoạt độ enzyme  -galactosidase của chủng LT12 Môi trƣờng MRS Bắp cải Giá đỗ Cải ngọt Hành pH cuối 4,47 3,86 4,34 4,26 4,58 OD620 4,481 0,903 0,701 0,038 0,679 IU/mL 0,41 0,08 0,06 0,03 0,05 Bảng 6. Ảnh hưởng tỉ lệ môi trường đến đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của chủng LT12 Tỉ lệ môi trƣờng OD620 pH cuối Hoạt tính tổng số (IU/mL) 100% bắp cải 0,87 ± 0,01 3,85 ± 0,01 0,073 ± 0,007 75% bắp cải: 25% MRS 2,27 ± 0,01 4,10 ± 0,01 0,024± 0,004 50% bắp cải : 50% MRS 3,15 ± 0,01 4,27±0,01 0,302 ± 0,013 25% bắp cải : 75% MRS 4,08 ± 0,01 4,35± 0,02 0,301 ± 0,005 100% MRS 4,28 ± 0,01 4,44 ± 0,02 0,373 ± 0,001 152
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Số liệu của bảng 6 cho thấy: Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme của chủng LT12 là tốt nhất trên môi trƣờng MRS dịch thể. Tuy nhiên, ở các thí nghiệm trên môi trƣờng thay thế: 50% bắp cải: 50% MRS, 25% bắp cải: 75% MRS hoạt tính enzyme thu đƣợc (~ 0,30 IU/mL), không khác biệt nhiều so với trong môi trƣờng 100% MRS (0,37 IU/mL) nên có thể đƣợc sử dụng để thay thế môi trƣờng 100% MRS để giảm giá thành sản xuất enzyme. Môi trƣờng 25% bắp cải: 75% MRS cũng giúp chủng vi khuẩn lactic LT12 sinh trƣởng khá tốt (OD620 ~ 4,1) so với môi trƣờng 100% MRS (OD620 ~ 4,3) nên cũng có thể đƣợc sử dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic từ chủng vi khuẩn lactic LT12. III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ các mẫu sáp ong thu đƣợc, phân lập đƣợc 61 chủng vi khuẩn lactic và từ đó tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic LT12 có khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme β- galactosiadse tốt. Khả năng sinh enzyme của chủng LT12 là tốt nhất sau 36 giờ nuôi cấy (0,45 IU/mL) và trong điều kiện môi trƣờng MRS dịch thể, pH = 7 và nhiệt độ là 30oC. Chúng tôi cũng tìm đƣợc môi trƣờng thay thế 25% bắp cải: 75% MRS làm tiền đề cho việc sản xuất enzyme β-galactosiadse với giá thành rẻ hơn. 2. Kiến nghị Chủng vi khuẩn lactic LT12 và enzyme β-galactosidase của chủng này có triển vọng tốt trong công nghiệp sữa và tạo chế phẩm probiotics. Chủng này cần đƣợc tiếp tục nghiên cứu sâu (định loại, lên men sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase, thử nghiệm trên động vật và ngƣời, …) theo định hƣớng tạo chế phẩm probiotics. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Thị Vân Linh, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Bích Lam, Thu nhận và tinh sạch -Galactosidase từ Lactobacillus acodophilus, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 15, số T3, 2012. [2] Nguyễn Thị Hải Yến, Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzyme - galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16, Đồ án tốt nghiệp, CNSHA-K44, 5-11, 16-21, 27-30. [3] Chang B-S., Mahoney R. R., Factors affecting thethermostability of β-galactosidase (Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) in milk: a quantitative study, Journal of Dairy Research 56, 785-792, 1989. [4] Emanuel V, Adrian V, Ovidiu P, Gheorghe C., Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders, African Journal of Biotechnology, Vol. 4 (5), 403-408, 2005. [5] Fatma Isık U., Production of -galactosidase using lactic acid bacteria and optimisation of fermentation parameters, A Thesis Submitted to the Graduate School of Engineering and Science of Izmir Institute of Technology in Partial Fulfilment of Requyrements for the Degree of MASTER OF SCIENCE in Biotechnology, 2007. 153
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 [6] Furlan S.A., Schneider A.L.S., Merkle R., Jonas MFC. & Jonas R., Formulation of a lactose-free, low-cost culture medium for the production of β- D galactosidase by Kluyveromyces marxianus, Biotechnology Letters 22, 589-593, 2000. [7] Greenberg N. A., Wilder T., Mahoney R. R., Studies on the thermostability of lactase (Streptococcus thermophilus) in milk and sweet whey, Journal of Dairy Research 52, 439-449, 1985. [8] Mahoney R.R., Galactosyloligosaccharides formation during lactose hydrolysis, Food Chemistry, 63, 147-154, 1998. [9] Montanari1 G., Zambonelli1 C., Grazia L., Benevelli M., Chiavar C., Release of - galactosidase from Lactobacilli, Food technol. Biotechnol, 38 (2), 129-133, 2000. [10] Thi Thuy Tran, Gashaw M., Bo M., Rajni H., Kaul, A thermostable phytase from Bacillus sp. MD2: cloning,expression and high-level production in Escherichia coli, J Ind Microbiol Biotechnol, 279-287, 2009. 154

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.