Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br />
<br />
ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG XÁC ĐỊNH<br />
TÍNH ĐỒNG NHẤT, TÍNH KHÁC BIỆT VÀ TÍNH ỔN ĐỊNH<br />
CỦA LÚA PHỤC VỤ CHO KHẢO NGHIỆM DUS<br />
Lưu Minh Cúc, Lưu Thị Ngọc Huyền,<br />
Lê Huy Hàm<br />
Viện Di truyền Nông nghiệp<br />
<br />
SUMMARY<br />
(Application of biotechnology in identifying the distinctness, uniformity,<br />
stability of rice varieties to aid for DUS testing)<br />
This study aimed at developing procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of<br />
rice varieties to aid for DUS testing. The collection of 261 lines/varieties, which are abundant about<br />
sources, desease resistance, tolerance to biotic and abiotic stresses, were used in screening. Using the<br />
information from published data about DUS testing on rice in country around the world like China, Brazil,<br />
India..., walk along 12 rice chromosomes, 557 markers were selected. The use of those markers to<br />
screen with the large numbers of rice varieties were carried out. A strategy of upside down conical in<br />
many steps of screening was applied. At last, a reference set of DNA markers were selected. This set was<br />
including 30 markers. Procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to<br />
aid for DUS testing were developed. These procedures are tightly suitable to current DUS testing<br />
regulations. In addtion, a software namely DUS-DFP, with the DNA fingerprint data of 180 rice varieties<br />
base on 30 reference markers, was developed for applying all the results of this study in DUS testing<br />
purpose.<br />
Keywords: biotechnology, distinctness, uniformity, stability, DUS testing, rice.<br />
<br />
I. ĐẶT VẤN ĐỀ *<br />
Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Quốc tế về<br />
Bảo vệ Giống cây trồng mới (International<br />
Union for the Protection of New Varieties of<br />
Plants), các cây trồng mới được chọn tạo phải<br />
trải qua khâu kiểm nghiệm theo tiêu chí DUS<br />
(bao gồm khảo nghiệm tính khác biệt distinctness, tính đồng nhất - uniformity và tính<br />
ổn định - stability). Trong 10 năm gần đây, mỗi<br />
năm Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm giống, sản<br />
phẩm cây trồng Quốc gia thường gặp phải tình<br />
trạng (5 - 10 trường hợp mỗi năm) các giống<br />
đưa ra khảo nghiệm có các đặc điểm hình thái<br />
(thỉnh thoảng cả đặc điểm hóa sinh) khó phân<br />
biệt. Trong một số trường hợp, giống cây trồng<br />
của các tác giả khác nhau hoặc được nhập nội có<br />
tên gọi khác nhau, nhưng về mặt hình thái lại rất<br />
giống nhau, gây ra những tranh cãi khó giải<br />
quyết. Câu hỏi đặt ra là thực chất chúng thuộc<br />
một giống hay các giống khác nhau? Các tiêu<br />
chí khảo nghiệm DUS truyền thống dựa trên 62<br />
đặc điểm hình thái và hóa sinh cho thấy chưa đủ<br />
Người phản biện: TS. Lã Tuấn Nghĩa<br />
<br />
cơ sở để phân biệt các giống với nhau. Điều này<br />
gây nhiều khó khăn và cản trở trong việc xác<br />
minh bản quyền về giống cây trồng. Những tiến<br />
bộ gầy đây trong công nghệ sinh học nói chung<br />
và sinh học phân tử thực vật nói riêng đã có<br />
nhiều đóng góp tích cực không chỉ trong việc<br />
chọn tạo ra những giống cây trồng mới mà còn<br />
giúp phân biệt các đặc điểm di truyền của các bộ<br />
giống mới được chọn tạo hoặc giống nhập nội.<br />
Cho đến nay, nhiều nước trên thế giới sử dụng<br />
hệ thống khảo nghiệm DUS dựa trên cơ sở các<br />
đặc điểm hình thái và hóa sinh. Tuy nhiên, một<br />
số quốc gia đã bắt đầu áp dụng phương pháp<br />
ADN dùng cho khảo nghiệm DUS (Navraj và<br />
cs., 2009). Đối với công tác khảo nghiệm DUS<br />
ở nước ta, việc xây dựng một qui trình giám<br />
định giống chính xác ở mức độ phân tử là một<br />
việc làm hết sức cần thiết. Góp phần vào công<br />
tác khảo nghiệm DUS giống lúa nhằm xác định<br />
tính đúng giống, cũng như để tránh khỏi những<br />
tranh cãi, đồng thời bảo hộ bản quyền tác giả,<br />
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng<br />
công nghệ sinh học trong xác định tính đồng<br />
nhất, tính ổn định và tính khác biệt của lúa phục<br />
vụ cho khảo nghiệm DUS.<br />
251<br />
<br />
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br />
<br />
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
2.1. Vật liệu<br />
- Tập đoàn 261 giống lúa thu thập<br />
- 40 giống lúa để đánh giá DUS<br />
- 180 giống lúa để lập cơ sở dữ liệu<br />
- 19 giống lúa điển hình của Trung tâm Khảo<br />
nghiệm.<br />
- 19 giống lúa giống nhau theo cặp trong<br />
khảo nghiệm DUS năm 2010- 2012<br />
- Tổng số 557 chỉ thị phân tử đã dùng để<br />
khảo sát lập bộ chỉ thị tham chiếu<br />
- Các vật tư hoá chất sinh học phân tử<br />
chuyên dụng.<br />
2.2. Phương pháp nghiên cứu<br />
- Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp<br />
CTAB cải tiến (của Phòng thí nghiệm Di truyền<br />
học, Trường Đại học Gent, Bỉ).<br />
- Phương pháp PCR (Michael and Simon<br />
2006).<br />
- Điện di gel polyacrylamide biến tính và<br />
không biến tính (PTN IRRI-Phillipine).<br />
- Thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành<br />
theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính<br />
đồng nhất và tính ổn định của giống lúa 10TCN<br />
554-2002.<br />
- Các biện pháp kỹ thuật khác được tiến hành<br />
theo Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và<br />
giá trị sử dụng giống lúa 10TCN 558-2002.<br />
- Xử lý số liệu thu được bằng phân tích trên<br />
phần mềm POPGEN 1.31 và NTSYS 2.1, Power<br />
Marker 3.0.<br />
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
3.1. Nghiên cứu xác định nguồn vật liệu và<br />
thiết lập bộ chỉ thị tham chiếu<br />
Đề tài đã thu thập được tập đoàn 261<br />
dòng/giống lúa để sử dụng trong đề tài nhằm<br />
sàng lọc tìm kiếm các alen có thể có trên các<br />
giống lúa đối với các chỉ thị được sử dụng trong<br />
nghiên cứu.<br />
Bước đầu tiên, nghiên cứu tiến hành khảo sát<br />
261 giống lúa thu thập từ nhiều nguồn khác nhau<br />
đối với 100 chỉ thị gồm 81 chỉ thị SSR rải rác<br />
trên 12 NST có số lượng từ 3-8 alen và 19 chỉ thị<br />
thiết kế khi nghiên cứu vùng bảo thủ của các<br />
252<br />
<br />
promoter tập trung vào các cis-element hay chính<br />
là trình tự điều khiển để nhân tố phiên mã bám<br />
vào và điều hòa biểu hiện gene và các EST ở lúa.<br />
Mở rộng phạm vi tìm kiếm, bước tiếp theo<br />
được tiến hành với 152 chỉ thị InDel marker<br />
được thiết kế dựa trên sự so sánh trình tự hệ gen<br />
của giống lúa Indica 93-11 và giống lúa Japonica<br />
Nipponbare, có thể xác định được sự đa hình từ<br />
các đột biến thêm/bớt (insertion/delection) trong<br />
hệ gen lúa. Đây chính là những chỉ thị đa hình<br />
cao và hoạt động tốt được sàng lọc từ 756 chỉ thị<br />
STS nằm trên toàn bộ hệ gen lúa với khoảng cách<br />
2-3 cM/chỉ thị phân bố tương đối đều trên 12<br />
NST của lúa. Sản phẩm nhân bản của đoạn ADN<br />
từ các chỉ thị này có thể chứa ít nhất 5% đoạn<br />
chèn-xóa khác nhau của kích thước các băng<br />
nhận được (trong khoảng từ 100-400bp). Những<br />
chỉ thị này có thể phân biệt rất tốt những sự khác<br />
biệt giữa các giống lúa mới được tạo ra bằng lai<br />
tạo, đột biến, phân biệt giữa các giống lúa thuộc<br />
loài phụ Indica và Japonica... Để thực hiện tốt<br />
hơn công việc sàng lọc tìm kiếm chỉ thị của đề<br />
tài, chúng tôi đã tìm kiếm, tiếp cận thêm các<br />
thông tin về chỉ thị phân tử, chọn lọc thông tin,<br />
tiến hành thu thập và lọc cơ sở dữ liệu, từ đó đề<br />
tài đã sử dụng thêm các chỉ thị trên 12 NST, dọc<br />
theo bản đồ genome của lúa, đã chọn được thêm<br />
hơn 300 chỉ thị SSR đã cho kết quả hoạt động tốt<br />
từ các nghiên cứu được tham khảo, đã được sử<br />
dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu<br />
sự khác biệt, lập bản đồ, đánh giá DUS... trên các<br />
nghiên cứu trong và ngoài nước, cho băng ADN<br />
rõ ràng để sàng lọc chỉ thị đa hình cao cho bộ chỉ<br />
thị tham chiếu.<br />
Nghiên cứu được tiến hành trên tổng số 557<br />
chỉ thị SSR với 261giống để sàng lọc tìm chỉ thị<br />
cho đa hình cao trên tập đoàn giống lúa phong<br />
phú. Chỉ những chỉ thị cho băng vạch rõ ràng và<br />
có dấu hiệu cho đa hình sẽ được chọn cho bước<br />
sàng lọc tiếp theo. Kích thước của các alen đối<br />
với những chỉ thị cho băng vạch ADN rõ nét và<br />
kích thước băng phù hợp được ghi nhận lại để<br />
chọn lựa, loại bỏ dần những chỉ thị không phù<br />
hợp. Các locus SSR được sử dụng cho mục đích<br />
xác định cá thể phải thoả mãn được một số yêu<br />
cầu nhất định. Thứ nhất, các locus SSR đó phải<br />
có mức độ đa hình cao (nhiều alen), điều này<br />
giúp các nhà phân tích chỉ cần sử dụng số lượng<br />
locus tối thiểu đã đạt được độ tin cậy cao trong<br />
mỗi lần giám định. Thứ hai, các locus SSR đó<br />
phải có độ dài trung bình từ 85 - 400 bp, để có<br />
thể dễ dàng thực hiện phản ứng PCR và thao tác<br />
nhuộm phát hiện băng ADN trên gel<br />
<br />
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br />
<br />
polyacrylamide. Thứ ba, các locus SSR được sử<br />
dụng để phân tích phải nằm trên các NST khác<br />
nhau để đảm bảo cho tính độc lập của từng locus.<br />
Thứ tư, các locus SSR nằm trên những vùng liên<br />
quan đến hoạt động sống của cơ thể. Thứ năm,<br />
các chỉ thị cho kết quả tốt, rõ nét, thuận lợi cho<br />
sử dụng, dễ phân biệt trên gel polyacrylamide.<br />
Bộ chỉ thị tham chiếu được chọn lựa khi hội tụ<br />
đầy đủ các đặc điểm như yêu cầu ở trên.<br />
Cơ sở khoa học để tính toán sự khác biệt<br />
trong việc xác định số lượng và chỉ thị cho bộ chỉ<br />
thị tham chiếu: Mỗi kiểu gen (genotype) cây nhị<br />
bội mang 2 alen đối với từng locus. Giả sử tần<br />
suất xuất hiện tất cả các alen trong 1 quần thể<br />
ngẫu nhiên là bằng nhau, đối với cây lúa là cây tự<br />
<br />
thụ phấn (mỗi cặp alen là đồng hợp tử), số tổ hợp<br />
các cặp alen sẽ bằng tích của số alen của từng<br />
locut khảo sát (Riêng đối với cây thụ phấn chéo<br />
là cây dị hợp tử, số tổ hợp các cặp alen sẽ lớn<br />
hơn gấp nhiều lần so với cây tự thụ phấn).<br />
Bộ chỉ thị sơ bộ gồm 5 locus: RM11: 5<br />
alen; RM21: 6 alen; RM163: 6alen; RM 481:<br />
12 alen; RM3412:11 alen. Nếu sử dụng cả 5<br />
locus trên thì số tổ hợp cặp alen sẽ bằng 5 6 <br />
6 12 11 = 23.760 tổ hợp. Hay nói một cách<br />
khác, nếu sử dụng bộ chỉ thị bao gồm 5 locus<br />
trên, ta có thể phân biệt được 23.760 mẫu lúa,<br />
khác nhau ít nhất bởi 1 cặp alen.<br />
<br />
Bảng 1. Danh sách các chỉ thị trong bộ chỉ thị tham chiếu<br />
TT<br />
<br />
Chỉ thị<br />
<br />
A<br />
<br />
Bộ chỉ thị sơ bộ<br />
<br />
NST<br />
<br />
Số alen<br />
<br />
Kích thước alen (số bp)<br />
<br />
1<br />
<br />
RM11<br />
<br />
7<br />
<br />
5<br />
<br />
120-125-132-136-140<br />
<br />
2<br />
<br />
RM21<br />
<br />
11<br />
<br />
6<br />
<br />
125-128-132-137-150-156<br />
<br />
3<br />
<br />
RM163<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
<br />
130-135-140-153-160-170<br />
<br />
4<br />
<br />
RM481<br />
<br />
7<br />
<br />
12<br />
<br />
124-132-139-149-154-158-172-177-182-192-210-224<br />
<br />
1<br />
<br />
11<br />
<br />
148-150-154-155-160-163-165-167-168-182-190<br />
<br />
5<br />
<br />
RM3412<br />
<br />
B<br />
<br />
Bộ chỉ thị tham chiếu chính thức: bao gồm 5 chỉ thị của bộ chỉ thị sơ bộ và 15 chỉ thị khác (từ 6-20)<br />
<br />
6<br />
<br />
RM1<br />
<br />
1<br />
<br />
6<br />
<br />
80-89-92-105-122-125<br />
<br />
7<br />
<br />
RM5<br />
<br />
1<br />
<br />
5<br />
<br />
105-110-115-118-122<br />
<br />
8<br />
<br />
RM6<br />
<br />
2<br />
<br />
4<br />
<br />
142-150-156-165<br />
<br />
9<br />
<br />
RM17<br />
<br />
12<br />
<br />
6<br />
<br />
150-154-160-175-180-185<br />
<br />
10<br />
<br />
RM25<br />
<br />
8<br />
<br />
6<br />
<br />
128-132-134-140-142-145<br />
<br />
11<br />
<br />
RM206<br />
<br />
5<br />
<br />
8<br />
<br />
125-127-130-135-145-152-160-178<br />
<br />
12<br />
<br />
RM215<br />
<br />
9<br />
<br />
5<br />
<br />
96-100-103-106-109<br />
<br />
13<br />
<br />
RM333<br />
<br />
10<br />
<br />
6<br />
<br />
170-175-178-180-189-200<br />
<br />
14<br />
<br />
RM3252<br />
<br />
1<br />
<br />
7<br />
<br />
162-165-167-170-174-200-205<br />
<br />
15<br />
<br />
RM3843<br />
<br />
4<br />
<br />
4<br />
<br />
165-170-175-182<br />
<br />
16<br />
<br />
RM7097<br />
<br />
3<br />
<br />
5<br />
<br />
165-167-172-176-179<br />
<br />
17<br />
<br />
R4M13<br />
<br />
4<br />
<br />
4<br />
<br />
172-188-200-218<br />
<br />
18<br />
<br />
MADS3<br />
<br />
6<br />
<br />
4<br />
<br />
192-222-238-246<br />
<br />
19<br />
<br />
SO1160<br />
<br />
1<br />
<br />
4<br />
<br />
170-175-187-210<br />
<br />
20<br />
<br />
S11033<br />
<br />
11<br />
<br />
6<br />
<br />
162-165-170-175-178-180<br />
<br />
C<br />
<br />
Bộ chỉ thị mở rộng: 10 chỉ thị<br />
<br />
21<br />
<br />
RM19<br />
<br />
12<br />
<br />
5<br />
<br />
190-202-210-225-227<br />
<br />
22<br />
<br />
RM223<br />
<br />
8<br />
<br />
5<br />
<br />
152-154-160-165-172<br />
<br />
23<br />
<br />
RM341<br />
<br />
2<br />
<br />
7<br />
<br />
156-160-166-166-175-192-206<br />
<br />
24<br />
<br />
RM3486<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
<br />
215-221-225-230-250-253<br />
<br />
25<br />
<br />
RM5758<br />
<br />
10<br />
<br />
5<br />
<br />
96-100-103-106-109<br />
<br />
26<br />
<br />
RM10825<br />
<br />
1<br />
<br />
4<br />
<br />
82-87-92-100<br />
<br />
27<br />
<br />
RM17954<br />
<br />
5<br />
<br />
7<br />
<br />
150-162-167-170-175-180-184-195-200<br />
<br />
28<br />
<br />
RM26063<br />
<br />
11<br />
<br />
6<br />
<br />
112-122-130-134-138-143<br />
<br />
29<br />
<br />
MADS8<br />
<br />
1<br />
<br />
3<br />
<br />
150-175-200<br />
<br />
30<br />
<br />
EST20<br />
<br />
11<br />
<br />
4<br />
<br />
187-196-213-218<br />
<br />
253<br />
<br />
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br />
<br />
Tổng số các alen của chỉ thị tham chiếu<br />
chính thức là 120 alen. Nếu sử dụng 20 chỉ thị<br />
của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức, ta sẽ phân<br />
biệt được 1,32434 1015 mẫu giống khác nhau<br />
bởi ít nhất 1 cặp alen. Nếu tính thêm cả bộ chỉ thị<br />
mở rộng ta sẽ có 172 alen, kích thước từ 80-253 bp.<br />
Khi đó nếu sử dụng cả 30 chỉ thị trên thì sẽ phân<br />
biệt được 1,40169 1022 mẫu giống khác nhau<br />
bởi ít nhất 1 cặp alen.<br />
Số lượng các alen đối với từng locut sẽ thay<br />
đổi tùy thuộc vào tập đoàn giống nghiên cứu.<br />
Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi đã tìm và xác<br />
định được các alen như bảng 1. Các đồng nghiệp,<br />
tác giả khác khi sử dụng bộ chỉ thị này có thể tự<br />
cập nhật thêm số liệu.<br />
3.2. Thiết lập và thử nghiệm qui trình<br />
Quy trình được nghiên cứu xây dựng dựa<br />
trên nguyên tắc về sự phù hợp giữa chỉ tiêu DUS<br />
với sự kiểm tra chỉ thị ADN như sau:<br />
- Chỉ tiêu khác biệt: Phân tích một số lượng<br />
nhất định các locus chỉ thị ADN cho phép thử<br />
nghiệm kiểu gen quan tâm có khác với các kiểu<br />
gen đã biết trước hay không và đồng thời xác<br />
định khoảng cách di truyền giữa chúng.<br />
- Chỉ tiêu đồng nhất: Kiểu gen đồng nhất di<br />
truyền cần phải có phổ ADN giống nhau đối với<br />
từng locus chỉ thị ADN.<br />
- Chỉ tiêu ổn định: Hạt giống của một kiểu<br />
gen cụ thể thu được ở các năm khác nhau thì phải<br />
có phổ ADN của các locus chỉ thị ADN giống hệt<br />
nhau và ổn định.<br />
Việc thử nghiệm, xây dựng quy trình khảo<br />
nghiệm DUS bằng chỉ thị phân tử cũng phải phù<br />
hợp với các tiêu chí của khảo nghiệm DUS bằng<br />
hình thái và hóa sinh hiện hành, bao gồm đánh<br />
giá tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định.<br />
Đối với quy phạm khảo nghiệm DUS hiện hành,<br />
phương pháp chủ yếu đánh giá tính đồng nhất<br />
<br />
căn cứ vào tỷ lệ cây khác dạng của tất cả cây trên<br />
ô thí nghiệm.<br />
Căn cứ vào báo cáo kết quả khảo nghiệm<br />
DUS tại Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm, giống<br />
khảo nghiệm được xem là đồng nhất nếu có từ 13 cây khác dạng trong số 1000 cây thí nghiệm.<br />
Như vậy khi phân tích 300-500 cây của một<br />
giống đối với bộ chỉ thị tham chiếu, nếu chỉ phát<br />
hiện thấy từ 1-2 sự khác biệt về alen thì có nghĩa<br />
là biến động về alen trong cùng một giống tương<br />
đương với biến động kiểu hình.<br />
Để kiểm chứng và hài hòa giữa phân tích<br />
ADN và phân tích các tính trạng hình thái, chỉ<br />
tiêu sinh hóa, trong quá trình lập quy trình, đề tài<br />
đã tiến hành khảo sát các nhóm giống bao gồm:<br />
nhóm giống có trên 3 cây khác dạng/1000 cây,<br />
nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000 cây;<br />
nhóm giống không có cây khác dạng nào.<br />
Mỗi nhóm giống tiến hành phân tích sự khác<br />
biệt về alen đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham<br />
chiếu. Khảo sát từ 2-5 giống trong mỗi nhóm,<br />
mỗi giống phân tích 480 cây khác nhau để kiểm<br />
chứng cơ sở khoa học và phân tích bằng xác suất<br />
thống kê, tìm sự phù hợp giữa kiểm tra bằng kiểu<br />
hình và đánh giá bằng kiểu gen. Các giống lúa<br />
được gieo trồng theo đúng kỹ thuật đánh giá<br />
DUS theo thí nghiệm hàng-bông tại Trung tâm<br />
Khảo nghiệm: Chọn ngẫu nhiên 50 bông trong số<br />
100 bông tác giả gửi đến. Mỗi bông cấy 2 hàng<br />
(2 lần nhắc lại), hàng cách hàng 20cm, cây cách<br />
cây 15cm, mỗi hàng 25 cây.<br />
Kết quả khảo sát 480 cây của mỗi giống cho<br />
thấy, nhóm giống có trên 3 cây khác dạng/1000<br />
cây có sự sai khác về alen rất lớn khi khảo sát với<br />
các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu (từ 30-60<br />
cây đối với 5-10 chỉ thị). Điều này được ghi nhận<br />
trên 480 cây của giống Nếp Nhiệt đới và giống<br />
Hương thơm số 1. Phân tích các chỉ tiêu DUS<br />
năm 2012 cũng cho thấy hai giống này có trên 3<br />
cây khác dạng/1000 cây quan sát.<br />
<br />
Bảng 2. Danh sách các giống dùng trong thử nghiệm ADN để lập quy trình<br />
Nhóm<br />
Nhóm 1: Giống có nhiều hơn 3 cây khác<br />
dạng/1000 cây trong đánh giá các tính trạng<br />
hình thái<br />
Nhóm 2: Giống có ít hơn 3 cây khác dạng/1000<br />
cây trong đánh giá các tính trạng hình thái<br />
<br />
Nhóm 3: Giống không có cây khác dạng/1000<br />
cây trong đánh giá các tính trạng hình thái<br />
<br />
254<br />
<br />
Tên giống<br />
<br />
Số cây có sai khác về alen<br />
<br />
Basmati 370<br />
<br />
60<br />
<br />
HT8<br />
<br />
10<br />
<br />
Hương thơm số 1<br />
<br />
40<br />
<br />
Việt thơm 8<br />
<br />
10<br />
<br />
Nếp Nhiệt đới<br />
<br />
15<br />
<br />
Nếp Lang Liêu<br />
<br />
3<br />
<br />
NH92<br />
<br />
5<br />
<br />
TB2<br />
<br />
3<br />
<br />
Thảo dược Vĩnh Hòa<br />
<br />
2<br />
<br />
RS<br />
<br />
0<br />
<br />
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br />
<br />
Hình 1. Đánh giá các cây lúa của giống Nếp Nhiệt đới đối với chỉ thị RM3412, có 10 cây cho alen<br />
khác biệt với những cây khác<br />
A. Cây số 1-96; B. Cây số 97-192; C. Cây số 193-288; D. Cây số 289-384. E. Cây số 385-480.<br />
<br />
Kết quả phân tích 480 cây của từng giống<br />
trong nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000<br />
cây cho thấy có sự sai khác về alen của 10-15 cây<br />
đối với 3-7 chỉ thị. Nhóm giống không có cây<br />
khác dạng nào cũng vẫn có từ 1-5 cây có sự sai<br />
khác về alen đối với 1-3 chỉ thị trong bộ chỉ thị<br />
đem phân tích. Như vậy là biến động về alen chỉ<br />
thị phân tử lớn hơn biến động kiểu hình của<br />
giống. Điều này có thể được giải thích như sau:<br />
Các chỉ thị ADN là trung tính, không nhất thiết<br />
liên quan đến biểu hiện kiểu hình, vì thế biến<br />
động alen trong cùng 1 giống lớn hơn biến động<br />
kiểu hình.<br />
Từ những kết quả trên, để phù hợp với tiêu<br />
chuẩn khảo nghiệm tính đồng nhất trong khảo<br />
nghiệm DUS, với độ nhậy = 0,80 đến 0,90 và α =<br />
0,05; nghiên cứu cần tối thiểu 50 đối tượng để<br />
ước tính R2 ≥ 0,23; hay tối thiểu 100 để ước tính<br />
R2 ≥ 0,12.<br />
Khi khảo sát các giống trong quá trình thử<br />
nghiệm phương pháp, từ kết quả 261 giống thử<br />
nghiệm ban đầu, đến những giống có từ nhiều<br />
đến không có cây khác dạng trong phân tích<br />
ADN đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham<br />
chiếu, kết quả thực nghiệm đã chứng tỏ mức độ<br />
khác biệt bên trong của cùng một giống tối đa là<br />
5 nhóm. Đối với 5 chỉ thị chọn ra dùng cho bộ<br />
chỉ thị sơ bộ, kết luận này đạt độ tin cậy ở mức α<br />
= 0,05 tương ứng với quy định trong quy phạm<br />
khảo nghiệm.<br />
Kết luận này cũng tương tự như kết luận của<br />
các nhà khoa học Ucraina khi đưa ra các nguyên<br />
tắc để xác định tính đồng nhất và độ khác biệt<br />
bên trong của một giống đối với cây lúa mì.<br />
<br />
3.3. Quy trình xác định giống lúa thuần bằng<br />
sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS<br />
* Phạm vi áp dụng<br />
Áp dụng tại các cơ sở có điều kiện về cơ sở<br />
vật chất, nguồn nhân lực và được sự cho phép<br />
của Nhà nước.<br />
* Đối tượng áp dụng<br />
Quy trình này áp dụng cho các giống lúa<br />
thuần nhằm hỗ trợ cho công tác khảo nghiệm<br />
DUS một cách chính xác và hiệu quả hơn.<br />
* Các bước của quy trình<br />
Bước 1: Xác định độ đồng nhất của giống<br />
1. Tách chiết ADN tổng số của 50 cây/giống<br />
2. Làm phản ứng PCR với 5 chỉ thị của bộ<br />
chỉ thị đánh giá sơ bộ RM11, RM21, RM163,<br />
RM481, RM3412.<br />
3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên<br />
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với<br />
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo<br />
4. Ghi nhận kết quả.<br />
5. Phân tích kết quả: Giống đồng nhất khi<br />
các cá thể có sự đồng nhất về alen đối với cả 5<br />
chỉ thị nghiên cứu.<br />
Bước 2. Kiểm tra độ khác biệt bên trong của<br />
giống<br />
1. Khi giống không đồng nhất về alen ở bước 1,<br />
chia mẫu thành các nhóm có các thành phần alen<br />
khác nhau.<br />
255<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
