Ứng dụng kỹ thuật PCR tìm gen DYZ1 để xác định NST Y cho các bệnh nhân chưa rõ giới tính

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

69
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

ở người và động vật có vú thì nhiễm sắc thể Y là một trong những nhiễm sắc thể ngắn nhất. Người ta đã tiến hành nghiên cứu trên một số cá thể có bộ nhiễm sắc thể: 46,XY; 47,XXY và 47,XYY đều có tinh hoàn và là nam. Trong khi đó 46,XX, 47,XXX và 45,XO có kiểu hình là nữ. Do đó, có thể kết luận là kiểu hình nam phụ thuộc vào nhiễm sắc thể Y. Ngày nay ngưòi ta đi sâu hơn và đã tìm ra ở nhánh ngắn của NST Y thì có gen mã cho yếu tố TDF (Testis Determining Factor = Yếu tố quyết...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật PCR tìm gen DYZ1 để xác định NST Y cho các bệnh nhân chưa rõ giới tính

øng dông kü thuËt PCR t×m gen DYZ1 ®Ó x¸c ®Þnh NST Y cho c¸c bÖnh nh©n ch−a râ giíi tÝnh NguyÔn Thanh Thuý1, Vò TriÖu An1, V¨n §×nh Hoa1 NguyÔn ThÞ Ph−îng2, Vò ChÝ Dòng2 1 Bé m«n MiÔn dÞch - Sinh lý bÖnh, tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi 2 Khoa Néi tiÕt - ChuyÓn ho¸ - Di truyÒn, ViÖn B¶o vÖ søc khoÎ trÎ em Sau khi tiÕn hµnh PCR t×m gen TDF ®Ó chÈn ®o¸n giíi tÝnh vµ ®èi chiÕu víi kÕt qu¶ nu«i cÊy NST cho 40 bÖnh nh©n th× thÊy 95% phï hîp tøc lµ cã mÆt song hµnh TDF vµ NST Y vµ ng−îc l¹i, cßn l¹i 5 % (2 bÖnh nh©n) kh«ng phï hîp: 46XX nh−ng TDF (+) vµ 46XY/46Xr (X) nh−ng TDF (-). §Ó kh¼ng ®Þnh cho hai tr−êng hîp nµy chóng t«i tiÕn hµnh PCR t×m gen DYZ lµ gen trªn nh¸nh dµi ®Ó ph¸t hiÖn NST Y kÕt qu¶ cho thÊy kh«ng t×m thÊy gen DYZ trªn c¶ hai bÖnh nh©n nµy, do ®ã kÕt luËn lµ kh«ng cã mÆt NST Y. I. §Æt vÊn ®Ò chÝnh b»ng sè NST Y cã trong tÕ bµo, nh−ng chØ cã kho¶ng 15% c¸c tÕ bµo 47,XYY vµ ë ng−êi vµ ®éng vËt cã vó th× nhiÔm s¾c thÓ 48,XXYY cã hai vËt thÓ Y vµ 0,05% nam Y lµ mét trong nh÷ng nhiÔm s¾c thÓ ng¾n nhÊt. 46,XY b×nh th−êng vÒ giíi kh«ng cã vËt thÓ Y. Ng−êi ta ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu trªn mét sè Do vËy kü thuËt nµy cã ®é nh¹y kÐm. c¸ thÓ cã bé nhiÔm s¾c thÓ: 46,XY; 47,XXY vµ 47,XYY ®Òu cã tinh hoµn vµ lµ nam. Trong khi Kü thuËt nu«i cÊy xÕp bé NST lµ mét trong ®ã 46,XX, 47,XXX vµ 45,XO cã kiÓu h×nh lµ n÷. kü thuËt kh¸ chÝnh x¸c do Tjio vµ Levan t×m ra Do ®ã, cã thÓ kÕt luËn lµ kiÓu h×nh nam phô n¨m 1956 [7] vµ sau ®ã n¨m 1972 ®−îc héi thuéc vµo nhiÔm s¾c thÓ Y. Ngµy nay ng−ßi ta nghÞ ë Pari thèng nhÊt gäi tªn c¸c lo¹i b¨ng, tõ ®i s©u h¬n vµ ®· t×m ra ë nh¸nh ng¾n cña NST ®ã ®Õn nay nã lµ kü thuËt chÝnh ®Ó x¸c ®Þnh Y th× cã gen m· cho yÕu tè TDF (Testis NST Y [5] trong mäi tr−êng hîp. Ph−¬ng ph¸p Determining Factor = YÕu tè quyÕt ®Þnh tinh nµy nhiÒu khi ph¶i lµm ®i lµm l¹i nhiÒu lÇn do hoµn), cßn nh¸nh dµi th× cã gen m· cho sù kÕt qu¶ nghi ngê trong c¸c tr−êng hîp khã: sinh tinh trïng AZF (Azoospermie factor) c¸c bÖnh nh©n kiÓu h×nh lµ nam, cã bÊt th−êng bé gen nµy chiÕm kho¶ng 2 - 3% NST Y. Cßn l¹i phËn sinh dôc, 46,XX TDF (+) do TDF n»m lµ c¸c tr×nh tù lÆp ®i lÆp l¹i mét c¸ch ®Æc hiÖu trªn NST X, hay cã mét mÈu NST X hoÆc vµ chØ cã ë NST Y. Ng−êi ta gäi ®ã lµ vïng NST mÊt ®o¹n th× dÔ nhÇm víi NST Y. Heterochromatin, gen DYZ n»m ë vïng nµy (D V× vËy n¨m 1992 Kaoru Suzumori vµ cs ®· = DNA; Y = NST Y; Z = Repetive copy DNA - øng dông kü thuËt sinh häc ph©n tö t×m gen §o¹n lÆp l¹i trªn NST Y). Do NST Y cã chøc DYZ trong m¸u mÑ ®Ó chÈn ®o¸n giíi tÝnh cho n¨ng vµ cÊu tróc ®Æc biÖt nh− vËy, nªn viÖc thai nhi. [3]. §©y lµ gen ®−îc t¹o nªn b¶n sao 5 x¸c ®Þnh NST Y cã vai trß quan träng, quyÕt nucleotide (TTCCA) lÆp l¹i 3000 lÇn trªn Y, ®Þnh trong viÖc chÈn ®o¸n giíi tÝnh. nÕu cã mÆt th× ch¾c ch¾n ®ã lµ NST Y. N¨m 1972, Pearson vµ cs [ 4 ] b»ng kü ë n−íc ta ch−a mét nghiªn cøu nµo ®Ò cËp thuËt nhuém huúnh quang c¸c tÕ bµo niªm ®Õn viÖc x¸c ®Þnh NST Y qua gen nµy. ChÝnh v× m¹c miÖng, tÕ bµo lympho....ë metaphase ®· vËy chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi nµy víi c¸c môc thÊy c¸c tÕ bµo lÊy tõ ®èi t−îng lµ nam giíi cã tiªu sau: b¾t mµu huúnh quang ë nh¸nh dµi NST Y ng−êi ta gäi ®ã lµ vËt thÓ Y. Sè l−îng vËt thÓ Y 41
1. Sö dông kü thuËt PCR víi cÆp måi SY - §äc kÕt qu¶ b»ng ®Ìn tö ngo¹i λ=310nm 160 t×m gen DYZ ®Ó x¸c ®Þnh NST Y cho c¸c nh− sau: bÖnh nh©n ch−a râ giíi tÝnh. TDF (+) cho s¶n phÈm lµ 425bp.DYZ (+) 2. TiÕn hµnh kü thuËt PCR t×m DYZ ®Ó cho s¶n phÈm lµ 236pb. kh¼ng ®Þnh sù cã mÆt hay kh«ng cã mÆt cña Ph©n tÝch kÕt qu¶: TDF (+) nam; TDF (-) n÷. NST Y trong tr−êng hîp kh«ng cã sù phï hîp NÕu DYZ (+): cã mÆt NST Y. gi÷a PCR t×m TDF vµ caryotype. DYZ (-): kh«ng cã NST Y. II. §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p TDF (+), DYZ (-): TDF n»m trªn NST X. nghiªn cøu: TDF (-), DYZ (+): TDF bÞ mÊt ®o¹n trªn Y. 1. §èi t−îng: Chøng nam: TDF (+); DYZ (+); NST 46,XY. 40 bÖnh nh©n cã chÈn ®o¸n lµ mËp mê giíi Chøng n÷: TDF (-); DYZ(-); NST 46,XX. tÝnh ®−îc vµo khoa Néi tiÕt chuyÓn ho¸ di truyÒn viÖn B¶o vÖ søc khoÎ trÎ em. * Kü thuËt nu«i cÊy tÕ bµo ®Þnh caryotype: ®−îc tiÕn hµnh t¹i bé m«n Y sinh 2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu: häc - Di truyÒn, tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi. Chóng t«i tiÕn hµnh chiÕt t¸ch ADN tõ b¹ch cÇu lympho m¸u ngo¹i vi cña 40 bÖnh nh©n, sau III. KÕt qu¶ ®ã tiÕn hµnh x¸c ®Þnh giíi tÝnh cho bÖnh nh©n B¶ng 1: PCR t×m gen TDF ®Ó x¸c ®Þnh giíÝ nµy b»ng kü thuËt PCR x¸c ®Þnh gen TDF, kü cho 40 bÖnh nh©n ch−a râ giíi. thuËt nµy ®· ®−îc chuÈn cho ph¶n øng chÝnh x¸c TDF n % 100% c¸c tr−êng hîp [8]. Khi cã kÕt qu¶ TDF th× D−¬ng tÝnh 24 60% chóng t«i ®èi chiÕu víi caryotype cña bÖnh nh©n ¢m tÝnh 16 40% sÏ x¶y ra hai tr−êng hîp sau: ∑ 40 100% - NÕu kÕt qu¶ TDF phï hîp víi caryotype (TDF lu«n cã mÆt cïng NST Y vµ ng−îc l¹i) th× C¸c bÖnh nh©n ch−a râ giíi tÝnh ®−îc chóng t«i lÊy lµm nhãm chøng ®Ó chuÈn kü nghiªn cøu th× 40 % lµ n÷ bÞ nam ho¸, cßn 60% thuËt PCR t×m gen DYZ ®Ó xem ®é chÝnh x¸c lµ nam bÞ n÷ ho¸. cña kü thuËt. B¶ng 2: §èi chiÕu gi÷a kÕt qu¶ PCR vµ - NÕu kÕt qu¶ TDF kh«ng phï hîp víi caryotype cña 40 bÖnh nh©n caryotype cña bÖnh nh©n th× dùa trªn kÕt qu¶ PCR Caryotype n % PCR t×m DYZ, lµ kü thuËt ®· ®−îc chuÈn ë trªn TDF (-) 46, XX 15 37,5 ®Ó kiÓm tra l¹i vµ kÕt luËn xem thËt sù cã hay n = 16 46, XY/ 46, X(r)X 1 2,5 kh«ng cã mÆt NST Y. 46, XY 19 TDF (+) 46, XX/ 46, XY 1 3. Kü thuËt: n = 24 45, XO/ 46, XY 2 57,5 * Kü thuËt PCR: tiÕn hµnh t¹i bé m«n MiÔn 47, XXY 1 46, XX 1 2,5 dÞch - Sinh lý bÖnh. Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi. ∑ 40 100 - ChiÕt t¸ch ADN tõ b¹ch cÇu lympho m¸u NhËn xÐt: ngo¹i vi theo ph−¬ng ph¸p chelex. - 15/40 sè tr−êng hîp chiÕm 37,5 % gen - Thùc hiÖn ph¶n øng PCR víi cÆp måi cña TDF (-) cã kÕt qu¶ phï hîp víi kÕt qu¶ NST lµ gen TDF ®Ó x¸c ®Þnh giíi vµ PCR víi cÆp måi 46,XX. §−îc sö dông lµm nhãm chøng cho cña gen DYZ ®Ó x¸c ®Þnh NST Y. PCR t×m DYZ. - Sau ®ã kiÓm tra kÕt qu¶ b»ng ®iÖn di trªn - 23/40 sè tr−êng hîp chiÕm 57,5 % gen gen th¹ch agarose 2%. TDF (+) phï hîp víi kÕt qu¶ NST lµ 46,XY. 42
§−îc sö dông lµm nhãm chøng cho PCR t×m - Theo Cook vµ cs [2] 1976 ®· thÊy DYZ. kho¶ng 50-70% vïng kh«ng bæ cøu trªn NST - 1/40 sè tr−êng hîp chiÕm 2,5 % gen TDF Y bao gåm c¸c ®o¹n ADN lÆp ®i lÆp l¹i vµ chØ (-) nh−ng kÕt qu¶ nu«i cÊy NST lµ 46, XY /46, xuÊt hiÖn trªn NST Y, hoµn toµn ®Æc hiÖu Xr(X). cho NST Y, nã kh− tró trªn nh¸nh dµi NST Y ë vïng heterochromatin. Ng−êi ta gäi nã lµ - 1 /40 sè tr−êng hîp chiÕm 2,5% gen TDF gen DYZ1 vµ DYZ2. DYZ lµ chØ sù nh¾c l¹i (+) nh−ng kÕt qu¶ nu«i cÊy NST lµ 46,XX. trªn NST Y, sè 1 vµ 2 ®Ó chØ tr×nh tù ph¸t B¶ng 3: X¸c ®Þnh NST Y b»ng PCR t×m DYZ hiÖn ra. DYZ 1 cã kÝch th−íc 3,4kb víi 5 ë nhãm chøng. nucleotit ®−îc lÆp l¹i TTCCA (kho¶ng 3000 TDF(+), 46, XY TDF(-), 46, XX b¶n lÆp l¹i) cßn DYZ 2 th× cã 2000 b¶n lÆp n % n % l¹i. Do vËy ng−êi ta lîi dông tÝnh chÊt nµy ®Ó DYZ(-) 0 0 15 100 x¸c ®Þnh NST Y b»ng kü thuËt PCR khi khã DYZ(+) 23 100 0 0 x¸c ®Þnh nã b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy NST, hay khi gen TDF kh«ng n»m trªn NST NhËn xÐt: víi 38 tr−êng hîp cã kÕt qu¶ phï Y. C¸c t¸c gi¶ n−íc ngoµi ®· sö dông kü hîp gi÷a TDF vµ caryotype ®Ó lµm chøng cho thuËt nµy trong chÈn ®o¸n giíi nh− Kaoru cho kü thuËt PCR t×m DYZ ®Ó x¸c ®Þnh NST Y Suzumori vµ céng sù 1992 [3] ®· ¸p dông cho kÕt qu¶ chÝnh x¸c 100%, kh«ng cã tr−êng trong viÖc chÈn ®o¸n giíi tÝnh thai nhi tõ m¸u hîp nµo d−¬ng tÝnh hay ©m tÝnh gi¶. mÑ, ngoµi ra cßn ®−îc Tanoue A. vµ céng sù B¶ng 4: KÕt qu¶ PCR t×m DYZ ë nhãm bÖnh n¨m 1992 [6] ¸p dông ®Ó nghiªn cøu trªn ®èi nh©n cã kÕt qu¶ kh«ng phï hîp gi÷a TDF t−îng 46,XX nam vµ 46,XX ¸i nam ¸i n÷ thËt vµ caryotype. (cã mÆt ®ång thêi c¶ tinh hoµn vµ buång Caryotype KÕt qu¶ DYZ trøng) ®· ph¸t hiÖn ra TDF (+),vµ DYZ (-). TDF (+); 46,XX ¢m tÝnh - Tõ b¶ng 4 cho thÊy mét bÖnh nh©n lµ TDF (-); 46,XY/46,Xr(X) ¢m tÝnh 46,XX cã gen TDF (+) chiÕm 2,5% sè tr−êng hîp. ë bÖnh nh©n nµy gen TDF n»m hoµn NhËn xÐt: c¶ hai tr−êng hîp ®Õu cã DYZ ©m toµn trªn NST X v× kÕt qu¶ DYZ (-). Do ®ã tÝnh, chøng tá kh«ng cã mÆt NST Y. phï hîp vÒ l©m sµng bÖnh nh©n nµy cã IV. Bµn luËn: ngo¹i h×nh nam hoµn toµn, cã tinh hoµn, Trong tæng sè 40 bÖnh nh©n nghiªn cøu sau nh−ng vµo viÖn v× cã tËt lç ®¸i thÊp. KÕt qu¶ khi ®èi chiÕu gi÷a TDF vµ NST Y th× chóng t«i thÊy nghiªn cøu cña chóng t«i phï hîp víi mét sè cã 95% phï hîp ®· ®−îc bµn luËn trong nghiªn nghiªn cøu cña c¸c t¸c gi¶ kh¸c trong y v¨n cøu tr−íc cña chóng t«i [9] cßn 5% kh«ng phï hîp [6]. B»ng ph−¬ng ph¸p lai t¹i chç (FISH) ®ã lµ: tr−êng hîp thø nhÊt cã gen TDF nh−ng nu«i Abbas N. et al 1993 [1] ®· chøng minh cÊy NST lµ 46,XX vµ tr−êng hîp thø hai lµ kh«ng nguyªn nh©n cña c¸c tr−êng hîp nµy lµ do cã gen TDF nh−ng khi nu«i cÊy NST lµ 46,XY/46, trªn nh¸nh ng¾n NST X(Xp22) cña bÖnh Xr(X) (nhiÔm s¾c thÓ X h×nh nhÉn do mÊt ®o¹n nh©n cã mang gen TDF vµ vïng gi¶ NST nh¸nh ng¾n vµ nh¸nh dµi). Khi tiÕn hµnh kiÓm tra th−êng (pseudo autosome region). NST X PCR víi SY160 ®Ó t×m gen DYZ sè bÖnh nh©n (38 bÖnh lý nµy lµ do cha truyÒn cho con, v× bÖnh nh©n) cã sù phï hîp TDF vµ nu«i cÊy NST ng−êi ta ®· t×m thÊy ë cha bÖnh nh©n nµy cã th× cã kªt qu¶ phï hîp víi DYZ, nghÜa lµ, DYZ 2 gen TDF mét trªn NST Y vµ mét gen trªn d−¬ng tÝnh th× caryotype cã NST Y vµ DYZ ©m tÝnh NST X. [1] th× caryotype kh«ng cã Y. Hai tr−êng hîp cßn l¹i - Ngoµi ra tõ b¶ng 4 cßn thÊy 1 bÖnh th× ®Òu cã DYZ (-) chøng tá kh«ng cã mÆt NST Y. nh©n kh¸c chiÕm 2,5% sè tr−êng hîp kh«ng C¸c kÕt qu¶ trªn ®−îc lý luËn nh− sau: cã sù phï hîp gi÷a kÕt qu¶ PCR víi nu«i 43
cÊy NST: bé NST ®äc lµ 46,XY/46,Xr (X) cã 2. Cooke HJ.(1976). Repeated sequence mÆt NST Y nh−ng khi tiÕn hµnh PCR th× kÕt specific to human males. Nature 262:182- qu¶ cho thÊy TDF (-); DYZ (-) tøc lµ hoµn 186. toµn kh«ng cã mÆt NST Y vµ c¸c gen trªn 3. Kaoru Suzumori et al (1992) Fetal cell nã. Tr−êng hîp nµy khi ®èi chiÕu víi l©m in maternal circulation; detection of Y sµng cña bÖnh nh©n th× phï hîp: bÖnh nh©n sequence by gene amplification. cã ngo¹i h×nh n÷ hoµn toµn, cã tö cung vµ Obstet.gynecol. 1992;80:150-60 buång trøng vµo viÖn v× chiÒu cao chËm ph¸t 4. Pearson P. et al (1972). The use of triÓn cã ngo¹i h×nh gÇn gièng héi chøng new staining techniques for human Turner. Do ®ã s¬ bé chóng t«i kh¼ng ®Þnh chromosome identification. J.Med.Genet 9; r»ng trong caryotype cña bÖnh nh©n nµy 264 - 75. kh«ng cã NST Y. NhËn xÐt nµy cña chóng t«i phï hîp hoµn toµn víi y v¨n, v× nÕu 5. Polani P.E. et al (1981). Abnormal sex 46,XY/46,Xr(X) mµ TDF (-) nghÜa lµ cã sù ®ét development in man. The mecanisme of the sex differentiation in animals and man. biÕn 2 dßng tÕ bµo trªn cïng mét hîp tö th× rÊt hiÕm gÆp. (Austin C.R. et Edwards R.G.; eds); 465 - 547. Academic Press London. 6. Tanoue A., Nakamura T., Endo F. et al V. KÕt luËn (1992). Sex determining region Y (SRY) in a 1. ë 38 bÖnh nh©n ch−a râ giíi (chiÕm 95 patient with 46 XX true hermaphroditism. % tæng sè) cã kÕt qu¶ phï hîp gi÷a PCR t×m Jpn. J. Hum. Genet. DEC; 37 (4); 311 - 20. TDF vµ caryotype ®· sö dông lµm nhãm 7. Tjio J.H. et Levan A. (1956). The chøng cho chuÈn kü thuËt PCR t×m gen DYZ chromosome number of man. Hereditas; 42: ®Ó x¸c ®Þnh nhiÔm s¾c thÓ Y cho kÕt qu¶ 1 - 6. chÝnh x¸c 100% kh«ng cã tr−êng hîp nµo ©m 8. NguyÔn Thanh Thuý, Vò TriÖu An, TrÇn tÝnh hay d−¬ng tÝnh gi¶. ThÞ ChÝnh vµ cs (1997). B−íc ®Çu hoµn chØnh 2. Cßn 2 bÖnh nh©n (chiÕm 5 %) cã kÕt kü thuËt PCR vµ ¸p dông trong viÖc x¸c ®Þnh qu¶ PCR t×m TDF vµ caryotype kh«ng phï giíi tÝnh. T¹p chÝ nghiªn cøu Y häc. §¹i häc hîp ®Òu kh«ng t×m thÊy gen DYZ, do ®ã Y Hµ Néi. TËp 4. Sè 4: 33-35. kh¼ng ®Þnh lµ kh«ng cã mÆt NST Y trong 2 9. NguyÔn Thanh Thuý, Vò TriÖu An,V¨n tr−êng hîp nµy. §×nh Hoa, NguyÔn ThÞ Ph−îng, Vò ChÝ Dòng. 3. Ph¸t hiÖn vµ kh¼ng ®Þnh mét tr−êng (2002). ¸p dông kü thuËt PCR t×m gen TDF hîp TDF trªn NST X ®Çu tiªn ë ViÖt Nam. vµ gen Amelogenin ®Ó x¸c ®Þnh giíi tÝnh cho bÖnh nh©n ch−a râ giíi tÝnh vµ ®èi chiÕu víi kÕt qu¶ nu«i cÊy NST. T¹p chÝ Nghiªn cøu y Tµi liÖu tham kh¶o häc. §¹i häc Y Hµ Néi 18.sè 2. 6/2002. tr 3- 1. Abbas N.; McElreavey K.; Fellous M.; 6. et al (1993). Familial case of 46,XX male and 46,XX true hermaphrodite associated with paternal -derived SRY -bearing X chromosome. C.R.Acad. Sci. III 1993; 316(4): 375-383. 44
Summary The application of the PCR technique to find the DYZ gene for the Y chromosome determination (We would like to thank Dr.McElreavey Ken for your help) The authors studied DNA samples with were extracted from the peripheral blood by the PCR technique with the primers TDF (to amplify the TDF gene on the short arm of the Y chromosome) and compared this PCR result with their karyotype: 95% accord with karyotype and except 5%: 46XX, TDF(+) and 46XY/Xr(X) TDF(-). The authors amplified the DYZ gene with primers SY160 to determine the Y chromosome in this 5% and the results showed that: - DYZ(-) in both 2 cases. - TDF (+) on the X chromosome. 45