TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br />
<br />
ỨNG DỤNG PCR-RFLP XÁC ĐỊNH GENOTYPE CỦA VIRUT SỞI<br />
PHÂN LẬP ĐƢỢC Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM<br />
(2006 - 2013)<br />
Nguyễn Thái Sơn*; Nguyễn Thị Hồng Ngọc**<br />
Nguyễn Thị Kim Loan*; Diêm Đăng Thanh***<br />
TÓM TẮT<br />
Trong những năm gần đây, mặc dù vắxin sởi đã được đưa vào chương trình tiêm chủng mở<br />
rộng, bệnh sởi vẫn bùng phát và diễn biến phức tạp ở một số địa phương. Ngoài lý do tiêm<br />
chủng không đầy đủ thì có hay không những thay đổi trong genotype các chủng virut sởi mới<br />
lưu hành ở Việt Nam?. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu: xác định genotype virut sởi hiện đang<br />
lưu hành ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự gen.<br />
Kết quả cho thấy 46 chủng virut sởi hoang dại khi phân tích genotype bằng RFLP và giải trình<br />
tự gen đều thuộc genotype H1 và có một số thay đổi ở một vài vị trí nucleotid so với chủng đối<br />
chứng H1 (Genbank: JF824649).<br />
* Từ khóa: Virut sởi; Genotype; PCR- RFLP; Giải trình tự gen.<br />
<br />
APPLICATION OF PCR-RFLP IN IDENTIFYING GENOTYPE OF<br />
MEASLES VIRUS IN NORTHERN OF VIETNAM<br />
SUMMARY<br />
In recent years, there has been routine measles vaccination for children, but measles still<br />
breaks out and develops complicatedly in some regions. Apart from reasons of not being fully<br />
immunized, we need to answer the question whether or not the changes in the new genotype of<br />
measles virus strains circulating in Vietnam. This study aims at identifying circulating meales<br />
genotype in some Northern provinces of Vietnam by using PCR-RFLP and sequencing method.<br />
The results showed that all of 46 strains of wild-type measles virus isolated belong to genotype<br />
H1 and also have some nucleotides changing to compare with H1 control (Genbank: JF824649).<br />
* Key words: Measles virus; Genotype; PCR-RFLP; Sequencing.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Sởi là một bệnh nhiễm trùng đường hô<br />
hấp do virut sởi gây ra, thường gặp ở trẻ em.<br />
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới<br />
<br />
(WHO), tình trạng tử vong do bệnh sởi đã<br />
giảm 78% và vắcxin đã cứu sống 4,3 triệu<br />
người trong thập kỷ qua. Tuy nhiên, số liệu<br />
công bố của WHO cho thấy trung bình<br />
<br />
* Bệnh viện Quân y 103<br />
** Trường Cao đẳng Y tế Hà Nội<br />
*** Bệnh viện Quân y 110<br />
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thái Sơn (ntson65@yahoo.com)<br />
Ngày nhận bài: 09/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/09/2014<br />
Ngày bài báo được đăng: 25/09/2014<br />
<br />
42<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br />
<br />
330 người chết mỗi ngày, 14 trẻ chết mỗi<br />
giờ vì căn bệnh này hiện vẫn là quá lớn<br />
đối với một bệnh hoàn toàn có thể phòng<br />
ngừa được [8].<br />
Tại Việt Nam, trong những năm gần<br />
đây dịch bệnh lại bùng phát với diễn biến<br />
phức tạp hơn, bệnh gặp cả ở người lớn<br />
(18 - 40 tuổi), tản phát và khó khống chế,<br />
riêng từ cuối năm 2013 đến hết quý I - 2014<br />
đã ghi nhận trên 5.000 trường hợp nghi<br />
bệnh sởi [1]. Trước tình hình đó, ngoài<br />
việc tiêm phòng vắcxin, vấn đề đặt ra là<br />
phải nhanh chóng xác định được chính xác<br />
các genotype của chủng virut sởi đang lưu<br />
hành tại nhiều vùng lãnh thổ của quốc gia,<br />
nhằm phục vụ cho công tác giám sát dịch<br />
tễ học. Đây cũng là chiến lược chung của<br />
WHO trong mục tiêu thanh toán bệnh sởi<br />
trên toàn cầu dựa vào việc hoàn thiện<br />
bản đồ phân bố genotype của virut sởi<br />
hiện đang lưu hành ở vùng địa lý dân cư<br />
trên tất cả các châu lục [9].<br />
Để xác định genotype của virut sởi, hiện<br />
nay có nhiều phương pháp như: phương<br />
pháp giải trình tự gen (sequencing), phương<br />
pháp realtime-PCR. phương pháp PCRRFLP… [6, 9]. Mỗi phương pháp đều có<br />
những ưu nhược điểm riêng. Trong đó,<br />
phương pháp PCR-RFLP sử dụng enzyme<br />
giới hạn cắt trình tự đã biết của sản phẩm<br />
PCR nhân đoạn gen của virut sởi, qua đó<br />
xác định kiểu gen của virut sởi thông qua<br />
phân tích tính đa hình các đoạn giới hạn.<br />
Đây là một phương pháp đơn giản, dễ<br />
thực hiện, không đòi hỏi những trang thiết<br />
bị đắt tiền, do đó đáp ứng được yêu cầu về<br />
mặt giá thành và cũng rút ngắn thời gian,<br />
phù hợp với nghiên cứu dịch tễ. Chính vì<br />
những lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài<br />
<br />
43<br />
<br />
này với mục tiêu: Xác định genotype virut sởi<br />
hiện đang lưu hành ở một số tỉnh miền Bắc<br />
Việt Nam bằng phương pháp PCR-RFLP.<br />
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br />
- Các chủng virut sởi được phân lập từ<br />
ba loại vắcxin sống giảm độc lực gồm:<br />
6675/Rouvax Aventis Pasteur (Pháp); AIK-C<br />
Vero và MMR (Mỹ) thuộc genotype nhánh A.<br />
Các chủng này dùng như chủng chuẩn trong<br />
nghiên cứu genotype virut sởi. Ngoài ra,<br />
nghiên cứu này còn dùng chủng virut sởi<br />
H1 là MVi/Hanam.VNM/6.09/9 (Genbank:<br />
JF824649) làm chủng đối chứng để so sánh<br />
và phân tích với chủng phân lập (hoang<br />
dại) trong nghiên cứu.<br />
- 46 chủng virut sởi thu được từ một số<br />
vụ dịch sởi từ 2006 - 2013 tại một số tỉnh<br />
miền Bắc Việt Nam đang lưu giữ tại Khoa<br />
Virut, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương,<br />
sử dụng để nghiên cứu genotype.<br />
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
Phát hiện genotype virut sởi trên các<br />
chủng thu thập bằng kỹ thuật PCR-RFLP<br />
và giải trình tự gen. Các chủng virut sau<br />
khi tách chiết ARN được khuếch đại đoạn<br />
gen N đặc hiệu tạo sản phẩm ADN có kích<br />
thước 660 bp bằng phản ứng RT-PCR,<br />
sau đó tiến hành chạy nested PCR và giải<br />
trình tự gen [4, 5].<br />
Sản phẩm nested PCR kích thước 492<br />
bp được cắt bằng 3 loại enzyme giới hạn<br />
MboI, HaeIII, ScrFI, kiểm tra kết quả trên<br />
gel agarose 3% cùng với thang ADN chuẩn,<br />
so sánh giữa các chủng nghiên cứu với<br />
chủng đối chứng, rút ra kết luận về genotype.<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br />
<br />
Các trình tự cặp mồi đặc hiệu cho virut<br />
sởi được dùng trong nghiên cứu gồm [4]:<br />
- Cặp mồi cho phản ứng RT-PCR:<br />
MN5: 5’ - GCC ATG GGA GTA GGA GTG<br />
GAA C - 3’ và MN6: 5’ - CTG GCG GCT<br />
GTG TGG ACC TG - 3’.<br />
- Cặp mồi cho phản ứng nested PCR:<br />
Nf1: 5’- GAT GGT AAG GAG GTC AGC<br />
TGG - 3’ và Nr7: 5’ - TCG GCC TCT CGC<br />
ACC TA - 3’.<br />
<br />
Tiến hành giải trình tự sản phẩm RTPCR kích thước 660 bp của chủng virut<br />
sởi trên máy giải trình tự ABI avant 3100,<br />
xử lý kết quả bằng phần mềm BioEdit<br />
và MEGA 4.0 [4, 5], so sánh với trình<br />
tự chủng chuẩn trên Genbank để kiểm<br />
chứng kết quả PCR-RFLP, lập cây phát<br />
sinh chủng loại và tìm hiểu tỷ lệ sai khác<br />
so với chủng đối chứng H1 (Genbank:<br />
JF824649).<br />
<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br />
1. Kết quả PCR nhân đoạn gen đặc hiệu N của virut sởi.<br />
Bảng 1: Kết quả khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu của virut sởi.<br />
Nested PCR<br />
<br />
RT-PCR<br />
Chñng nghiªn cøu<br />
<br />
n<br />
<br />
Số (+) (660bp)<br />
<br />
Số (-)<br />
<br />
Số (+) (492bp)<br />
<br />
Số (-)<br />
<br />
Chủng vắcxin<br />
<br />
3<br />
<br />
3<br />
<br />
0<br />
<br />
3<br />
<br />
0<br />
<br />
Chủng đối chứng<br />
<br />
1<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
Hà Nội<br />
<br />
14<br />
<br />
14<br />
<br />
0<br />
<br />
14<br />
<br />
0<br />
<br />
Điện Biên<br />
<br />
1<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
Lào Cai<br />
<br />
4<br />
<br />
4<br />
<br />
0<br />
<br />
4<br />
<br />
0<br />
<br />
Lai Châu<br />
<br />
5<br />
<br />
5<br />
<br />
0<br />
<br />
5<br />
<br />
0<br />
<br />
Thái Nguyên<br />
<br />
2<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
Bắc Giang<br />
<br />
4<br />
<br />
4<br />
<br />
0<br />
<br />
4<br />
<br />
0<br />
<br />
Hải Dương<br />
<br />
3<br />
<br />
3<br />
<br />
0<br />
<br />
3<br />
<br />
0<br />
<br />
Thái Bình<br />
<br />
1<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
Hòa Bình<br />
<br />
1<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
Ninh Bình<br />
<br />
4<br />
<br />
4<br />
<br />
0<br />
<br />
4<br />
<br />
0<br />
<br />
Thanh Hóa<br />
<br />
3<br />
<br />
3<br />
<br />
0<br />
<br />
3<br />
<br />
0<br />
<br />
Nghệ An<br />
<br />
4<br />
<br />
4<br />
<br />
0<br />
<br />
4<br />
<br />
0<br />
<br />
Tổng<br />
<br />
50<br />
<br />
50<br />
<br />
0<br />
<br />
50<br />
<br />
0<br />
<br />
Trong 46 chủng virut hoang dại thu thập trong giai đoạn 2006 - 2013, 3 chủng sởi<br />
vắcxin và 1 chủng sởi đối chứng H1_ Genbank khi nhân gen bằng RT-PCR và nested<br />
PCR đều có kết quả dương tính và cho các band ADN đặc với kích thước tương ứng<br />
660 bp và 492 bp.<br />
<br />
44<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br />
<br />
2. Kết quả xác định genotype virut sởi bằng kỹ thuật RFLP.<br />
* Kết quả cắt bằng enzyme giới hạn đối với chủng chuẩn và chủng đối chứng trong<br />
nghiên cứu:<br />
Trình tự chủng chuẩn<br />
A_Edmonston-wt/54<br />
H1_Hunan.CHN/93/7<br />
<br />
Trình tự thực nghiệm<br />
H1_Genbank: JF824649<br />
<br />
ScrFI<br />
240<br />
231<br />
21<br />
151<br />
135<br />
80<br />
53<br />
52<br />
21<br />
146<br />
115<br />
77<br />
53<br />
52<br />
23<br />
21<br />
5<br />
<br />
Hình 1: Kết quả RFLP các chủng virut sởi cắt với ScrFI.<br />
(M: Marker ɸX174 - HaeIII; 1: Chủng vắcxin MMR; 2: H1_Genbank:JF824649; 3: Chủng<br />
vắcxin 6675/Rouvax; 4: Chủng sởi VN).<br />
- Kết quả phân tích các chủng vắcxin bằng enzyme ScrFI cho band ADN có kích thước<br />
khoảng 240, 231 và 21 bp, kết quả này phù hợp tính toán lý thuyết.<br />
- Kết quả phân tích chủng H1_Genbank: JF824649 bằng enzyme ScrFI cho các band<br />
ADN với kích thước khoảng 146, 115, 77, 53, 52 bp phù hợp với tính toán lý thuyết.<br />
<br />
Trình tự chủng chuẩn<br />
A_Edmonston-wt/54<br />
H1_Hunan.CHN/93/7<br />
<br />
Trình tự thực nghiệm<br />
H1_Genbank: JF824649<br />
<br />
HaeIII<br />
264<br />
228<br />
228<br />
203<br />
61<br />
242<br />
223<br />
26<br />
<br />
Hình 2: Kết quả RFLP các chủng virut sởi cắt với HaeIII<br />
(M: Marker pBR_MspI; 1: Chủng vắcxin AIK; 2: Chủng vắcxin MMR; 3: Chủng vắcxin<br />
6675/Rouvax; 4-17: Chủng sởi VN; 18: Chủng H1_Genbank: JF824649).<br />
<br />
45<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br />
<br />
- Khi phân tích các chủng vắcxin bằng enzyme HaeIII có vạch ADN với kích thước<br />
khoảng 264 và 228 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết.<br />
- Phân tích chủng đối chứng H1_Genbank: JF824649 bằng enzyme HaeIII cũng cho<br />
các vạch ADN với kích thước khoảng 242 và 223 bp phù hợp với tính toán lý thuyết.<br />
* Kết quả xác định genotype của 46 chủng virut phân lập được:<br />
<br />
Hình 3: Kết quả RFLP chủng virut sởi cắt với enzyme MboI và HaeIII.<br />
(M: Marker ɸX174 - HaeIII; 1, 4-7: Chủng virut sởi VN; 2, 9: Chủng virut H1; 3: Chủng<br />
vắcxin cắt với MboI; 8, 11-14: Chủng virut sởi VN; 10: Chủng vắcxin cắt với HaeIII).<br />
Các đoạn ADN của chủng virut sởi hoang dại phân lập tại một số địa phương ở<br />
miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2006 - 2013 khi phân tích với enzyme MboI có kích<br />
thước khoảng 242, 155, 55 bp, phân tích với HaeIII cũng cho 02 vạch ADN có kích<br />
thước khoảng 242 và 223 bp, tương tự với chủng đối chứng H1_Genbank: JF824649.<br />
<br />
Hình 4: Kết quả RFLP chủng virut sởi cắt với enzyme ScrFI.<br />
(M: Marker ɸX174 - HaeIII; 1, 4 - 7: Chủng virut sởi VN; 2: Chủng H1_Genbank: JF824649;<br />
3: Chủng vắcxin cắt với ScrFI).<br />
Khi phân tích các chủng virut sởi hoang dại với enzyme ScrFI đều cho band ADN có<br />
kích thước khoảng 146, 115, 77, 53, 52 bp, tương tự như khi phân tích chủng đối<br />
chứng H1_Genbank: JF824649.<br />
<br />
46<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
