Xác định chỉ số ff trong định lượng AND phôi thai tự do máu mẹ bằng kỹ thuật Real-Time PCR

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

1
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sàng lọc trước sinh không xâm lấn (Noninvasive prenatal testing-NIPT) dựa trên DNA tự do của thai nhi (cffDNA) trong huyết tương của thai phụ là kỹ thuật xác định lệch bội nhiễm sắc thể chính xác, hạn chế được nhiều rủi ro so với kỹ thuật xâm lấn. Nghiên cứu này nhằm thiết lập kỹ thuật qRT-PCR ứng dụng trong xác định chỉ số ff, giúp kiểm soát chất lượng NIPT trong nghiên cứu cũng như thực hành lâm sàng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định chỉ số ff trong định lượng AND phôi thai tự do máu mẹ bằng kỹ thuật Real-Time PCR

vietnam medical journal n02 - APRIL - 2020 bệnh viện Daklak 1998 ‐ 2002", Tạp chí Y tế Công 6. Adil, Syed Omair, et al. (2016), "Pattern of cộng. 3(3), tr. 23-26. unintentional burns: A hospital based study from 3. Nguyễn Thúy Quỳnh (2004), "Mô hình chấn Pakistan", Burns. 42(6), pp. 1345-1349. thương dựa vào số liệu bệnh viện tại 6 tỉnh của 7. Chirongoma, F., Chengetanai, S., and Việt Nam", Tạp chí Y tế Công cộng. 2(2), tr. 45-49. Tadyanemhandu, C. (2017), "First aid practices, 4. Lâm Thị Thu Tâm, Susan Norwood và Trần beliefs, and sources of information among Thiện Trung (2013), "Kiến thức và thái độ của caregivers regarding paediatric burn injuries in người dân về sơ cứu bỏng tại quận Tân Phú, thành Harare, Zimbabwe: A cross-sectional study", phố Hồ Chí Minh", Tạp chí Y học thành phố Hồ Chi Malawi Med J. 29(2), pp. 151-154. MInh. 17(4), tr. 223-228. 8. JS, Han Kim DH (1998), "A survey of the types 5. Nguyễn Thị Như Tú, Trần Thị Xuân Tâm và Lê of burns in children and motherʹs preventive Thị Ánh Hồng (2019), "Khảo sát thực trạng và attitudes to, and knowledge of burns", Korean J một số yếu tố liên quan tai nạn bỏng nhập viện tại Child Health Nurs. 4(1), pp. 97-104. khoa Ngoại Trung tâm Y tế An Nhơn tỉnh Bình 9. Organization, World Health (2018), Burns, Định, năm 2018", Tạp chí Điều dưỡng Việt Nam. accessed 25/2/2018, from http:// 27, tr. 42-47. www.who.int/mediacentre/factsheets/fs365/en/. XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ FF TRONG ĐỊNH LƯỢNG AND PHÔI THAI TỰ DO MÁU MẸ BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Đặng Tiến Trường1, Nguyễn Thị Hương1, Nguyễn Duy Bắc1 TÓM TẮT 22 Keywords: realtime PCR; cfDNA; cffDNA Mục tiêu: Thiết lập kỹ thuật Real-Time PCR (qRT- I. ĐẶT VẤN ĐỀ PCR) xác định chỉ số ff trong định lượng ADN phôi thai tự do trong máu mẹ. Đối tượng và phương pháp Sàng lọc trước sinh không xâm lấn (Non- nghiên cứu: cfDNA được tách chiết từ mẫu huyết invasive prenatal testing-NIPT) dựa trên DNA tự tương của thai phụ. Tối ưu hóa phản ứng realtime do của thai nhi (cffDNA) trong huyết tương của PCR xác định số bản copy của gen HBB và SRY. Xác thai phụ là kỹ thuật xác định lệnh bội nhiễm sắc định chỉ số ff. Kết quả: Thiết lập được kỹ thuật qRT- thể chính xác, hạn chế được nhiều rủi ro so với PCR và xây dựng được đường chuẩn để định lượng gen SRY, HBB với R và E tối ưu. Áp dụng Đã tính được kỹ thuật xâm lấn [3]. Phương pháp này có độ tỷ lệ ffNI19040901 (SD2) = 14,329%. Kết luận: Xây dựng nhạy và đặc hiệu cao, an toàn cho thai nhi, thai thành công kỹ thuật qRT-PCR giúp xác định chỉ số ff phụ. Đặc biệt, kỹ thuật phát hiện bất thường từ trong kiểm soát chất lượng của kỹ thuật NIPT. rất sớm, từ tuần thứ 8 của thai kỳ nên là lựa Từ khóa: realtime PCR; cfDNA; cffDNA chọn tin cậy của các nhà tư vấn di truyền [3]. SUMMARY Hiện nay, ngoài các phương pháp di truyền phổ biến để xác định lệch bội trước sinh, NIPT DETERMINING FF INDEX FOR QUANTIFICATION đang là sự lựa chọn tin cậy đối với các trường OF CELL-FREE FETAL DNA IN MATERNAL hợp hiếm muộn, có thai thông qua hỗ trợ sinh BLOOD BY REAL-TIME PCR TECHNIQUE Objective: Establishing the qRT-PCR technique to sản [3]. Tuy nhiên, NIPT cần xác định chỉ số ff determine the ff index which is applied for quantifying (fetal faction) để kiểm soát chất lượng, hạn chế fetal DNA in maternal blood. Subjects and âm tính giả. Chỉ số ff là tỷ lệ lượng DNA của thai methods: cfDNA was extracted from plasma samples nhi (cell free fetal DNA) và tỷ lệ ADN tự do của of pregnant women. Realtime PCR optimization mẹ (cell free DNA-cfDNA) trong máu mẹ. Xác determines the number of copies of HBB and SRY định ff bằng Real-Time PCR (qRT-PCR) có độ genes. Determination of ff index. Results: establishing qRT-PCR and the standard line to quantify SRY, HBB chính xác cao. Nó được dùng nhiều trong giai gene with optimal R and E. Applied calculated ff of đoạn chuẩn hóa kỹ thuật NIPT và kiểm định chất clinical sample was14.329%. Conclusion: Successful lượng kết quả NIPT[1]. NIPT có độ chính xác cao development of the qRT-PCR technique to determine ff chỉ khi ff đạt đến ngưỡng nhất định. Một số thai index in quality control of the NIPT technique. phụ có chỉ số ff thấp, kết quả NIPT sẽ không đáng tin cậy do tỷ lệ âm tính giả tăng cao [3]. 1Học viện Quân y Thông thường NIPT yêu cầu ff phải lớn hơn 4% Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Duy Bắc, [3]. Nghiên cứu này nhằm thiết lập kỹ thuật Email: nguyenduybac@vmmu.edu.vn qRT-PCR ứng dụng trong xác định chỉ số ff, giúp Ngày nhận bài: 3.2.2020 kiểm soát chất lượng NIPT trong nghiên cứu Ngày phản biện khoa học: 2.4.2020 cũng như thực hành lâm sàng. Ngày duyệt bài: 10.4.2020 90
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 489 - THÁNG 4 - SỐ 2 - 2020 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU phần phương pháp. Kết quả khuếch đại vùng 2.1. Đối tượng. Các mẫu huyết tương của SRY và HBB được thể hiện trên Hình 1 và 2. thai phụ mang thai nam từ 9 đến 16 tuần được Sản phẩm qRT-PCR được điện di trên gel thu từ Trung tâm Tư vấn Di truyền của Đại học Y HN. agazose 2%. Kết quả trên Hình 1 cho thấy các 2.2. Phương pháp băng sản phẩm 2, 3, 4 của vùng HHB có kích - Tách chiết ADN: cfDNA được tách chiết thước là 102bp; băng 6, 7, 8 của vùng SRY có bằng bộ kít QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit kích thước là 78bp. Số 1, 5 là mẫu chứng âm (QIAGEN), theo khuyến cáo của nhà sản xuất. không có băng sản phẩm. Kết quả này phù hợp Nồng độ cfDNA được định lượng bộ kit Qu-bit với tính toán lý thuyết. Nhưng vậy chúng tôi đã - Phản ứng qRT-PCR: mục tiêu của phản ứng khuếch đại thành công vùng SRY và HBB. PCR nhằm định lượng cffDNA thông qua khuếch đại vùng SRY của nhiễm sắc thể Y. Định lượng cfDNA toàn phần thông qua vùng gen trên gen giữ nhà HBB. Phản ứng qRT-PCR khuếch đại hai vùng gen tương đồng. Tổng thể tích 25µl gồm Quantitect Probe PCR Mix (1X); primer và probe SRY lần lượt là 400, 400, 200µM đối với phản ứng khuếch đại vùng SRY; primer và probe HBB lần lượt là 400, 400, 200µM đối với khuếch đại vùng HBB; ADN và nước vừa đủ. Hình 1: Kết quả sản phẩm qRT-PCR của hai gen Trình tự mồi và probe của SRY-F: 5’- HBB và SRY trên agarose TCCTCAAAAGAAACCGTGCAT-3; SRY-R: 5’– Kết quả khuếch đại vùng SRY và HBB bằng AGATTAATGGTTGCTAAGGACTGGAT-3’; Probe-SRY: phản ứng qRT-PCR được thể hiện trên Hình 2. 5’- FAM- CACCAGCAGTAACTCCCCACAACCTCTTT- Phản ứng khuếch đại gen HBB và SRY có Ct lần TAMRA-3’. HBB gồm: HBB-F: 5’- lượt là 22,36 và 21,89, là một đường cong tuyến GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3’; HBB-R: 5’- tính có đầy đủ 4 pha đó là pha nền, pha mũ, pha CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3’ và Probe –HBB: 5’- tuyến tính và pha ổn định [5]. Do vậy, từ hình FAM-AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-TAMRA-3’. ảnh 1 và hình ảnh 2 chúng tôi có thể khẳng định Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR gồm biến tính ở 95oC trong 15 phút; 50 chu kỳ gồm rằng thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của 94oC trong 15 giây và 60oC trong 60 giây trên hệ phản ứng qRT-PCR là hoàn toàn tối ưu. thống RotoQ của hãng Qiagen. Sản phẩm khuếch đại được kiểm tra kích thước bằng điện di trên gel agarose 2%. Chất chuẩn là trình tự tham chiếu của vùng SRY và vùng HBB có kích thước lần lượt tương ứng là 78bp và 102bp được tổng hợp bởi PHUSA Bio – Chemistry. Chất chuẩn được pha loãng theo cơ số 10 về các nồng độ 106;105;104; 103; 102. Xác định định lượng cffDNA trong máu mẹ dựa trên chỉ số ff (fetal faction) là lượng cffDNA/cfDNA. Số bản copy của NST X (nx); số bản copies NST Y (ny): Công thức tính fetal faction (ff) dựa theo tác giả Roy Strave năm 2018 như sau: ff (%)=100*2ny/(nx- ny).[4] (1) Hình 2: Kết quả tối ưu quy trình khuếch đại gen III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HBB (BG) và gen SRY (NIS). 3.1. Kết quả tối ưu nồng độ và thành 3.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn gen phần phản ứng qRT-PCR của phản ứng qRT-PCR. Theo khuyến cáo, Phản ứng qRT-PCR cần tiến hành tối ưu đường chuẩn của phản ứng qRT-PCR được cho là thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng. tối ưu khi R2 = 0.999; E nằm trong khoảng 90%- Trong nghiên cứu này, dựa vào thành phần và 110% [5]. chu trình nhiệt khuyến cáo của nhà sản xuất, sau Kết quả xây dựng đường chuẩn lần 1 nhiều lần tối ưu, chúng tôi thu được chu trình (SD1) nhiệt và thành phần phản ứng đã trình bày ở 91
vietnam medical journal n02 - APRIL - 2020 A. gen SRY (NIS)- SD1 B. gen HBB(BG)- SD1 Hình 3: Hình ảnh kết quả tối ưu đường chuẩn của phản ứng qRT-PCR Kết quả từ hình 3A và 3B cho thấy kết quả xây dựng đường chuẩn của gen HBB với R2 = 0.99229 và E = 88%; gen SRY có R = 0.99907, R2 = 0.99814 và E= 91%. Đường chuẩn của SRY có các thông số tối ưu [5]. Đường chuẩn của gen HHB có hiệu suất thấp hơn ngưỡng khuyến cáo. Yếu tố hiệu suất phản ứng chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố, đặc biệt yếu tố thao tác trong trộn hóa chất, chuẩn bị mẫu. A. gen SRY (NIS)- SD2 B. gen HBB(BG)- SD2 Hình 4: Kết quả tối ưu đường chuẩn của phản ứng qRT-PCR Kết quả cho thấy đường chuẩn gen HBB có hệ số tương quan R 2 = 0,998; hiệu suất phản ứng E = 90%. Đường chuẩn khuếch đại gen SRY có hệ số tương quan R 2 = 0,99; hiệu suất phản ứng E = 112% phù hợp với tiêu chuẩn khuyến cáo[5]. Quy trình xây dựng đường chuẩn tối đã được tối ưu. 3.3. Kết quả tính tỷ lệ ff Kết quả xác định chỉ số ff của mẫu NI19040901 trên Hình 5. A. gen SRY (NIS) B. gen HBB(BG) Hình 5: Kết quả tối ưu đường chuẩn của phản ứng qRT-PCR Để tính chỉ số ff, 01 mẫu nghiên cứu được khảo sát là NI19040901. Kết quả xác định được số bản copies của gen HBB (BG) là 7,5*103 copies và gen SRY (NIS) là 4,7*102 copy. Tỷ lệ ff được xác định theo công thức (1) là ffNI19040901(SD1) = 14,329%. IV. BÀN LUẬN lọc trước sinh không xâm lấn (NIPT) [2]. Kết quả Phân tích định lượng gen SRY, HBB bằng ước lượng ff là yếu tố quan trọng trong kiểm phản ứng qRT-PCR đã được báo cáo bởi nhiều soát chất lượng của NIPT, đặc biệt trong kiểm tác giả là một kỹ thuật chính xác, nhanh chóng soát âm tính giá. Có nhiều kỹ thuật xác định ff và đáng tin cậy để xác định tỷ lệ ff trong sàng nhưng kỹ thuật qRT-PCR là kỹ thuật có độ chính 92
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 489 - THÁNG 4 - SỐ 2 - 2020 xác cao hơn cả. Kỹ thuật có giá trị rất lớn trong này nhằm kiểm soát chất lượng kết quả NIPT giai đoạn thiết lập phương pháp sàng lọc không trong quá trình xây dựng NIPT và kiểm soát xâm lấn NIPT. trong xét nghiệm. Trong tối ưu phản ứng qRT-PCR, kết quả Tuy nhiên, kỹ thuật qRT-PCR xác định ff chỉ khuếch đại gen HBB và gen SRY là những đường có thể áp dụng được trường hợp thai nam. Các cong tuyến tính, đường chuẩn có R và R 2 lần trường hợp mang thai nữ, không sử dụng được lượt là 0.99614 và R2 = 0.99229; R = 0.99907 và phương pháp này. Tuy nhiên, kỹ thuật này có độ R2 = 0.99814 là các thông số tối ưu. Xây dựng chính xác cao hơn so với các phương pháp ước đường chuẩn của kỹ thuật qRT-PCR, thông số R lượng từ phân tích dữ liệu giải trình tự thế hệ và R2 quan trọng. Ngoài ra, hiệu suất là thông số mới hiện tại. Vì vậy, xác định ff bằng kỹ thuật rất quan trọng để đánh giá một phản ứng có đạt này ở giai đoạn xây dựng qui trình và kiểm soát tối ưu hay không. Hiệu suất của một phản ứng chất lượng của NIPT [3],[1],[6]. tốt cần thuộc khoảng từ 90%-110%[5]. Hiệu suất của phản ứng (E) trong phản ứng khuếch V. KẾT LUẬN đại gen NIS ở đương chuẩn lần 1 (SD1) đạt 91% Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật qRT- là tối ưu. Hiệu suất phản ứng khuếch đại gen BG PCR giúp xác định chỉ số ff trong kiểm soát chất ở đương chuẩn lần 1(SD1) đạt 88% thấp hơn lượng của kỹ thuật NIPT. ngưỡng khuyến cáo. Sau khi tối ưu, hiệu suất phản TÀI LIỆU THAM KHẢO ứng khuếch đại gen SRY và HBB đã đạt tối ưu [5]. 1. S. L. Kinnings, J. A. Geis và cs. (2015), Áp dụng kỹ thuật qRT-PCR xây dựng được, "Factors affecting levels of circulating cell-free fetal chỉ số ff xác định được trong mẫu nghiên cứu là DNA in maternal plasma and their implications for 14,329%. Kết quả này đảm bảo nhờ chỉ số R và noninvasive prenatal testing", Prenat Diagn. 35(8), tr. 816-22. E trong khuếch đại gen SRY và HBB được tối ưu 2. Lyn S Chitty và YM Dennis Lo (2015), (Hình 5). Trong xét nghiệm NIPT, ff ≥ 4% là giá "Noninvasive prenatal screening for genetic trị ngưỡng quan trọng, cho thấy kết quả xác diseases using massively parallel sequencing of định lệch bội đáng tin cậy. Nếu ff thấp hơn, kết maternal plasma DNA", Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 5(9), tr. a023085. quả NIPT không đáng tin cậy[6]. Chỉ số ở giai 3. Francesco Fiorentino, Sara Bono và cs. đoạn đây là một kết quả tốt, nằm trong ngưỡng (2016), "The importance of determining the limit xét nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm lấn of detection of non‐invasive prenatal testing NIPT của Fiorentino và cộng sự năm 2016 [3]. methods", Prenatal diagnosis. 36(4), tr. 304-311. Theo Xu-Ping Xu và cộng sự năm 2016, họ 4. Roy Straver (2018), "Bioinformatic Approaches to Detecting Copy Number Variation in Next kết luận rằng đối với các phương pháp NIPT hiện Generation Sequencing Data for Clinical Diagnostics". tại thì yêu cầu tỷ lệ ff ≥ 4% nếu tỷ lệ ff thấp hơn 5. Life Technologies (2012), Real-time PCR handbook. 4% thì tỷ lệ thất bại của các thí nghiệm tiếp theo 6. Xu-Ping Xu, Hai-Yan Gan và cs. (2016), "A sẽ cao [6]. Đây là ngưỡng được áp dụng phổ method to quantify cell-free fetal DNA fraction in maternal plasma using next generation sequencing: biến được áp dụng trong kiểm soát chất lượng Its application in non-invasive prenatal chromosomal của NIPT[3]. Kỹ thuật qRT-PCR trong nghiên cứu aneuploidy detection", PloS one. 11(1). ĐIỀU TRỊ GÃY KÍN THÂN XƯƠNG ĐÙI NGƯỜI LỚN BẰNG ĐINH NỘI TỦY CÓ CHỐT KHÔNG MỞ Ổ GÃY DƯỚI MÀN TĂNG SÁNG Trần Trung Dũng1,2, Lê Văn Nam2, Phạm Sơn Tùng2 TÓM TẮT Phẫu thuật đinh nội tủy xương đùi có chốt dưới màn tăng là sự lựa chọn hàng đầu trong gãy thân 23 xương đùi. Từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 12 năm 2018, 54 bệnh nhân độ tuổi từ 16 đến 55 đã được 1Ttrường đại học Y Hà Nội phẫu thuật tại khoa Chấn thương Chình Hình bệnh 2Bệnh viện đa khoa Saint Paul viện Saint Paul. Sau phẫu thuật kết quả tốt đạt 96%, Chịu trách nhiệm chính: Trần Trung Dũng không có kết quả kém. Có thể có một số biến chứng Email: dungbacsy@dungbacsy.com xảy ra trong mổ như nắn xương khó, gãy xương phức Ngày nhận bài: 4.2.2020 tạp hơn, chốt không vào lỗ,…. Từ nghiên cứu này, chúng tôi rút ra một số kinh nghiệm trong chỉ định, kỹ Ngày phản biện khoa học: 3.4.2020 thuật và điều kiện cần thiết để phẫu thuật thành công. Ngày duyệt bài: 9.4.2020 93