Xác định kiểu gen của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu gen L1

Chia sẻ: Giang Duong Y Khoa | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

239
lượt xem 23
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đặt vấn đề: Hiện nay, công ty Nam Khoa đã có kit PCR-ELISA để phát hiện và định genotype HPV và kit này đã triển khai sử dụng khá hữu hiệu tại một số phòng thí nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh. Tuy nhiên hãy còn một tiếp cận khác để có thể định được genotype HPV, đó là sử dụng phương pháp giải trình tự để giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu vùng gen L1 của HPV và so sánh trình tự này trên thư viện trình tự các genotype của HPV, nhờ vậy mà có thể cho được...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định kiểu gen của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu gen L1

Xác định kiểu gen của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản ph ẩm PCR đặc hiệu gen L1 Phạm Hùng Vân*(11), Võ Đức Xuyên An(2), Lê Thúy Quyên(1), Hòang Hiếu Ngọc(1) Tóm tắt Đặt vấn đề: Hiện nay, công ty Nam Khoa đã có kit PCR-ELISA để phát hiện và định genotype HPV và kit này đã triển khai sử dụng khá hữu hiệu tại một số phòng thí nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh. Tuy nhiên hãy còn một tiếp cận khác để có thể định được genotype HPV, đó là sử dụng phương pháp giải trình tự để giải trình t ự tr ực ti ếp sản phẩm PCR đặc hiệu vùng gen L1 của HPV và so sánh trình t ự này trên thư viện trình t ự các genotype c ủa HPV, nhờ vậy mà có thể cho được kết quả genotype HPV. Mục tiêu đề tài: Phát triển phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu gene L1 nhờ đó xác định genotype HPV. Phương pháp nghiên cứu: Các tác giả đã thử áp dụng các tiếp cận này để định genotype 39 mẫu trích biệt DNA từ các bệnh phẩm quệt cổ tử cung xác định được genotype HPV nhờ kỹ thuật PCR-ELISA với 5 genotype 6, 8 genotype 16, 7 genotype 16, 8 genotype 58, 3 genotype 31/33/35 (vì trên bộ kit PCR-ELISA do công ty Nam Khoa sản xuất, 3 genotype này được phát hiện trong cùng một giếng) , 3 genotype 11. Ngòai ra có 4 mẫu PCR-ELISA không cho được genotype dù giai đọan PCR cho kết quả [+] rất rõ và 1 mẫu kết quả PCR-ELISA dương tính v ới cả hai genotype 16 và 11 cũng được đưa vào thử nghiệm. Kết quả: Kết quả thu nhận được cho thấy các mẫu mà PCR-ELISA đã xác định là genotype 6, 11, 16, 18, và 58 thì kỹ thuật giải trình tự trực tiếp vùng gen L1 cũng cho kết quả định genotype hòan tòan tương đ ồng. 3 mẫu mà PCR-ELISA xác định là genotype 31/33/35 thì kết quả giải trình tự xác định là genotype 33. Với 4 mẫu PCR-ELISA không cho được kết quả genotype thì kết quả giải trình tự cho 1 mẫu là genotype 62, một mẫu là genotype 83, một mẫu là genotype 54, và 1 mẫu là genotype 52. Riêng mẫu PCR-ELISA cho kết quả dương tính cả hai genotype 16 và 11 thì giải trình tự không được dù kết quả PCR cho dương tính rất rõ. Kết luận: Với các kết quả này, các tác giả đã nhận định phương pháp giải trình t ự trực tiếp sản phẩm PCR có khả năng phát hiện được các genotype HPV mà bộ thử nghiệm PCR-ELISA chưa phát hiện được vì nhà sản xuất không cung cấp các dò đặc hiệu type tương ứng do số lượng giới hạn của các giếng được phủ dò đặc hiệu. Ngòai ra đối với nhà sản xuất bộ thử nghiệm PCR-ELISA thì phương pháp giải trình t ự trực tiếp để xác đ ịnh genotype của HPV cũng còn có thể giúp hòan thiện bộ thử nghiệm này nhờ cho biết thêm các genotype của HPV hiện đang lưu hành mà nhà sản xuất cần phải chọn thêm các dò đặc hiệu để phủ trên các giếng ELISA. Tuy nhiên trong trường hợp các mẫu bệnh phẩm có nhiễm nhiều genotype HPV thì phương pháp PCR-ELISA vượt tr ội hơn phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. Trong các trường hợp này, nếu muốn đ ịnh genotype HPV bằng kỹ thuật giải trình tự, nhà nghiên cứu cần phải sử dụng phương pháp t ạo dòng khá t ốn kém và mất th ời gian. Abstract Genotyping of HPV by direct sequencing the PCR product specific to L1 gene of the virus Background: The Nam Khoa Biotek co. has developed the PCR-ELISA kit to detect and genotype of HPV from different clinical samples and this kit has been used usefullty at some clinical laboratories in Ho Chi Minh City. However, there have another approach to genotype of HPV, that is the direct sequencing of the PCR product of the L1 gene and align the detected sequence to the library of HPV genotype sequences to get the result of HPV genotyping. Objectives: Develop the direct sequencing of the PCR product specific to the L1 gene for genotyping of the HPV Methods: The authors have tried this approach to detect and genotype of HPV from 39 DNA samples extracted from the cervical swabs that were already confirmed the HPV genotype by PCR-ELISA including 5 genotype 6, 8 genotype 16, 7 genotype 18, 8 genotype 58, 3 genotype 31/33/35 (because in the PCR-ELISA kit produced by Nam Khoa Biotek Co., these 3 genotypes are detected in one ELISA well), 3 genotype 11. In addition, 4 samples that could not be defined the genotype by PCR-ELISA even though the PCR of PCR-ELISA were strongly positive, and 1 positive with both genotype 16 and genotype 11 detected by PCR-ELISA. Results: The received results demonstrated there were no difference between PCR-ELISA and sequencing in the detection and genotyping of the samples infected with single HPV genotype like: 6, 11, 16, 18, and 58. All 3 samples that were defined as 31/33/35 by PCR-ELISA were determined as genotype 33 by sequencing. However with 4 samples that could not be defined the genotype of HPV by PCR-ELISA, the sequencing has determined 1 was belong to genotype 62, one to genotype 83, one to genotype 54 and 1 to geotype 52. The sample that PCR-ELISA has detected as the mixed infection of 2 genotype 16 and 11 was not get the sequencing result even though the PCR give the very clear and strong result. Conclusions: With these results, the authors could conclude that the direct sequencing of the PCR products that were amplified from the L1 gene of HPV could genotype of the HPV that the PCR-ELISA could not detect because of the Tác giả chính, ()Đại Học Y Dược TP. HCM. (2)Công Ty Nam Khoa 1* 1
limitation of the number of wells coated with genotype-specific probes. In addition, the sequencing can also help to improve the HPV genotype PCR-ELISA kit since it could recommend the manufacturer to add more genotype-specific probes in order to detect more currently existed genotype in the patients samples. However, the direct sequencing to genotype the HPC could not replace the PCR-ELISA in samples that contained the mix infection of HPV genotype that required the sequencing of the laboreous and expensive sequencing method: the sequencing of the cloned PCR product. Đặt vấn đề của đề tài này là thử áp dụng và đánh giá các ưu nhược điểm của phương pháp giải trình tự trực Ung thư cổ tử cung là ung thư đứng hàng thứ 2 tiếp sản phẩm PCR để định genotype HPV so của ung thư phụ nữ với số mới mắc phải hàng với phương pháp PCR-ELISA mà công ty Nam năm trên thế giới là 470.000 và tử vong mỗi năm Khoa đã phát triển. là 250.000[1]. HPV là tác nhân đã được xem là có liên hệ với ung thư cổ tử cung [2-5]. Cho đến hiện Vật liệu và phương pháp nghiên cứu nay có trên 100 genotype của HPV đã được xác định trong đó có 29 genotype được phân làm 3 Mẫu thử: Là các mẫu trích biệt DNA của nhóm theo mối liên hệ với ung thư cổ tử cung, bệnh phẩm quệt cổ tử cung đã làm xét nghiệm đó là: nhóm nguy cơ cao với 15 genotype (16, 18, và có kết quả phát hiện và xác định genotype 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, và HPV bằng bộ xét nghiệm “HPV genotype PCR- 82), 3 genotype là thuộc nhóm nguy cơ cao tiềm ELISA kit” do công ty Nam Khoa sản xuất. Có tàng (26, 53, 66), và 11 thuộc nhóm nguy cơ thấp 39 mẫu được lựa chọn, gồm 5 mẫu xác định (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, và 81) [3]. genotype 6, 8 xác định genotype 16, 7 mẫu xác Phương pháp tế bào học (PAP smear) được xem định genotype 18, 8 mẫu xác định genotype 58, 3 là phương pháp khá hữu dụng để có thể phát mẫu xác định genotype 31/33/35 (vì trên bộ kit hiện sớm ung thư cổ tử cung. Tuy nhiên nhờ PCR-ELISA do công ty Nam Khoa sản xuất, 3 ngày nay khoa học đã xác định được các genotype này được phát hiện trong cùng một genotype HPV có nguy cơ cao gây ung thư cổ tử giếng), 3 xác định genotype 11, 4 mẫu không xác cung nên xét nghiệm phát hiện và xác định định được genotype dù giai đọan PCR cho k ết genotype HPV trong các mẫu quệt cổ tử cung quả [+] rất rõ, 1 mẫu cho kết quả vừa dương không chỉ có vai trò hổ trợ xét nghiệm tế bào tính genotype 16 vừa dương tính genotype 11. học mà có nhiều khi còn là xét nghiệm chủ yếu Tất cả các mẫu DNA đều được lưu trử ở -20oC để sàng lọc sớm ung thư cổ tử cung trên phụ cho đến ngày được đưa vào định genotype bằng nữ[2,3,6-10]. Ngòai ra, xét nghiệm phát hiện và xác kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR định genotype HPV còn có giá trị trong đánh giá để xác định genotype. sự phân bố dịch tễ nhờ vậy có thể đánh giá được Thực hiện kỹ thuật PCR: Các mẫu trích biệt sự hữu hiệu của vaccin ngừa HPV. Trước khi có DNA nói trên được thực hiện PCR trong một kỹ thuật khuếch đại người ta dùng kỹ thuật lai PCR mix được gọi là HPV-PCR mix do công ty tại chổ với probe đặc hiệu để phát hiện và định Nam Khoa sản xuất với các thành phần chủ yếu genotype HPV trong mẫu thử, tuy nhiên các là PCR buffer (Biorad), dNTP (Roche), Taq phương pháp này bị hạn chế sử dụng vì kỹ thuật polymerase (Biorad), MgCl2 (Biorad), và mồi phức tạp mà độ nhạy lại thấp [11-13]. Ngày hôm MY09 và MY11 (Invitrogen) ở các nồng độ thích nay, với kỹ thuật khuếch đại, có nhiều phương hợp để khuếch đại một đọan DNA dài 450bp pháp đã được phát triển để phát hiện được trên vùng gen L1 của HPV. Phương pháp có thể genotype của HPV như phương pháp lai trong tóm tắt như sau: Cho 10ul trích biệt DNA vào pha lỏng (hybrid capture 2)[14,15], phương pháp lai tube PCR 0.2 chứa sẵn 40ul HPV PCR mix, sau trên vạch (InoLIPA)[16,17], phương pháp lai trên khi ly tâm nhẹ để lắng cho vào máy luân nhiệt giếng ELISA của Roche Amplicor[18,19]. Tại Việt iCycler (Biorad) chạy chương trình luân nhiệt Nam, công ty Nam Khoa cũng đã phát triển k ỹ gồm 1 chu kỳ 40oC/10 phút, tiếp theo 1 chu kỳ thuật PCR-ELISA để phát hiện và định genotype 95oC/5 phút, tiếp theo 20 chu kỳ với 2 bước HPV ứng dụng trong nghiên cứu [20,21] và hiện nhiệt độ 95oC/30 giây và 70oC/30 giây, tiếp theo cũng đã được áp dụng trong chẩn đóan tại một là 35 chu kỳ với 3 bước nhiệt độ 95oC/1 phút – số bệnh viện như Từ Dũ và Bạch Mai. Tuy 55oC/1 phút – 72oC/1 phút, và cuối cùng là 1 chu nhiên hãy còn một phương pháp tiếp cận khác kỳ 72oC/ 10 phút. Sản phẩm khuếch đại được để định genotype HPV, đó là phương pháp giải điện di trên gel agarose (Biorad) 2% pha trong tyrình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại từ TBE (công ty Nam Khoa sản xuất) 0.5X cùng với vùng gene L1 của HPV[22,23]. Do vậy mục tiêu 2
một giếng chứa thang DNA chuẩn từ 100-1000 Định genotype HPV của trình tự giải được: bp (Biorad). Kết quả được cho là dương tính khi Chúng tôi xác định genotype HPV của trình tự cho vạch khuếch đại rõ nét ở 450 bp. giải được bằng hai cách, đó là: (1) Đăng nhập trình tự giải được lên NCBI blast search để Thực hiện giải trình tự trực tiếp sản phẩm chương trình so sánh trình tự đăng nhập với các PCR: Sản phẩm PCR có kết quả dương tính trình tự trên genbank và hiển thị kết quả so sánh. được làm tinh sạch bằng bộ kit PCR clean-up (2) xây dựng một thư viện các trình tự của các của Promega theo qui trình được hướng dẫn bởi genotype tham chiếu của HPV, cho thư viện này nhà sản xuất để lọai bỏ các dimer primer, và các vào các thư viện của chương trình Bio-edit, sau thành phần không sử dụng hết của PCR mix. đó dùng phân mềm này để đăng nhập trinh t ự Sản phẩm PCR tinh sạch sau đó được định giải được vào local blast search để chương trinh lượng DNA bằng quang phổ GenQuant so sánh trình tự đã đăng nhập với trình tự có (Amersham) và đồng thời điện di lại trên gel trong thư viện rồi hiển thị kết quả so sánh. agarose 2% pha trong TBE 0.5X để chắc chắn đã lọai sạch dimer primer. Sau đó 1 – 2ul sản phẩm Kết quả PCR tinh sạch được thực hiện phản ứng chu kỳ Kết quả phát hiện HPV dựa trên PCR giải trình tự với một mồi MY09, dùng CEQ khuếch đại đọan DNA 450bp trên gene L1: DTCS Quick Start kit (Becman Coulter) theo đúng Trình bày dưới đây là Hình 1 cho thấy kết quả hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng chu kỳ PCR của 39 mẫu DNA trích biệt từ các mẫu giải trình tự được thực hiện trong máy luân quệt cổ tử cung. Kết quả cho thấy tất cả các nhiệt iCycler (Biorad). Sau phản ứng chu kỳ giải mẫu đều cho vạch khuếch đại rõ và sắc, chứng trình tự, sản phẩm được làm tủa bằng ethanol, tỏ kỹ thuật PCR khuếch đại đọan DNA 450bp theo qui trình như hướng dẫn của Becman trên gene đặc hiệu HPV trên gene L1 được thực Coulter. Sau khi đã làm khô, hòa tủa trong đệm hiện rất tốt. Tất cả các mẫu trên sau khi tinh tải mẫu là CEQ Sample Loading Solution sạch với bộ PCR clean-up kit của Promega đều (Becman Coulter), và cuối cùng là giải trình t ự cho sản phẩm khi định lượng DNA trên náy với máy giải trình tự CEQ8000 của Becman GeneQuant cho kết quả định lượng từ 50 đến Coulter. Sau khi hòan tất giải trình tự, k ết quả 65ng/ul với độ tinh sạch (OD260/OD280) của tất giải trình tự được đọc và phân tích bằng phần cả đều trên 1.8. mềm sequence analysis đi kèm theo máy với các thông số được chọn để phân tích là: (1) trình tự Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm của sản phẩm PCR, (2) chất lượng trình tự PCR: Trình bày trong bảng 1 dưới đây kết quả trung bình, và (3) cắt bỏ các trình tự xấu ở cả hai giải trình tự của 39 mẫu sản phẩm PCR sau khi đầu. được làm tinh sạch. Kết quả cho thấy chiều dài giải trình tự được của các sản phẩm PCR 6 7 8 9 10 11 12 13 14 MK 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 MK 31 32 33 34 35 36 37 1 23 4 5 38 39 Kết quả PCR phát hiện HPV của 39 mẫu DNA trích biệt từ quệt cổ tử cung bệnh nhân. Các s ố th ứ Hình 1: tự được đánh dấu bên dưới chỉ mã số của mẫu thử nghiệm. MK là thang DNA t ừ 100 đ ến 1000bp v ới các vạch cách nhau 100bp. Bảng 1: Kết quả chiều dài giải trình tự được của Bảng 2: Kết quả định genotype HPV sau khi đăng các sản phẩm PCR nhập lên trình tự giải được lên NCBI blast search Mẫu số Mẫu số Kết quả PCR-ELISA Kết qu ả đ ịnh genotype HPV sau khi dăng nh ập lên NCBI blast định genotype HPVChiều dài giải trình tự được của sản phẩm PCR 3
thường từ 360bp đến 420bp. Trình bày trong trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. Trong các bảng 2 là kết quả định genotype của các trình tự trường hợp này, nếu muốn định genotype HPV giải được sau khi đang nhập lên NCBI blast bằng kỹ thuật giải trình tự, nhà nghiên cứu cần search. Đa số các trình tự giải được đều cho k ết phải sử dụng phương pháp tạo dòng khá tốn quả định genotype với score khá cao từ 340 đến kém và mất thời gian, hay là phải sử dụng 650. Chỉ có một trường hợp định genotype 62 với phương pháp giải trình tự dùng mồi đặc hiệu score khá thấp, chỉ 117 so với trình tự giải được genotype[24] hay các phương pháp giải trình tự lên đến 397bp (xem bảng 1), chứng tỏ trong trình khác cũng khá phức tạp và tốn kém[25]. tự này, NCBI blast chỉ tìm được không quá 130bp Kết luận là có thể so sánh được với trình tự HPV trong gene bank. Phát hiện và xác định genotype HPV trong các Kết quả local blast search với phần mềm bio- mẫu quệt cổ tử cung lấy từ phụ nữ là một xét edit cũng cho kết quả tương tự NCBI blast nghiệm hiện nay đã được chứng minh là rất cần search vì thư viện genotype HPV được thành lập thiết để sàng lọc và chẩn đóan sớm ung thư cổ cũng do chúng tôi lấy từ các trình tự của các tử cung, và xét về mặt dịch tễ học thì xét genotype HPV tham chiếu từ gene bank. nghiệm này cũng rất cần thiết phải được thực hiện để có thể phát hiện được các genotype đang Biện luận lưu hành trong một vùng hay quần thể dịch tễ Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với các mẫu học để có thể tiên đóan và đánh giá được sự hữu mà PCR-ELISA đã xác định nhiễm một genotype dụng của các phương pháp phòng chống lây HPV như 6 (5 mẫu), 11 (3 mẫu), 16 (8 mẫu), 18 nhiễm cũng như sự hữu hiệu của vaccin phòng (7 mẫu), và 58 (8 mẫu), thì phương pháp giải ngừa. Mặc dù hiện nay tại Việt Nam, công ty trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dài 450bp Nam Khoa đã phát triển bộ thử nghiệm phát hiện khuếch đại từ vùng L2 của HPV cho k ết quả và định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR- hòan tòan trùng khớp với kết quả xác định ELISA ứng dụng được trong nghiên cứu và chẩn genotype HPV bằng kỹ thuật PCR-ELISA thực đóan, tuy nhiên với phương pháp giải trình tự hiện trên bộ “HPV genotype PCR-ELISA kit” do trực tiếp sản phẩm PCR 450bp khuếch đại từ công ty Nam Khoa sản xuất. Với 3 mẫu mà một vùng đặc hiệu HPV trên L2, chúng tôi đã phương pháp PCR-ELISA đã xác định là thuộc nhận định là kit PCR-ELISA của công ty Nam genotype 31/33/35 thì phương pháp giải trình tự Khoa cũng còn cần phải thêm vào khả năng phát đã cho kết quả cả 3 mẫu là genotype 33. Có 4 hiện một số genotype khác, trong đó nhất thiết mẫu mà kết quả PCR-ELISA không xác định phải có genotype 52 là một genotype có nguy cơ được genotype HPV thì phương pháp giải trình cao. Dĩ nhiên đây chỉ là một nghiên cứu bước tự đã xác định được 1 mẫu là genotype 62, một đầu. Chúng tôi cho là nên nghiên cứu giải trình mẫu là genotype 83, một mẫu là genotype 54, và tự để định genotype thêm trên nhiều mẫu nữa, 1 mẫu là genotype 52. Riêng 1 mẫu mà PCR- đặc biệt là các mẫu dương tính HPV mà không ELISA cho kết quả dương tính cả hai genotype có kết quả định genotype với kit PCR-ELISA để 16 và 11 thì không có kết quả với giải trình tự dù từ đó có thể hòan thiện bộ kit PCR-ELISA hiện kết quả PCR cho dương tính rất rõ. Với các k ết có. quả này, chúng tôi nhận định phương pháp giải Tài liệu tham khảo trình tự trực tiếp sản phẩm PCR có khả năng 1. Parkin, D. M., F. I. Bray, and S. S. Devesa. 2001. phát hiện được các genotype HPV mà bộ thử Cancer burden in the year 2000. The global nghiệm PCR-ELISA chưa phát hiện được do trên picture. Eur. J. Cancer 37(Suppl. 8):S4–S66. bộ thử nghiệm không cung cấp các dò đặc hiệu 2. Bosch, F. X., A. Lorincz, N. Munoz, C. J. Meijer, type tương ứng vì số lượng giới hạn của các and K. V. Shah. 2002. The causal relation between giếng được phủ dò đặc hiệu. Ngòai ra, phương human papillomavirus and cervical cancer. J. Clin. pháp giải trình tự trực tiếp để xác định genotype Pathol. 55:244–265. của HPV cũng còn có thể giúp hòan thiện bộ thử 3. Munoz, N., F. X. Bosch, S. de Sanjose, R. Herrero, nghiệm định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR- X. Castellsague, K. V. Shah, P. J. Snijders, and C. J. ELISA vì nhờ kết quả định genotype HPV qua Meijer. 2003. Epidemiologic classification of giải trình tự sẽ cho biết thêm các genotype của human papillomavirus types associated with HPV hiện đang lưu hành để có thể chọn thêm cervical cancer. N. Engl. J. Med. 348:518–527. 4. Walboomers, J. M., M. V. Jacobs, M. M. Manos, F. các dò đặc hiệu để phủ trên các giếng ELISA. X. Bosch, J. A. Kummer, K. V. Shah, P. J. Snijders, Tuy nhiên trong trường hợp các mẫu bệnh phẩm J. Peto, C. J. Meijer, and N. Munoz. 1999. Human có nhiễm nhiều genotype HPV thì phương pháp PCR-ELISA vượt trội hơn phương pháp giải 4
papillomavirus is a necessary cause of invasive 16. Kleter, B., L. J. Van Doorn, L. Schrauwen, A. cervical cancer worldwide. J. Pathol. 189:12–19. Molijn, S. Sastrowijoto, J. ter Schegget, J. 5. Zur Hausen, H. 2002. Papillomaviruses and Lindeman, B. ter Harmsel, M. Burger, and W. cancer: from basic studies to clinical application. Quint. 1999. Development and clinical evaluation Nat. Rev. Cancer 2:342–350. of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line 6. Bosch, F. X., and S. de Sanjose. 2003. Chapter 1: probe assay for detection and identification of Human papillomavirus and cervical cancer-burden anogenital human papillomavirus. J. Clin. and assessment of causality. J. Natl. Cancer Inst. Microbiol. 37:2508-2517 Monogr. 31:3–13. 17. Melchers, W. J., J. M. Bakkers, J. Wang, P. C. de 7. Dannecker, C., U. Siebert, C. J. Thaler, D. Wilde, H. Boonstra, W. G. Quint, and A. G. Kiermeir, H. Hepp, and P. Hillemanns. 2004. Hanselaar. 1999. Short fragment polymerase chain Primary cervical cancer screening by self-sampling reaction reverse hybridization line probe assay to of human papillomavirus DNA in internal medicine detect and genotype a broad spectrum of human outpatient clinics. Ann. Oncol. 15:863–869. papillomavirus types. Clinical evaluation and 8. Jin, X. W., K. Zanotti, and B. Yen-Lieberman. follow-up. Am. J. Pathol. 155:1473-1478. 2005. New cervical cancer screening strategy: 18. Maria T. Sandri, Paola Lentati, et al. 2006. combined Pap and HPV testing. Cleveland Clin. J. Comparison of the Digene HC2 Assay and the Med. 72:141–148. Roche AMPLICOR Human Papillomavirus (HPV) 9. Munoz, N., S. Franceschi, C. Bosetti, V. Moreno, R. Test for Detection of High-Risk HPV Genotypes in Herrero, J. S. Smith, K. V. Shah, C. J. Meijer, and Cervical Samples. Journal of Clinical Microbiology. F. X. Bosch. 2002. Role of parity and human 44(6): 2141-2146, Vol. 44, No. 6 papillomavirus in cervical cancer: the IARC 19. Maaike A. P. C. van Ham, Judith M. J. E. Bakkers, multicentric case-control study. Lancet 359:1093– Gonneke K. Harbers, Wim G. V. Quint, Leon F. A. 1101. G. Massuger, and Willem J. G. Melchers. 2005. 10. Nieminen, P., S. Vuorma, M. Viikki, M. Hakama, Comparison of Two Commercial Assays for and A. Anttila. 2004. Comparison of HPV test Detection of Human Papillomavirus (HPV) in versus conventional and automation-assisted Pap Cervical Scrape Specimens: Validation of the screening as potential screening tools for Roche AMPLICOR HPV Test as a Means To Screen preventing cervical cancer. BJOG 111:842–848. for HPV Genotypes Associated with a Higher Risk 11. Melchers, W. J., P. Herbrink, W. G. Quint, J. M. of Cervical Disorders. Journal of Clinical Walboomers, C. J. Meijer, and J. Lindeman. 1988. Microbiology. 43(6): 2662-2667 Prevalence of genital HPV infections in a regularly 20. Nguyễn Thị Ngọc Dung. 2005. Luận văn Tiến Sĩ screened population in The Netherlands in relation Y Khoa chuyên ngành Tai Mũi Họng to cervical cytology. J. Med. Virol. 25:11-16. 21. Kiều Dung. 2005. Luận văn chuyên khoa cấp 2 12. Melchers, W. J., P. Herbrink, J. M. Walboomers, C. chuyên ngành sản phụ khoa. J. Meijer, H. V. D. Drift, J. Lindeman, and W. G. 22. Unger, E. R., S. D. Vernon, W. W. Thoms, R. Quint. 1989. Optimization of human papillomavirus Nisenbaum, C. O. Spann, I. R. Horowitz, J. P. genotype detection in cervical scrapes by a Icenogle, and W. C. Reeves. 1995. Human modified filter in situ hybridization test. J. Clin. papillomavirus and disease-free survival in FIGO Microbiol. 27:106-110. stage Ib cervical cancer. J. Infect. Dis. 172:1184– 13. Walboomers, J. M., W. J. Melchers, H. Mullink, C. 1190. J. Meijer, A. Struyk, W. G. Quint, J. van der 23. Suzanne D. Vernon, Elizabeth R. Unger, Deon Noordaa, and J. ter Schegget. 1988. Sensitivity of in Williams. 2000. Comparison of Human situ detection with biotinylated probes of human Papillomavirus Detection and Typing by Cycle papilloma virus type 16 DNA in frozen tissue Sequencing, Line Blotting, and Hybrid Capture. sections of squamous cell carcinomas of the cervix. Journal of Clinical Microbiology. 38(2): 651–655 Am. J. Pathol. 131:587-594 24. Baback Gharizadeh, Maria Oggionni, Biying 14 Cox, J. T., A. T. Lorincz, M. H. Schiffman, M. E. Zheng, Edit Akom, Nader Pourmand, Afshin Sherman, A. Cullen, and R. J. Kurman. 1995. Ahmadian, Keng-Ling Wallin, and Pål Nyre´n. Human papillomavirus testing by hybrid capture 2005. Type-Specific Multiple Sequencing Primers A appears to be useful in triaging women with a Novel Strategy for Reliable and Rapid Genotyping cytologic diagnosis of atypical squamous cells of of Human Papillomaviruses by Pyrosequencing undetermined significance. Am. J. Obstet. Gynecol. Technology. Journal of Molecular Diagnostics. 172:946-954. 7( 2):198-205 15. The Atypical Squamous Cells of Undetermined 25. Joshua h. Nelson, Gregory A. Hawkins, et al. 2000. Significance/Low-Grade Squamous Intraepithelial A Novel and Rapid PCR-Based Method for Lesions Triage Study (ALTS) Group. 2000. Human Genotyping Human Papillomaviruses in Clinical papillomavirus testing for triage of women with Samples. Journal of clinical microbiology. 38(2):. cytologic evidence of low-grade squamous 688–695 intraepithelial lesions: baseline data from a randomized trial. J. Natl. Cancer Inst. 92:397-402 5
6