Xác định, xếp loại và khảo sát sự biểu hiện của các gen mã hóa dehydrin (DHN) ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.) bằng phân tích in silico

TẠP CHÍ KHOA HỌC<br /> Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Số 10 (9/2017) tr 47 - 54<br /> <br /> XÁC ĐỊNH, XẾP LOẠI VÀ KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN<br /> CỦA CÁC GEN MÃ HÓA DEHYDRIN (DHN)<br /> Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merr.)<br /> BẰNG PHÂN TÍCH IN SILICO<br /> Vũ Thị Nự, Nguyễn Thị Sơn, Hà Mạnh Linh6<br /> Trường Đại học Tây Bắc<br /> Tóm tắt: Bằng phân tích in silico, chúng tôi đã xác định được 11 gen mã hóa cho các protein Dehydrin<br /> (DHN) trong hệ gen của cây đậu tương. Các protein suy diễn của các gen này đều có mang trình tự bảo thủ đặc<br /> hiệu cho DHN là phân mảnh K đã được báo cáo ở nhiều loài. Phân tích cây phát sinh chủng loại cho thấy, các<br /> DHN của cây đậu tương nằm trên ba nhánh khác nhau, có một số hiện tượng nhân gen xảy ra sau quá trình biệt hóa<br /> loài. Kết quả phân tích RNAseq cho thấy có 7 trong 11 gen DHN biểu hiện ở ít nhất một loại mô của cây đậu tương,<br /> chỉ hai gen GmDHN1 và GmDHN9 biểu hiện ở tất cả các loại mô nghiên cứu, đồng thời hai gen này cũng biểu hiện<br /> mạnh hơn các gen khác ở hầu hết các mô. Hai gen GmDHN1 và GmDHN9 biểu hiện mạnh ở mô hoa, mô vỏ quả, rễ<br /> và biểu hiện yếu hơn ở mô hạt, lá non và nốt sần. Gen GmDHN6 và GmDHN8, biểu hiện mạnh hơn so với các gen<br /> còn lại ở hạt trong giai đoạn phát triển muộn, các gen GmDHN2, GmDHN3, GmDHN5 và GmDHN11 không biểu<br /> hiện ở các loại mô được nghiên cứu.<br /> Từ khóa: Biểu hiện gen, cây di truyền, Dehydrin (DHN), đậu tương.<br /> <br /> 1. Mở đầu<br /> Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr) là một trong những cây trồng quan trọng, có<br /> lịch sử trồng trọt lâu đời, được trồng ở nhiều nước trên thế giới từ châu Âu, châu Á, châu Phi,<br /> châu Mỹ, nhất là ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Hạt đậu tương là loại sản phẩm có giá trị<br /> đồng thời cả về protein và lipit [3]. Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương rất cao, với<br /> hàm lượng protein từ 38 - 40%, lipit từ 15 - 20%, hyđratcacbon từ 15 - 16% và muối khoáng<br /> quan trọng cho sự sống. Ở nước ta, trong những thập niên gần đây diện tích trồng đậu tương<br /> không ngừng tăng lên [9]. Nhờ giá trị cao, hệ gen của đậu tương đã được giải trình tự vào<br /> năm 2010 bởi tập thể các nhà khoa học dẫn đầu bởi G. Stacey, R. Shoemaker, S. Jackson, J.<br /> Schmutz, và D. Rokhsar. Phiên bản hệ gen của cây đậu tương hiện có kích thước xấp xỉ 975<br /> Mb, gồm có 20 nhiễm sắc thể [15]. Đối với một loài sinh vật có hệ gen được giải trình tự, việc<br /> nghiên cứu về cấu trúc và chức năng hệ gen (genomics) có ý nghĩa rất quan trọng. Ở Việt<br /> Nam, có nhiều nguyên nhân làm giảm diện tích cũng như năng suất đậu tương như ánh sáng,<br /> độ ẩm, nhiệt độ, kĩ thuật, mùa vụ, hạn hán, đặc điểm di truyền của các giống. Trong đó, hạn<br /> hán là nguyên nhân chủ yếu làm giảm diện tích và năng suất của đậu tương do đó việc xác<br /> định và nghiên cứu sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương là<br /> việc làm cần thiết.<br /> Dehydrin (DHN) là một họ bao gồm nhiều loại protein có số lượng lớn trong giai đoạn<br /> phát triển phôi muộn, đóng vai trò quan trọng trong khả năng thích nghi của thực vật với các<br /> điều kiện bất lợi [5, 8]. DHN gồm các protein được xếp vào nhóm II (LEA2-D11) của họ Late<br /> 6<br /> <br /> Ngày nhận bài: 03/01/2017. Ngày nhận kết quả phản biện: 10/5/2017. Ngày nhận đăng: 20/9/2017<br /> Liên lạc: Vũ Thị Nự, e - mail: vuthinu09@gmail.com<br /> 47<br /> <br /> Embryogenesis Abundant protein (LEA) [5]. Các DHN được xác định đều có ái lực cao với<br /> nước, tính chất này giúp chúng giữ được nước ngay cả trong điều kiện tế bào mất nước mạnh.<br /> DHN bền với nhiệt và có thể giữ nguyên vẹn cấu trúc không bị thay đổi trong dung dịch nước ở<br /> nhiệt độ đến 100C, nhóm này có 3 đoạn bảo thủ kí hiệu là Y, S, K [5, 8]. Dựa vào cấu trúc<br /> DHN được chia thành 6 nhóm: Kn, SKn, KnS, YnKn và YnSKn và SKS [11]. DHN phân bố trong<br /> nhiều mô tế bào ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau: Mô sinh dưỡng và mô sinh thực. Một<br /> số DHN như protein RAB18 của Arabidopsis và RAB (response to abscisic acid) của ngô tìm<br /> thấy trong hạt; ở hầu hết các mô của mầm và lá mầm [8]. Trong tế bào, DHN được phát hiện ở<br /> tế bào chất, nhân, màng tế bào và ty thể. Phần lớn các DHN được tìm thấy trong cây khi bị tác<br /> động của điều kiện bất lợi, tác động của abscisic acid (ABA), hạn, lạnh, độ mặn cao [10]. Hiện<br /> nay, đã có hơn 800 trình tự gen DHN đã được phân lập và hơn 700 trình tự protein DHN đã<br /> được xác định từ nhiều loài thực vật khác nhau (hạt kín, hạt trần và thực vật bậc thấp) [8]. Trên<br /> cây đậu tương, một số gen DHN cũng đã được tách dòng và xác định trình tự [12, 18]. Trong<br /> nghiên cứu này, bài báo sử dụng phương pháp In Silico để xác định trình tự của các DHN trong<br /> hệ gen của cây đậu tương, xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân loại các DHN, đồng thời<br /> khảo sát sự biểu hiện của các gen DHN ở loài cây này.<br /> 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu<br /> 2.1. Cơ sở dữ liệu về các trình tự hệ gen và RNAseq ở cây đậu tương<br /> Các trình tự được khai thác từ cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen (NCBI). Trong đó, trình<br /> tự hệ gen của cây đậu tương theo công bố của Schmutz và cs. (2010), dữ liệu RNAseq theo<br /> Severin và cs. (2010), các trình tự DHN của cây Arabidopsis theo Hundertmark và Hincha<br /> (2008) [6, 15, 16].<br /> 2.2. Xác định các gen thuộc họ DHN ở cây đậu tương<br /> Mười protein DHN của cây Arabidopsisthaliana (AT1G20440, AT1G20450,<br /> AT1G54410, AT1G76180, AT2G21490, AT3G50970, AT3G50980, AT4G38410,<br /> AT4G39130, AT5G66400) [6] được dùng làm khuôn dò để tìm kiếm các gen tương đồng trên<br /> dữ liệu nucleotide của toàn hệ gen của cây đậu tương nhờ chương trình TBLASTN theo Cao<br /> Phi Bằng và Trần Thị Thanh Huyền (2015) [1].<br /> 2.3. Các đặc điểm hóa - lí<br /> Các đặc điểm vật lí, hóa học của các gen/protein nghiên cứu được khảo sát nhờ các<br /> công cụ của ExPASy (Expert Protein Analysis System) [3].<br /> 2.4. Xây dựng cây phả hệ<br /> Cây phả hệ được xây dựng từ các trình tự protein nghiên cứu của các loài Arabidopsis,<br /> dương và quýt đường đã được sắp xếp nhờ phần mềm MEGA5 bằng sử dụng phương pháp<br /> Maximum Likelihood và tuân theo các tham biến: mẫu Jones-Taylor-Thornton (JTT), dữ liệu<br /> được xử lí là tất cả các vị trí và phương pháp Bootstrap với 1.000 lần lặp lại [17].<br /> 48<br /> <br /> 2.5. Khảo sát sự biểu hiện gen<br /> Bảng 1. Đặc điểm gen dehydrin của cây đậu tƣơng<br /> Kích thước Khối lượng<br /> protein<br /> phân tử<br /> Chỉ số Chỉ số<br /> suy diễn<br /> protein<br /> ưa nước béo<br /> (aa)<br /> suy diễn (KD)<br /> <br /> Số<br /> itron<br /> <br /> Gen<br /> <br /> Tên locus<br /> <br /> Chiều dài<br /> gen/ đoạn<br /> mã hóa<br /> <br /> GmDHN1<br /> <br /> Glyma04g01130<br /> <br /> 1375/645<br /> <br /> 214<br /> <br /> 24,16<br /> <br /> -1,509<br /> <br /> 50,09 5,53<br /> <br /> 1<br /> <br /> GmDHN2<br /> <br /> Glyma04g01181<br /> <br /> 657/501<br /> <br /> 166<br /> <br /> 17,32<br /> <br /> -0,971<br /> <br /> 51,81 9,22<br /> <br /> 1<br /> <br /> GmDHN3<br /> <br /> Glyma06g01171<br /> <br /> 540/400<br /> <br /> 132<br /> <br /> 13,34<br /> <br /> -1,36<br /> <br /> 51,17 5,22<br /> <br /> 2<br /> <br /> GmDHN4<br /> <br /> Glyma07g10030<br /> <br /> 1730/732<br /> <br /> 243<br /> <br /> 26,55<br /> <br /> -1,211<br /> <br /> 39,58 6,18<br /> <br /> 2<br /> <br /> GmDHN5<br /> <br /> Glyma08g05361<br /> <br /> 276/276<br /> <br /> 91<br /> <br /> 9,90<br /> <br /> -1,062<br /> <br /> 55,71 6,64<br /> <br /> 0<br /> <br /> GmDHN6<br /> <br /> Glyma09g31740<br /> <br /> 1218/762<br /> <br /> 253<br /> <br /> 26,63<br /> <br /> -1,244<br /> <br /> 27,79 6,29<br /> <br /> 2<br /> <br /> GmDHN7<br /> <br /> Glyma12g36430<br /> <br /> 1650/408<br /> <br /> 135<br /> <br /> 14,69<br /> <br /> -1,066<br /> <br /> 62,15 5,54<br /> <br /> 1<br /> <br /> GmDHN8<br /> <br /> Glyma13g27120<br /> <br /> 1815/420<br /> <br /> 139<br /> <br /> 15,13<br /> <br /> -1,186<br /> <br /> 51,22 5,52<br /> <br /> 1<br /> <br /> GmDHN9<br /> <br /> Glyma16g04190<br /> <br /> 1406/339<br /> <br /> 112<br /> <br /> 12,59<br /> <br /> -1,874<br /> <br /> 31,34 6,24<br /> <br /> 1<br /> <br /> GmDHN10 Glyma16g04200<br /> <br /> 1351/255<br /> <br /> 84<br /> <br /> 9,44<br /> <br /> -1,942<br /> <br /> 32,50 6,21<br /> <br /> 1<br /> <br /> GmDHN11 Glyma17g24193<br /> <br /> 3231/498<br /> <br /> 165<br /> <br /> 18,89<br /> <br /> -1,623<br /> <br /> 46,06 6,92<br /> <br /> 2<br /> <br /> pI<br /> <br /> Sự biểu hiện của các gen được phân tích thông qua ngân hàng RNAseq của cây đậu<br /> tương được xây dựng bởi Severin và cs. (2010) [16]. Các gen được khảo sát bằng cách đếm số<br /> lượng trình tự biểu hiện trong các cơ sở dữ liệu tồn tại trên trang web NCBI nhờ chương trình<br /> TBLASTN [1].<br /> 3. Kết quả và thảo luận<br /> 3.1. Số lượng và đặc điểm các gen dehydrin của cây đậu tương<br /> Sử dụng mười protein dehydrin của cây Arabidopsis thaliana làm khuôn dò, đã tìm thấy<br /> tổng số 11 gen mã hóa cho các dehydrin ở trong toàn bộ hệ gen của cây đậu tương. Các locus<br /> gen tìm được tương ứng với các protein khuôn dò như sau: Protein AT1G20440 tìm được 4<br /> gen (Glyma09g31740, Glyma06g01171, Glyma04g01181 và Glyma04g01130); AT1G20450<br /> tìm được 1 gen (Glyma16g04190); AT1G54410 tìm được 2 gen (Glyma17g24193 và<br /> Glyma16g04200); AT1G76180 tìm được 4 gen (Glyma12g36430, Glyma13g27120,<br /> Glyma08g05361 và Glyma07g10030); các protein còn lại không tìm được gen tương ứng.<br /> Phân tích cấu trúc bậc một suy diễn các protein DHN của cây đậu tương, cho thấy các<br /> protein này đều mang các vùng bảo thủ đặc hiệu (Hình 1) cho các DHN đã được báo cáo ở<br /> nhiều loài khác là phân mảnh K.<br /> Các gen DHN của cây đậu tương có độ dài từ 276 tới 3231 nucleotide, kích thước của<br /> trình tự mã hóa của các gen là từ 255 đến 762 nucleotide. Trình tự các protein suy diễn có<br /> kích thước từ 84 tới 253 amino acid, tương ứng với khối lượng phân tử từ 9,44 KD tới 26,63<br /> 49<br /> <br /> KD. Hầu hết các dehydrin của cây đậu tương đều có tính axit yếu, pI của các protein này nằm<br /> trong khoảng 5,22 tới 6,92. Riêng GmDHN2 có tính bazơ, pI bằng 9,22 (Bảng 1). Các DHN<br /> cây đậu tương có tính ưa nước tương đối cao, chỉ số ưa nước từ -0,971 đến -1,942 trong đó<br /> cao nhất là GmDHN10. Tính ưa nước của các DHN ở cây đậu tương cũng tương đương với<br /> tính ưa nước của các DHN của cây quýt đường (Citrus clementina) đã được báo cáo [2]. Các<br /> gen này có chỉ số béo khác nhau dao động từ 31,34 đến 62,15 cao hơn so với các DHN ở cây<br /> quýt đường (Citrus clementina) [2].<br /> <br /> Hình 1. Kết quả sắp dãy các protein DHN của cây đậu tƣơng<br /> Ghi chú: Dấu  đánh dấu các amino acid bảo thủ, các kí tự được đóng khung thể hiện vùng bảo thủ.<br /> <br /> 50<br /> <br /> 3.2. Phân tích cây phả hệ<br /> Cây phả hệ được xây dựng từ các DHN của cây đậu tương và các loài cây khác<br /> (Arabidopsis, dương, quýt) được thể hiện ở Hình 2.<br /> <br /> Hình 2. Cây phả hệ đƣợc xây dựng từ các DHN của các loài A.thaliana (At),<br /> đậu tƣơng (Gm), dƣơng (Ptr) và quýt (Ccl)<br /> <br /> Các DHN của cây đậu tương nằm trên ba nhánh khác nhau. Nhánh thứ nhất gồm<br /> GmDHN2, GmDHN7 và GmDHN8. Ba trình tự này nằm trên cùng nhánh với PtrDHN2 và<br /> PtrDHN8 của cây dương. Hai trình tự này của cây dương được xếp vào nhóm YnSKn hay<br /> 51<br /> <br />