Xây dựng kit PCR phát hiện sự tạp nhiễm thành phần có nguồn gốc từ heo và gà trong thực phẩm chay

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

14
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của nghiên cứu này là xây dựng kit PCR phát hiện sự tạp nhiễm thành phần có nguồn gốc từ động vật và áp dụng quy trình vào kiểm tra tính thuần chay của một số mẫu thực phẩm chay trên thị trường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng kit PCR phát hiện sự tạp nhiễm thành phần có nguồn gốc từ heo và gà trong thực phẩm chay

Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 67 XÂY DỰNG KIT PCR PHÁT HIỆN SỰ TẠP NHIỄM THÀNH PHẦN CÓ NGUỒN GỐC TỪ HEO VÀ GÀ TRONG THỰC PHẨM CHAY (ESTABLISHMENT OF PCR KIT FOR DETECTION OF ADULTERY FROM PORK AND CHICKEN IN VEGETARIAN FOOD) Trần Kiến Đức, Phan Thị Trâm, Lê Thị Ngọc Châu Khoa Công nghệ sinh học, Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh SUMMARY “Veganicity”, meant it do not contain any ingredients which have origin from animals is an important feature in the processing and manufacturing of vegetarian foods. However, checking veganicity in product is the great challenge that has no any concrete assay to find out whether the presence of ingredients animal in vegetarian food. For purpose to check whether or not the presence of animal ingredients in vegetarian food, initiallly established PCR kit for detection of adultery from pork and chicken in vegetarian food based on the amplification of mitochondrial 16S rDNA, which was specific to animal species, by TP1 and TP2 primers. Stimultaneously, the internal control was carried out by amplication of a noncoding region of chloroplast DNA genome by specific primer CLO1 and CLO2. The methodologic of these PCR kit was executed from in silico survey to in vitro. The initial experiment was carried out on 23 samples, which were collected from local market and many vegeterian food companies. As the results, 9/23 samples (counting for 39.13%) were detected as containing of the animal ingredients that are controled with the internal control, positive control and negative control. From the experimental results, we confirmed that initially succeeded in establishment of PCR kit to aplly detecting the presence of ingredients animal in vegetarian food. Keywords: 16S rDNA mitochondrial, animal, chloroplast DNA, PCR, plant, vegetarian food. MỞ ĐẦU Thực phẩm chay được hiểu là thực trong quá trình chế biến, sản xuất thực phẩm phẩm không chứa các thành phần có nguồn chay là “tính thuần chay”. Tính thuần chay gốc từ động vật. Thuật ngữ “ăn chay” được được hiểu là trong thực phẩm chay không biết đến nhiều ở đạo Phật và nhiều tôn giáo nhiễm bất kỳ thành phần nào có nguồn gốc từ khác với nhiều hình thức “ăn chay” khác nhau. động vật. Tuy nhiên, tính thuần chay có được Hiện nay, xu hướng ăn chay ngày càng gia đảm bảo trong quá trình chế biến hay không tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới cũng như ở vẫn là một vấn đề, một thách thức đối với thị Việt Nam. Lý do sự gia tăng ăn chay xuất phát trường thực phẩm chay. Đặc biệt, đối với các từ nhiều quan niệm khác nhau, chẳng hạn như: công ty sản xuất, xuất khẩu thực phẩm chay ăn chay là một phương thức trong việc phòng thì đặc tính này đóng vai trò quyết định. Hơn chống các bệnh tật nguy hiểm liên quan đến nữa, trong nước việc kiểm tra tính thuần chay tim mạch, cao huyết áp, ung thư; hay do quan vẫn chưa có một quy trình phát hiện hay một niệm về tôn giáo…. Nắm bắt được xu thế phát cơ quan có thẩm quyền nào đảm nhận. Do đó, triển, nhu cầu thị hiếu của người sử dụng, thị một số công ty thực phẩm chay với mục đích trường thực phẩm chay ngày càng phát triển để đảm bảo “thương hiệu” phải gửi mẫu thực với nhiều mẫu mã thực phẩm chay đa dạng, phẩm (sản phẩm và/hoặc nguyên liệu sản phong phú như: thịt gà chay, heo chay, bò viên xuất) sang nước ngoài để kiểm định. Xuất phát chay,… Một trong những vấn đề quan tâm từ nhu cầu thực tế trên, việc nghiên cứu và
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 68 phát triển một quy trình, bộ kit nhằm kiểm ở lục lạp được sử dụng làm chứng nội kiểm định sự hiện diện có thành phần có nguồn gốc soát quá trình phản ứng PCR. Chứng nội IAC từ động vật trong thực phẩm chay là cần thiết. (Internal Amplification Control)là một thành Trên thế giới, phương pháp PCR phần quan trọng của một kit PCR, chứng nội (polymerase chain reaction) là phương pháp được sử dụng để chứng minh PCR không bị thông dụng được nhiều tác giả sử dụng để ức chế bởi các yếu tố, thành phần trong thực khuếch đại trình DNA đích của các thành phẩm, bắt buộc phải luôn xuất hiện trong các phần có nguồn gốc từ động vật. Một số các mẫu thực phẩm chay và mẫu đối chứng âm trình tự đích được sử dụng như gen (thực vật), sử dụng chứng nội nhằm mục đích Cytochrome b của bộ gen ty thể, 12S rDNA kiểm soát sự âm tính giả (kết quả thật sự âm của ty thể, 16S rDNA ty thể…Trong nghiên tính bắt buộc phải có sự hiện diện của vạch cứu này, 16S rDNA ty thể được chọn làm sản phẩm chứng nội khi điện di) nhằm tăng trình tự DNA đích cho phản ứng PCR, lý do cao độ chính xác của kết quả. Mục đích của cho sự lựa chọn này (1) 16S rDNA có tính nghiên cứu này là xây dựng kit PCR phát phổ quát, tính bảo tồn cao trong cùng một hiện sự tạp nhiễm thành phần có nguồn gốc loài, chúng thay đổi chậm theo thời gian; (2) từ động vật và áp dụng quy trình vào kiểm tra Số lượng nhiều bản sao 16S rDNA trong tế tính thuần chay của một số mẫu thực phẩm bào…Bên cạnh đó, vùng gen không mã hóa chay trên thị trường. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các mẫu động vật, thực vật và một số như công ty thực phẩm chay Âu Lạc, từ chợ mẫu thực phẩm chay được thu thập ngẫu Thủ Dầu Một và siêu thị. nhiên từ các công ty sản xuất thực phẩm chay Thiết kế mồi Trình tự mồi TP1-TP2 được thiết kế bắt với trình tự gen không mã hóa của lục lạp. cặp đặc hiệu trên trình tự gen 16S rDNA ty Mồi sau khi thu thập và thiết kế được đánh thể của các loài động vật thu thập từ ngân giá các thông số vật lý như độ dài, nhiệt độ hàng Genbank (NCBI: nóng chảy, %GC, năng lượng hình thành các http://ncbi.nlm.nih.gov) bằng các phần mềm cấu trúc bậc hai…bằng phần mềm trực tuyến trực tuyến như Primer3 (v.0.4.0) IDT (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0), Annhyb. (http://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/ Mồi CLO1 và CLO2 sử dụng làm chứng nội, OligoAnalyzer). Đồng thời tính đặc hiệu của được thu thập từ nghiên cứu của Taberlet P. cặp mồi được kiểm tra bằng chương trình và cs (1991), cặp mồi này bắt cặp đặc hiệu BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Tách chiết DNA DNA được tách chiết theo phương HCl 1M, EDTA 0.5M, ddH2O). Sau khi đồng pháp Phenol-Chloroform có sự biến đổi pH = nhất, hút 750 µL dịch chuyển vào ống 4 thành pH = 8. Các mẫu trước khi được tiến eppendorf mới, bổ sung 20 µL SDS 10% và hành tách chiết DNA, các mẫuđược rửa sạch 20 µL proteinase K (1 mg/mL), ủ qua đêm ở cắt và giã nhuyễn thành một mẫu đồng nhất. nhiệt độ 65°C. Sau đó, 250 µL NaCl bão hòa Lấy 2,0 g mẫu dịch này huyền phù với 4 mL được bổ sung, và ủ mẫu ở 4°C trong 30 phút, dung dịch đồng nhất mẫu (NaCl 5M, Tris- đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút.
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 69 Chuyển 500 µL dịch vào ống eppendorf mới thực hiện với NH4OAc và Isopropanol ở và bổ sung 500 µL hỗn hợp nhiệt độ -20°C trong vòng 2 giờ. Sau đó, tiến phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:41:1) hành ly tâm thu tủa và lưu giữ DNA trong đảo nhẹ ống, ly tâm 13.000 vòng/phút trong dung dịch TE cho những thí nghiệm sau này. 10 phút (lặp lại 2-3 lần), thêm 500 µL Nồng độ DNA được xác định thông qua Chloroform, đảo nhẹống và ly tâm 13.000 phương pháp đo OD và kiểm tra độ tinh sạch vòng/phút trong 10 phút. Quá trình tủa được của mẫu thông qua trị sốA260/A280. Phản ứng PCR Phản ứng PCR được thực hiện với chu phút, 4°C tới ∞. Thành phần phản ứng PCR trình nhiệt như sau: 1 chu kỳ với nhiệt độ được thể hiện ở Bảng 1. Sản phẩm PCR được 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳvới nhiệt điện di trên gel agarose 1,5% và giải trình tự độ95°C trong 30 giây, 67°C trong 1 phút, tại công ty Nam Khoa. 72°C trong 1 phút; 1 chu kỳ 72°C trong 5 Bảng 1. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR Lượng (µL) Thành phần Phản ứng PCR Multiplex PCR Master mix (2X) 7.5 7.5 Mồi TP1(10 µM) 0.5 0.5 MồiTP2 (10 µM) 0.5 0.5 Mồi CLO1 0.5 Mồi CLO2 0.5 DNA khuôn 1.0 1.0 ddH2O 5.5 4.5 Tổng thể tích 15.0 15.0 Chu trình nhiệt
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 70 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát đặc tính mồi sử dụng trong nghiên cứu Các đặc tính vật lý của mồi được đánh giá bằng phần mềm IDT thể hiện ở Bảng 2. Bảng 2. Các đặc tính vật lý của mồi TP1-TP2 và CLO1-CLO2 Chiều Mồi Trình tự (5’ - 3’) %GC Tm(°C) (1) (2) (3) dài CCYAGGGATAACAGC - TP1 21 54,7 55,5 0,81 - GCAATC 1,47 1,5 TCCGGTCTGAACTCAG - - 7 TP2 21 52,4 56.2 ATCAC 2,00 1,34 GGTTCAAGTCCCTCTA - CLO1 20 54,4 55 0,36 - TCCC 3,07 8,7 ATTTGAACTGGTGACA - - 6 CLO2 20 52,8 45 CGAG 0,32 3,61 Ghi chú: (1): là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hairpin loop (kcal/mole) (2): là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc selfdimer (kcal/mole) (3): là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc heterodimer (kcal/mole) Dựa trên kết quả Bảng 2, các giá trị vật lý về tự gen đích, độ bao phủ đạt 100%, các giá trị chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm) và E-value, Max Score, Total Score, Ident đều sự chênh lêch nhiệt độ nóng chảy (∆Tm) đều đạt độ in cậy rất cao. Đồng thời, khả năng bắt thỏa mãn các yêu cầu trong thiết kế mồi. Về cặp của mồi được xác định bằng chương trình giá trị ΔG phần lớn đều thỏa mãn lớn hơn -9 Annhyb và ClustalX, kết quả cho thấy cặp mồi Kcal/mol, ngoại trừ năng lượng hình thành TP1-TP2 bắt cặp đặc hiệu với gen 16S rDNA cấu trúc tự bắt cặp của mồi TP1-TP2. Tuy ty thể động vật, kích thước sản phẩm khuếch nhiên, khi tiến hành kiểm tra bằng phần mềm đại là 154 bp, cặp mồi CLO1-CLO2 bắt cặp trực tuyến IDT, cấu trúc tự bắt cặp xảy ra ở đặc hiệu với trình tự gen không mã hóa ở lục đầu 5’ và giá trị này không chênh lệch quá lạp, kích thước sản phẩm khuếch đại là 426 nhiều so với yêu cầu. Do đó, cặp mồi này vẫn bp. Dựa trên những kết quả thu nhận được, cặp được sử dụng và kiểm tra tính đặc hiệu. mồi TP1-TP2 và CLO1-CLO2 được chọn để Tính đặc hiệucủa cặp mồi được kiểm tra sử dụng cho cácnghiên cứu thực nghiệm sau bằng chương trình BLAST, kết quả cho thấy này. cả hai cặp mồi đều bắt cặp đặc hiệu với trình
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 71 (A) (B) (C) Hình 1. (A) Sự bắt cặp của TP1 và TP2 lên trình tự 16S rDNA của Sus scrofa (Mã số truy cập trên Genbank: KC208030). Vị trí Y trong cặp mồi TP1 tương thích với nucleotide C trong trình tự bắt cặp; Kết quả BLAST (B) cặp mồi TP1 và (C) TP2 thể hiện tính đặc hiệu của mồi
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 72 (A) (B) (C) Hình 2. (A) Sự bắt cặp của CLO1 và CLO2 lên trình tự DNA không mã hóa của Lactuca sativa(Mã số truy cập trên Genbank: AP007232); Kết quả BLAST (B) cặp mồi CLO1 và (C) CLO2 thể hiện tính đặc hiệu của cặp mồi Kết quả kiểm tra 23 mẫu thực phẩm chay trên thị trường Khảo sát 23 mẫu thực phẩm chay trên thị tại Thủ Dầu Một) và 2 mẫu động vật (heo, gà) trường (12 mẫu thực phẩm chay từ siêu thị, 3 làm đối chứng dương, 1 mẫu thực vật (cải bắp) mẫu thu thập từ chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình làm đối chứng âm. Kết quả điện di được thể Dương, 5 mẫu của công ty thực phẩm chay Âu hiện ở hình 3. Lạc, 3 mẫu thực phẩm chay từ quán cơm chay
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 73 (A) Chú thích: 1, 2, 3, 4, 5: mẫu thực phẩm vật (thịt heo). 11: Mẫu động vật (thịt gà). 15: chay từ công ty Âu Lạc (thứ tự:đùi gà xả chay, mẫu hỗn hợp (tỉ lệ heo:gà:thực vật: 1:1:1). 16, thịt nạc kho chay, sườn ram chay, bò kho 17, 18, 19, 20:mẫu hỗn hợp (thực phẩm chay chay, pate gan ngỗng chay). 6, 7, 8: mẫu thực Âu Lạc:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1). 21, 22, phẩm chay từ quán cơm chay tại Thủ Dầu 23: Mẫu hỗn hợp (thực phẩm chay từ chợ Thủ Một(thứ tự mẫu: heo chiên chay, chả trứng vịt Dầu Một:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1). 24, 25, chay, chả cá chay). 12, 13, 14: mẫu thực phẩm 26: Mẫu hỗn hợp (nguồn cung cấp ngoài:động chay từ chợ Thủ Dầu Một (thứ tự: gà cục chay, vật (heo) theo tỷ lệ 3:1). M: Thang chuẩn 100 bột xù, thịt gà xé chay). 9: Mẫu động vật (thịt bp. heo). 10: mẫu thực vật (cải bắp) Mẫu động (B) (C) Chú thích:1, 2, 3, 4, 5, 6: Lúa mạch nâu Chú thích:1, 2, 3, 4, 5, 6: Bột nêm gà chay 1, hạt, lúa mạch vàng khúc, Amila vàng lát nhỏ, bột nêm gà chay 2, bạch kim kê, burger tiêu Amila bạch kê cục, bột nêm bào ngư, bột nêm đen, dăm bông chay, chả lụa Vegan. ĐV: gà thuần chay.7: Động vật (heo). 8: Mẫu trộn Động vật (heo). 7: Mẫu trộn heo: cải (tỉ lệ heo: cải (tỉ lệ 1:1).TV: thực vật (cải).Chứng (- 1:1).TV: thực vật (cải).Chứng (-): không ): không DNA. DNA. Hình 3. Kết quả kiểm tra sự tạp nhiễm thành phần động vật trên các mẫu thực nghiệm Tổng số mẫu phát hiện chứa DNA động vật nhiễm trong các mẫu khác nhau, động vật là 9/23 mẫu (39,13%) trong đó có 5 nồng độ DNA tách được không giống nhau, mẫu từ siêu thị, 3 mẫu từ quán cơm chay và 1 dẫn đến sự khuếch đại các vạch có độ sáng mẫu từ thị trường chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình khác nhau. Đối với các mẫu chứng dương Dương.Các giếng có xuất hiện vạch sản phẩm hoàn toàn xuất hiện vạch với kích thước 154 154 bp chính là DNA động vật. Độ sáng bp sáng, mẫu chứng âm không xuất hiệnvạch không đồng đều của các vạch ở các mẫu bị sản phẩm 154 bp.Để xác định mẫu đã nhiễm nhiễm được giải thích là do hàm lượng DNA DNA loài nào, sản phẩm PCR của một mẫu
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 74 được chọn đại diện để giải trình tự tại công ty Nam Khoa (mẫu 8-Hình 3A). Hình 4. Kết quả giải trình tự mạch xuôi (mồi TP1) của sản phẩm PCR mẫu 8 Dựa vào kết quả giải trình tự (hình 4), chúng cặp mồi chứng nội). Áp dụng quy trình multi- tôi đã xác định loài đã nhiễm của mẫu 8 nghi PCR với cặp mồi TP1-TP2 đặc hiệu cho vùng ngờ chứa DNA động vật tương đồng với trình gen 16S rDNA của động vật và cặp mồi tự gen ty thể của loài gà Gallus gallus với mã CLO1-CLO2 khuếch đại đặc hiệu cho vùng số truy cập là KF981434 cho thấy mẫu bị gen không mã hóa ở lục lạp được sử dụng làm nhiễm gà trong quá trình chế biến (Dữ liệu chứng nội. không trình bày). Khảo sát được thực hiện trên 1 mẫu thực vật, Kết quả kiểm tramột số mẫu thực phẩm 1 mẫu động vật và 4 mẫu thực phẩm chay trên chay với phương pháp Multi-PCR (kết hợp thị trường . Hình 5. Kết quả kiểm tra một số mẫu trên trị trường bằng Multi-PCR Chú thích: 1: Lúa mạch nâu hạt, 2: Bột gà 426 bp, không xuất hiện vạch ở vị trí 154 nêm thuần chay, 3: Amila vàng lá nhỏ,4: bpchứng tỏ 3 mẫu này âm tính (không nhiễm Amila bạch kê cục,5: Bột nêm bào ngư,ĐV: DNA động vật). Giếng 2 không xuất hiện vạch Động vật (heo),TV: Thực vật (cải bắp),(-): sản phẩm 154 bp, tuy nhiên không thể kết luận Chứng âm,L: Thang chuẩn 100 bp được mẫu âm tính thực sự vì không xuất hiện Giếng TV xuất hiện 1 vạch sản phẩm vạch sản phẩm chứng nội 426 bp, chứng tỏ chứng nội ở vị trí 426 bp, phù hợp với kết quả trong mẫu kiểm tra có thành phần phụ gia ức khảo sát in silico của cặp mồi CLO1-CLO2. chế phản ứng PCR, do đó mẫu này cần phải có Giếng ĐV xuất hiện 1 vạchkích thước 154 bp những phân tích sau này, đặc biệt là phải tìm đúng với sản phẩm khuếch đại trình tự 16S hiểu thành phần phụ gia trong quá trình chế rDNA của cặp mồi TP1-TP2. Giếng 1, 3, 4 biến có ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại xuất hiện 1 vạch sản phẩm chứng nội ở vị trí hay không? Giếng 5 xuất hiện 2 vạch mờ, 1
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 75 vạch ở vị trí 154 bp và 1 vạch ở vị trí 426 bp chứng tỏ mẫu này dương tính (bị nhiễm DNA động vật). KẾT LUẬN Chúng tôi bước đầu thành công xây trường, kết quả phát hiện 9/23 (39,13%) mẫu dựng cơ sở khoa học để phát hiện thành phần nhiễm DNA động vật. Từ kết quả khảo sát in tạp nhiễm động vật trong thực phẩm chay dựa silico đến in vitro đã cho thấy kit PCR của trên việc khuếch đại gen 16S rDNA ty thể chúng tôi hoàn toàn đủ cơ sở khoa học để kết động vật kết hợp với khuếch đại gen lục lạp sử luận bước đầu thành công xây dựng bộ kit phát dụng làm chứng nội cho phản ứng. Đồng thời, hiện thành phần động vật trong thực phẩm chúng tôi tiến hành thử nghiệm thành công chay, đồng thời có thể tiến hành thử nghiệm việc kiểm tra 23 mẫu thực phẩm chay trên thị trên một lượng lớn mẫu thực phẩm chay TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anderson, J., Prior, S. 2012.Vegetarian diets. Food science and human nutrition, the Colorado State University. 2. Booton, G.C., Carmichael, J.R., Visvesvara, G.S., Byers, T.J., Fuerst, P.A.2003. ‘Identification of Balamuthia mandrillaris by PCR Assay Using the Mitochondrial 16S rRNA Gene as a Target’Journal of Clinical Microbiology41(1): pp.453-455. 3. Chomczynski, P., Sacchi, N. 2006. ‘The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on’Nature Protocols1(2): pp.581-585. 4. Chomczynski, P., Sacchi, N. 1987. ‘Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction’ Analytical Biochemistry 162: pp.156-159. 5. Claude, C., Hermann, S., Eilber, U., Steindorf, K. 2005. ‘Lifestyle determinants and mortality in German vegetarians and health-conscious persons: Results of a 21-year follow-up’Cancer Epideminol Biomarkers Prev14: pp. 963-968. 6. Girish, P.S., Anjaneyulu, A.S.R., Viswas, K.N., Anand, M., Rajkumar, N., Shivakumar, B.M., Bhaskar, S. 2004. ‘Sequence analysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat species’Meat Science66: pp.551-556 7. Heulin, Surget-Groba, Y., Guiller, A., Guillaume, C.P., Deunff, J. 1999. ‘Comparisons of mitochondrial DNA (mtDNA) sequences (16S rRNA gene) between oviparous and viviparous strains of Lacerta vivipara: a preliminary study’ Molecular Ecology8: pp.1627-1631. 8. Hsieh, H.M., Tsai, C.C., Tsai, L.C., Chiang, H.L. 2005. ‘Species identification of meat products using the cytochrome b gene’Forensic Science Journal4: pp.29-36. 9. Ishizaki, S., Sakai, Y., Yano, T., Nakano, S., Yamada, T., Nagashima, Y., Shiomi, K., Nakao, Y., Akiyama, H. 2012. ‘Specific detection by the polymerase chain reaction of potentially allergenic salmonid fish residues in processed foods’Biosci Biotechnol Biochem 76(5): pp.980-985. 10. Karabudak, E., Kiziltan, G., Cigerim, N. 2008. ‘A comparison of some of the cardiovascular risk factors in vegetarian and omnivorous Turkish females’J Hum Nutr Diet21: pp.13-22. 11. Key, T.J., Appleby, P.N., Rosell, M.S. 2006. ‘Health effects of vegetarian and vegan diets’Proc Nutr Soc65: pp.35-41.
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 76 12. Melton, T., Holland, C. 2007. ‘Routine Forensic Use of the Mitochondrial 12S Ribosomal RNA Gene for Species Identification’J Forensic Sci62: pp.250-257. 13. Michael, T.C., Brandon, S.G., Gerald, H.L., Jr, and Brian, R.M. 1994. ‘Rates and patterns of chloroplast DNA evolution’Proceedings of the National Academy of Sciences USA 91: pp.6795-6801. 14. Misener, S., Krawetz, S.A. 1999. ‘Methods in Molecular Biology’, © Humana Press132: pp. 365-386. 15. Mitanin, T., Akane, A. 2009. ‘Identification of animal species using the partial sequences in the mitochondrial 16S rRNA gene’Internationl Symposium Advances in legal Medicine11(1): pp.449-450.