Xây dựng kỹ thuật multiplex-PCR sử dụng chung mồi để phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn trong thực phẩm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR SỬ DỤNG CHUNG MỒI<br /> ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN<br /> TRONG THỰC PHẨM<br /> *<br /> <br /> Nguyễn Đỗ Phúc , Hoàng Hoài Phương*, Trần Thị Ngọc Phương*, Phạm Hùng Vân**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn ñề: Kỹ thuật multiplex-PCR cho phát hiện các tác nhân gây nhiễm khuẩn trong thực phẩm như<br /> Listeria monocytogenes, Vibrio choleare và Shigella spp. ñồng thời cùng một lúc nhằm góp phần cho công tác xét<br /> nghiệm nhanh phục vụ cho giám sát và ngộ ñộc thực phẩm là một nhu cầu cấp thiết hiện nay.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng bộ kit xét nghiệm multiplex PCR sử dụng chung mồi ñể phát hiện ñồng thời<br /> nhiều tác nhân vi sinh gây nhiễm trùng thực phẩm bao gồm: Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella<br /> spp.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn chuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella<br /> spp sau khi tăng sinh trên môi trường TSB ñược sử dụng ñể tách chiết DNA và kỹ thuật multiplex-PCR sử dụng<br /> chung mồi ñể phát hiện các tác nhân này.<br /> Kết quả nghiên cứu: Trong phản ứng multiplex-PCR sử dụng chung mồi có nồng ñộ Mg2+ là 3,5mM, nồng<br /> ñộ các cặp mồi ñể phát hiện các vi khuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp là 2pM và<br /> nồng ñộ mồi chung là 5pM cho một phản ứng. - Độ nhạy của bộ kít multiplex-PCR chung mồi, khi phát hiện<br /> Listeria monocytogene, Vibrio cholerae, và Shigella spp là 103 vi khuẩn/ml. - Độ ñặc hiệu của bột kít multiplexPCR là ñặc hiệu với các vi khuẩn ñích Listeria monocytogene, Vibrio cholerae, và Shigella spp và không ñặc hiệu<br /> ñối với các vi khuẩn không ñích: Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria seewil, Vibrio parahamolyticus,<br /> Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium và E.coli.<br /> Kết luận: Sử dụng phương pháp multiplex-PCR chung mồi ñể phát hiện 3 vi khuẩn Listeria<br /> monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp. gây ô nhiễm thực phẩm cùng một lúc có thể áp dụng tại<br /> phòng thử nghiệm vi sinh thực phẩm trong công tác giám sát và ñiều tra một số vi khuẩn gây tiêu chảy do<br /> thực phẩm bi ô nhiễm gây nên.<br /> Từ khóa: vi khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm, multiplex-PCR.<br /> ABSTRACT<br /> SET UP A TECHNIQUE OF MULTIPLEX-PCR USING THE GENERAL PRIMER FOR DETECTION SOME<br /> PATHOGENIC BACTERIA CONTAIMINATION IN FOOD<br /> Nguyen Do Phuc, Hoang Hoai Phuong, Tran Thi Ngoc Phuong, Pham Hung Van<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 327 - 336<br /> Background: The multiplex-PCR for detection of the bacteria contaiminated in food such as Listeria<br /> monocytogenes, Vibrio choleare và Shigella spp. at the same time helping for supervise and investigate the food<br /> born outbreak is necessary<br /> Objectives: Set up a technique of multiplex-PCR using the general primer for detection the pathogenic<br /> bacteria: Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, and Shigella spp.<br /> Method: The strains of Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae and Shigella spp after enrichment in TSB<br /> medium that used for extraction DNA and using technique multiplex-PCR with the general primer for detection<br /> those bacterias.<br /> Results: In the kit of multiplex-PCR have Mg2+ content is 3.5mM, primer for detection Listeria<br /> monocytogenes, Vibrio cholerae, and Shigella spp is 2pM and the general primer is 5pM for one reaction. - The<br /> sensitivity of the multiplex-PCR kit for detection Listeria monocytogene, Vibrio cholerae, and Shigella spp is là<br /> 103 bacteria/ml. - The specificity of the multiplex-PCR kit can detection of Listeria monocytogene, Vibrio<br /> *<br /> <br /> Viện Vệ sinh - Y tế Công cộng TP Hồ Chí Minh<br /> ** Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Liên lạc: Ths. Nguyễn Đỗ Phúc<br /> ĐT: 0907 669 008<br /> Email: nguyendophuc@ihph.org.vn<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 327<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> cholerae, và Shigella spp. but not detection of Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria seewil, Vibrio<br /> parahamolyticus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium và E.coli.<br /> Conclusion: Using the technique of multiplex-PCR with the general primer for detection of Listeria<br /> monocytogenes, Vibrio cholerae, and Shigella spp. at the same time can apply in microbiological laboratory for<br /> supervise and investigate the food born outbreak.<br /> Keywords: bacteria contaminated in food, multiplex-PCR.<br /> - Cặp mồi ñặc hiệu có kí hiệu: MLP-Sh1-MLPĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Sh2 (phát hiện Shigella spp.); MLP-CTX2-MLPNhờ ñặc ñiểm là kỹ thuật mở, PCR ñang ñược<br /> CTX3 (phát hiện Vibrio cholerae); MLP-List F1triển khai nghiên cứu và áp dụng ñể phát hiện các<br /> MLP-List R1 (phát hiện Listeria monocytogenes);<br /> tác nhân vi sinh trong các mẫu thử tại nhiều phòng<br /> KY78 -KY80 (mồi khuyếch ñại chung).<br /> thử nghiệm vi sinh ở trong nước. Do khả năng phát<br /> - Mater Mix 2 X: 100 Mix: PCR buffer 10x:<br /> hiện cùng một lúc từ hai loại tác nhân vi sinh trở<br /> 500µl;<br /> MgCl2 50 mM: 350- 450µl (khảo sát hai<br /> lên nên multiplex-PCR ñược nhiều nhà nghiên cứu<br /> nồng<br /> ñộ:<br /> 3,5mM và 4,5mM); dNTP: 40µl; Taq<br /> áp dụng trong các phòng thí nghiệm của mình. Tuy<br /> polymerase:<br /> 25µl; dH2O:1785µl; Tổng thể tích<br /> nhiên việc áp dụng kỹ thuật multiplex này ñòi hỏi<br /> 2500µl.<br /> nhà nghiên cứu phải thiết kế các ñoạn mồi sao cho<br /> - Đệm TE: 10mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA.<br /> sản phẩm khuyếch ñại phải có các kích thước khác<br /> nhau, và quan trọng nhất là phải khắc phục ñược<br /> - Đệm PCR 10X có thành phần như sau: 500mM<br /> một trở ngại chính là tránh không cho các mồi ñược<br /> KCl, 15mM MgCl2, 100mM Tris-HCl, pH 9, bảo<br /> bắt cặp lẫn nhau làm giảm hiệu quả khuếch ñại của<br /> quản ở nhiệt ñộ phòng.<br /> PCR. Thông thường ñể khắc phục ñược trở ngại<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> này thì các nhà nghiên cứu phải thiết kế mồi sao<br /> - Qui trình multiplex-PCR chung mồi: bao gồm<br /> cho không có dimer xảy ra giữa các mồi và của<br /> tách chiết DNA bằng InstaGene, sử dụng 5µl dịch<br /> chính mồi với nhau và việc thiết kế này sẽ không dễ<br /> chiết DNA cho vào 20µl master mix PCR và<br /> dàng. Để khắc phục tình trạng trên, giải pháp kỹ<br /> khuếch ñại DNA theo chu trình nhiệt 1: 40 chu kỳ<br /> thuật ñược nghiên cứu trong ñề tài này là kỹ thuật<br /> với ba bước nhiệt ñộ: 940C/30giây; 550C/30 giây và<br /> multiplex-PCR sử dụng chung mồi. Nguyên tắc của<br /> 720C/60 giây. Chu kỳ 2: 720C/10 phút và giữ 40C.<br /> tiếp cận này là sử dụng một hệ thống các mồi ñặc<br /> Sản phẩm PCR bảo quản trong -20oC cho ñến khi<br /> hiệu ở hàm lượng rất thấp trong PCR mix ñể làm<br /> ñiện di. Sản phẩm sau phản ứng PCR ñược ñiện di<br /> ñiều kiện giúp cho một cặp mồi chung khuếch ñại<br /> trên gel agarose 2% có bổ sung ethidium bromide<br /> ñược các ñọan DNA ñặc hiệu cho các gene mục<br /> 4µl (dung dịch ethidium bromide 5mg/ml). Điện di<br /> tiêu của các vi khuẩn ñích và sản phẩm khuếch ñại<br /> ở ñiện thế 135V trong 25 phút. Sau ñó quan sát kết<br /> này sẽ có kích thước khác biệt nhau ñể phân biệt<br /> quả<br /> trên máy chụp hình ñiện di bằng tia UV có<br /> ñược vi khuẩn gây bệnh có trong mẫu thử là vi<br /> bước<br /> sóng 312nm. Nếu xuất hiện các vạch có chiều<br /> khuẩn nào.<br /> dài:<br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> + 280bp: là sản phẩm PCR phát hiện Listeria<br /> - Tối ưu các ñiều kiện cho multiplex PCR sử<br /> monocytogenes<br /> dụng chung mồi: nồng ñộ mồi, nồng ñộ Mg2+.<br /> + 600bp: là sản phẩm PCR phát hiện Vibrio<br /> - Thử nghiệm ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của bộ<br /> cholerae<br /> kit trên canh khuẩn chủng chuẩn.<br /> + 380bp: là sản phẩm PCR phát hiện Shigella<br /> - Thử nghiệm so sánh khả năng phát hiện<br /> - Pha chế bộ kit thử multiplex-PCR với 12 tổ hợp<br /> Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella<br /> thành phần khác nhau với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM,<br /> spp trong thực phẩm bằng hai phương pháp<br /> 4,5mM với các nồng ñộ mồi riêng cho từng loại vi<br /> multiplex-PCR sử dụng chung mồi và phương pháp<br /> khuẩn và mồi chung với tỷ lệ 2-5.<br /> nuôi cấy truyền thống.<br /> - Thử nghiệm khảo sát sát nồng ñộ Mg2+ và nồng<br /> ñộ mồi: Chuẩn bị vi khuẩn Listeria monocytogenes,<br /> ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU<br /> Vibrio cholerae, và Shigella spp. trên canh khuẩn TSB<br /> Vật liệu nghiên cứu<br /> sau 24 giờ nuôi cấy ñể tách chiết DNA.<br /> - Vi khuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio<br /> - Thử nghiệm ñộ nhạy và ñộc ñặc hiệu<br /> cholerae, và Shigella spp<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 328<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> + Thử ñộ nhạy trên chủng chứng<br /> Thử nghiệm ñộ nhạy với 3 chủng vi khuẩn<br /> (Listeria monocytogenes,Vibrip cholerae, Shigella<br /> spp.) với các nồng ñộ 107,106,105,104,103,102,101 và<br /> 100 vi khuẩn/ml trên chủng chứng. Sử dụng các nồng<br /> ñộ vi khuẩn trên ñể tách chiết DNA và ñưa vào phản<br /> ứng multiplex-PCR.<br /> Thử ñộ ñặc hiệu trên chủng không phải ñích<br /> Các vi khuẩn không ñích cho Listeria<br /> monocytogenes bao gồm Listeria inocua, Listeria<br /> ivanovii và Listeria seewil, cho Vibrio choleare là<br /> Vibrio parahaemolyticus và cho Shigella spp. là<br /> Salmonella và E. coli.<br /> Nuôi cấy vi khuẩn không phải mục tiêu này trên<br /> môi trường nuôi cấy tăng sinh TSB, qua ñêm (16giờ).<br /> Nồng ñộ vi khuẩn ước khoảng 108 CFU/ml. Pha loãng<br /> canh khuẩn theo ñộ pha loãng bậc 10 với ñệm<br /> phosphate, sử dụng nồng vi khuẩn ñã khảo sát về ñộ<br /> ñặc hiệu. Sử dụng các nồng ñộ vi khuẩn trên ñể chiết<br /> tách DNA, và thực hiện phản ứng PCR.<br /> - Thử nghiệm so sánh khả năng phát hiện Listeria<br /> monocytogenes,Vibrip cholerae, Shigella spp. bằng<br /> phương pháp multiplex-PCR chung mồi và phương<br /> pháp nuôi cấy truyền thống.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> Khảo sát nồng ñộ Mg2+ với nồng ñộ các mồi<br /> khác nhau<br /> Thử nghiệm qui trình multiplex-PCR chung mồi<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> với 2 nồng ñộ Mg2+: 3,5mM và 4,5mM ñược thử với<br /> các cặp mồi phát hiện Listeria monocytogenes, và<br /> Vibrio cholerae Shigella spp. cho phản ứng multiplexPCR, với nồng ñộ mồi chung 5pM và mồi riêng là<br /> 2pM theo bố trí thử nghiệm với 12 tổ hợp khác nhau<br /> master mix khác nhau. Kết quả khảo sát về nồng ñộ<br /> Mg 2+ và nồng ñộ các cặp mồi chung, mồi ñặc hiệu<br /> cho từng vi khuẩn trình bày ở hình 1, 2 và 3.<br /> Kết quả thử nghiệm phát hiện Listeria monocytogenes<br /> với 12 tổ hợp maxter mix khác nhau .<br /> <br /> Hình 1. Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ<br /> mồi thích hợp của cặp mồi chung và mồi ñặc hiệu ñể<br /> phát hiện Listeria monocytognes<br /> Qua kết quả hình 1, với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM và<br /> nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và các cặp mồi ñặc<br /> hiệu ñể phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio<br /> choleare và Shiggella spp. là 2pM cho một phản ứng<br /> PCR ñược sử dụng ñể phát hiện chủng chứng (+)<br /> Listeria monpcytognes, trên hình 1 vạch ñiện di ở vị<br /> trí 1L sáng, rõ và không có các không xuất hiện nhiều<br /> vạch trắng sáng do primer thừa so với các vạch ñiện<br /> di ở các vạch ñiện di từ 2L cho ñến 12L (ñó là tổ hợp<br /> 12 maxter mix khác nhau).<br /> <br /> Kết quả thử nghiệm phát hiện Vibrio cholerae với 12 tổ hợp maxter mix khác nhau<br /> <br /> 600bp<br /> <br /> Hình 2. Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ mồi thích hợp của cặp mồi chung và mồi ñặc hiệu ñể phát<br /> hiện Vibrio cholerae<br /> Qua kết quả hình 2, với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM và nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và các cặp mồi ñặc hiệu<br /> ñể phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. là 2pM cho một phản ứng PCR ñược<br /> sử dụng ñể phát hiện chủng chứng (+) Vibrio cholerae trên hình 2 vạch ñiện di ở vị trí 1L sáng, rõ và không<br /> có các không xuất hiện nhiều vạch trắng sáng do primer thừa so với các vạch ñiện di ở các vạch ñiện di từ 2L<br /> cho ñến 12L (ñó là tổ hợp 12 maxter mix khác nhau).<br /> Qua kết quả hình 3, với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM và nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và các cặp mồi ñặc hiệu<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 329<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> ñể phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. là 2pM cho một phản ứng PCR ñược<br /> sử dụng ñể phát hiện chủng chứng (+) Shigella spp. trên hình 3 vạch ñiện di ở vị trí 1L sáng, rõ và không có<br /> các không xuất hiện nhiều vạch trắng sáng do primer thừa so với các vạch ñiện di ở các vạch ñiện di từ 2L<br /> cho ñến 12L (ñó là tổ hợp 12 maxter mix khác nhau).<br /> Như vậy qua kết quả khảo sát trên, bộ kít thử phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella<br /> spp. với các thành phần một phản ứng multiplex-PCR có nồng ñộ Mg2+ là 3,5mM, nồng ñộ mồi chung là 5pM,<br /> nồng ñộ mồi ñặc hiệu cho Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. mỗi loại là 2pM cho một<br /> phản ứng.<br /> <br /> - Thử nghiệm ñộ nhạy của bộ kít với các vi khuẩn ñích<br /> Thử nghiệm ñộ nhạy với 3 chủng vi khuẩn (Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp.) với các<br /> nồng ñộ 107,106,105,104,103,102,101 và 100 tế bào vi khuẩn/ml.<br /> <br /> Kết quả thử nghiệm phát hiện Shigella spp. với 12 tổ hợp maxter mix khác nhau<br /> <br /> 380bp<br /> <br /> Hình 3. Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ mồi thích hợp của cặp mồi chung và mồi ñặc hiệu ñể phát<br /> hiện Shigella spp.<br /> <br /> 500bp<br /> 380bp<br /> <br /> Hình 4. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của bộ kít với các nồng ñộ Listeria monocytogenes khác nhau Vạch 280bp:<br /> Listeria monocytogenes; Vạch 500bp: chứng nội tại<br /> 3, 4, có nồng ñộ Listeria monocytogenes lần lượt là<br /> + Kết quả ñộ nhạy trên canh khuẩn Listeria<br /> 6<br /> 10<br /> , 105, 104, 103 CFU/ml khi ñưa vào phản ứng<br /> monocytogenes<br /> multiplex PCR chung mồi mới có thể phát hiện ñược<br /> Chủng Listeria monocytogenes trên canh khuẩn<br /> Listeria monocytogenes. Như vậy nồng ñộ vi khuẩn<br /> thuần ñược pha thành các nồng ñộ vi khuẩn tương<br /> Listeria monocytogenes sau khi tăng sinh tối thiểu là<br /> ñương ở giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 có nồng ñộ Listeria<br /> 3<br /> vi khuẩn/ml thì bộ kít mới có thể phát hiện ñược.<br /> 10<br /> monocytogenes lần lượt là 106, 105, 104, 103, 102, 101,<br /> Kết quả ñộ nhạy trên canh khuẩn Vibrio<br /> 100 CFU/ml, từ các nồng ñộ này ñem chiết tách DNA<br /> cholerae<br /> và cho vào phản ứng multiplex-PCR chung mồi ñể<br /> Chủng Vibrio cholerae trên canh khuẩn thuần<br /> phát hiện Listeria monocytogenes. Kết quả trình bày ở<br /> hình 4. Qua kết quả trên hình 4, cho thấy ở giếng 1, 2,<br /> ñược pha thành các nồng ñộ vi khuẩn tương<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 330<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> ñương ở giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, có nồng ñộ Vibrio<br /> cholerae lần lượt là 106, 105, 104, 103, 102, 101<br /> CFU/ml, từ các nồng ñộ này ñem chiết tách DNA<br /> và cho vào phản ứng multiplex-PCR chung mồi<br /> ñể phát hiện Vibrio cholerae. Kết quả trình bày ở<br /> hình 5.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 4, có nồng ñộ Vibrio cholerae lần lượt là 106, 105, 104,<br /> 103 vi khuẩn/ml khi ñưa vào phản ứng multiplex PCR<br /> chung mồi mới có thể phát hiện ñược Vibrio cholerae.<br /> Như vậy nồng ñộ vi khuẩn Vibrio cholerae sau khi<br /> tăng sinh tối thiểu là 103 vi khuẩn/ml bộ kít mới có thể<br /> phát hiện ñược.<br /> <br /> Qua kết quả trên hình 5, cho thấy ở giếng 1, 2, 3,<br /> <br /> 500bp<br /> <br /> 600bp<br /> <br /> Hình 5. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của bộ kít với các nồng ñộ Vibrio cholerae khác nhau Vạch 600bp: Vibrio<br /> cholerae; Vạch 500bp: chứng nội tại<br /> <br /> 500bp<br /> 380bp<br /> <br /> Hình 6. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của bộ kít với các nồng ñộ Shigella spp. khác nhau Vạch 380bp: Shigella spp.;<br /> Vạch 500bp: chứng nội tại<br /> Thử nghiệm ñộ ñặc hiệu của bột kít multiplexKết quả ñộ nhạy trên canh khuẩn Shigella<br /> PCR chung mồi cho các vi khuẩn cùng giống nhưng<br /> spp.<br /> khác<br /> loài ñối với các vi khuẩn ñích ñể xác ñịnh ñộ ñặc<br /> Chủng Shigella spp. trên canh khuẩn thuần ñược<br /> hiệu<br /> của<br /> bộ kít.<br /> pha thành các nồng ñộ vi khuẩn tương ñương ở giếng<br /> Nuôi cấy vi khuẩn không phải mục tiêu này trên<br /> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 có nồng ñộ Shigella spp. lần lượt là<br /> 6<br /> 5<br /> 4<br /> 3<br /> 2<br /> 1<br /> 0<br /> môi<br /> trường nuôi cấy tăng sinh (BHI), qua ñêm (16hr).<br /> 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 CFU/ml, từ các nồng<br /> Nồng<br /> ñộ vi khuẩn ước khoảng 108 CFU/ml. Pha loãng<br /> ñộ này ñem chiết tách DNA và cho vào phản ứng<br /> canh khuẩn theo ñộ pha loãng bậc 10 với ñệm<br /> multiplex-PCR chung mồi ñể phát hiện Shigella spp.<br /> phosphate, ñến mức ñộ giới hạn phát hiện của bộ<br /> Kết quả trình bày ở hình 6.Qua kết quả trên hình 6,<br /> kít,sau ñó chiết tách DNA, và thực hiện phản ứng<br /> cho thấy ở giếng 1, 2, 3, 4, có nồng ñộ Shigella spp.<br /> 6<br /> 5<br /> 4<br /> 3<br /> PCR.<br /> lần lượt là 10 , 10 , 10 , 10 vi khuẩn/ml khi ñưa vào<br /> phản ứng multiplex PCR chung mồi mới có thể phát<br /> Kết quả ñộ ñặc hiệu Listeria monocytogenes<br /> hiện ñược Shigella spp. Như vậy nồng ñộ vi khuẩn<br /> trên<br /> canh khuẩn các vi khuẩn không ñích<br /> Shigella spp. sau khi tăng sinh tối thiểu là 103 CFU/ml<br /> Các vi khuẩn không ñích của Listeria<br /> bộ kít mới có thể phát hiện ñược.<br /> monocytogenes là các chủng Listeria innocua,<br /> <br /> Thử nghiệm ñộ ñặc hiệu trên canh khuẩn<br /> chủng không phải ñích<br /> <br /> Listeria ivanovii và Listeria seewil ñược ñưa vào thử<br /> nghiệm ñộ ñặc hiệu của bộ kít. Kết quả trình bày hình<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 331<br /> <br />