intTypePromotion=1
ADSENSE

Xây dựng kỹ thuật multiplex-PCR sử dụng chung mồi để phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn trong thực phẩm

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

35
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu nhằm xây dựng bộ kit xét nghiệm multiplex PCR sử dụng chung mồi ñể phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi sinh gây nhiễm trùng thực phẩm bao gồm: Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xây dựng kỹ thuật multiplex-PCR sử dụng chung mồi để phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn trong thực phẩm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR SỬ DỤNG CHUNG MỒI<br /> ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN<br /> TRONG THỰC PHẨM<br /> *<br /> <br /> Nguyễn Đỗ Phúc , Hoàng Hoài Phương*, Trần Thị Ngọc Phương*, Phạm Hùng Vân**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn ñề: Kỹ thuật multiplex-PCR cho phát hiện các tác nhân gây nhiễm khuẩn trong thực phẩm như<br /> Listeria monocytogenes, Vibrio choleare và Shigella spp. ñồng thời cùng một lúc nhằm góp phần cho công tác xét<br /> nghiệm nhanh phục vụ cho giám sát và ngộ ñộc thực phẩm là một nhu cầu cấp thiết hiện nay.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng bộ kit xét nghiệm multiplex PCR sử dụng chung mồi ñể phát hiện ñồng thời<br /> nhiều tác nhân vi sinh gây nhiễm trùng thực phẩm bao gồm: Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella<br /> spp.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn chuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella<br /> spp sau khi tăng sinh trên môi trường TSB ñược sử dụng ñể tách chiết DNA và kỹ thuật multiplex-PCR sử dụng<br /> chung mồi ñể phát hiện các tác nhân này.<br /> Kết quả nghiên cứu: Trong phản ứng multiplex-PCR sử dụng chung mồi có nồng ñộ Mg2+ là 3,5mM, nồng<br /> ñộ các cặp mồi ñể phát hiện các vi khuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp là 2pM và<br /> nồng ñộ mồi chung là 5pM cho một phản ứng. - Độ nhạy của bộ kít multiplex-PCR chung mồi, khi phát hiện<br /> Listeria monocytogene, Vibrio cholerae, và Shigella spp là 103 vi khuẩn/ml. - Độ ñặc hiệu của bột kít multiplexPCR là ñặc hiệu với các vi khuẩn ñích Listeria monocytogene, Vibrio cholerae, và Shigella spp và không ñặc hiệu<br /> ñối với các vi khuẩn không ñích: Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria seewil, Vibrio parahamolyticus,<br /> Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium và E.coli.<br /> Kết luận: Sử dụng phương pháp multiplex-PCR chung mồi ñể phát hiện 3 vi khuẩn Listeria<br /> monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp. gây ô nhiễm thực phẩm cùng một lúc có thể áp dụng tại<br /> phòng thử nghiệm vi sinh thực phẩm trong công tác giám sát và ñiều tra một số vi khuẩn gây tiêu chảy do<br /> thực phẩm bi ô nhiễm gây nên.<br /> Từ khóa: vi khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm, multiplex-PCR.<br /> ABSTRACT<br /> SET UP A TECHNIQUE OF MULTIPLEX-PCR USING THE GENERAL PRIMER FOR DETECTION SOME<br /> PATHOGENIC BACTERIA CONTAIMINATION IN FOOD<br /> Nguyen Do Phuc, Hoang Hoai Phuong, Tran Thi Ngoc Phuong, Pham Hung Van<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 327 - 336<br /> Background: The multiplex-PCR for detection of the bacteria contaiminated in food such as Listeria<br /> monocytogenes, Vibrio choleare và Shigella spp. at the same time helping for supervise and investigate the food<br /> born outbreak is necessary<br /> Objectives: Set up a technique of multiplex-PCR using the general primer for detection the pathogenic<br /> bacteria: Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, and Shigella spp.<br /> Method: The strains of Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae and Shigella spp after enrichment in TSB<br /> medium that used for extraction DNA and using technique multiplex-PCR with the general primer for detection<br /> those bacterias.<br /> Results: In the kit of multiplex-PCR have Mg2+ content is 3.5mM, primer for detection Listeria<br /> monocytogenes, Vibrio cholerae, and Shigella spp is 2pM and the general primer is 5pM for one reaction. - The<br /> sensitivity of the multiplex-PCR kit for detection Listeria monocytogene, Vibrio cholerae, and Shigella spp is là<br /> 103 bacteria/ml. - The specificity of the multiplex-PCR kit can detection of Listeria monocytogene, Vibrio<br /> *<br /> <br /> Viện Vệ sinh - Y tế Công cộng TP Hồ Chí Minh<br /> ** Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Liên lạc: Ths. Nguyễn Đỗ Phúc<br /> ĐT: 0907 669 008<br /> Email: nguyendophuc@ihph.org.vn<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 327<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> cholerae, và Shigella spp. but not detection of Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria seewil, Vibrio<br /> parahamolyticus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium và E.coli.<br /> Conclusion: Using the technique of multiplex-PCR with the general primer for detection of Listeria<br /> monocytogenes, Vibrio cholerae, and Shigella spp. at the same time can apply in microbiological laboratory for<br /> supervise and investigate the food born outbreak.<br /> Keywords: bacteria contaminated in food, multiplex-PCR.<br /> - Cặp mồi ñặc hiệu có kí hiệu: MLP-Sh1-MLPĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Sh2 (phát hiện Shigella spp.); MLP-CTX2-MLPNhờ ñặc ñiểm là kỹ thuật mở, PCR ñang ñược<br /> CTX3 (phát hiện Vibrio cholerae); MLP-List F1triển khai nghiên cứu và áp dụng ñể phát hiện các<br /> MLP-List R1 (phát hiện Listeria monocytogenes);<br /> tác nhân vi sinh trong các mẫu thử tại nhiều phòng<br /> KY78 -KY80 (mồi khuyếch ñại chung).<br /> thử nghiệm vi sinh ở trong nước. Do khả năng phát<br /> - Mater Mix 2 X: 100 Mix: PCR buffer 10x:<br /> hiện cùng một lúc từ hai loại tác nhân vi sinh trở<br /> 500µl;<br /> MgCl2 50 mM: 350- 450µl (khảo sát hai<br /> lên nên multiplex-PCR ñược nhiều nhà nghiên cứu<br /> nồng<br /> ñộ:<br /> 3,5mM và 4,5mM); dNTP: 40µl; Taq<br /> áp dụng trong các phòng thí nghiệm của mình. Tuy<br /> polymerase:<br /> 25µl; dH2O:1785µl; Tổng thể tích<br /> nhiên việc áp dụng kỹ thuật multiplex này ñòi hỏi<br /> 2500µl.<br /> nhà nghiên cứu phải thiết kế các ñoạn mồi sao cho<br /> - Đệm TE: 10mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA.<br /> sản phẩm khuyếch ñại phải có các kích thước khác<br /> nhau, và quan trọng nhất là phải khắc phục ñược<br /> - Đệm PCR 10X có thành phần như sau: 500mM<br /> một trở ngại chính là tránh không cho các mồi ñược<br /> KCl, 15mM MgCl2, 100mM Tris-HCl, pH 9, bảo<br /> bắt cặp lẫn nhau làm giảm hiệu quả khuếch ñại của<br /> quản ở nhiệt ñộ phòng.<br /> PCR. Thông thường ñể khắc phục ñược trở ngại<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> này thì các nhà nghiên cứu phải thiết kế mồi sao<br /> - Qui trình multiplex-PCR chung mồi: bao gồm<br /> cho không có dimer xảy ra giữa các mồi và của<br /> tách chiết DNA bằng InstaGene, sử dụng 5µl dịch<br /> chính mồi với nhau và việc thiết kế này sẽ không dễ<br /> chiết DNA cho vào 20µl master mix PCR và<br /> dàng. Để khắc phục tình trạng trên, giải pháp kỹ<br /> khuếch ñại DNA theo chu trình nhiệt 1: 40 chu kỳ<br /> thuật ñược nghiên cứu trong ñề tài này là kỹ thuật<br /> với ba bước nhiệt ñộ: 940C/30giây; 550C/30 giây và<br /> multiplex-PCR sử dụng chung mồi. Nguyên tắc của<br /> 720C/60 giây. Chu kỳ 2: 720C/10 phút và giữ 40C.<br /> tiếp cận này là sử dụng một hệ thống các mồi ñặc<br /> Sản phẩm PCR bảo quản trong -20oC cho ñến khi<br /> hiệu ở hàm lượng rất thấp trong PCR mix ñể làm<br /> ñiện di. Sản phẩm sau phản ứng PCR ñược ñiện di<br /> ñiều kiện giúp cho một cặp mồi chung khuếch ñại<br /> trên gel agarose 2% có bổ sung ethidium bromide<br /> ñược các ñọan DNA ñặc hiệu cho các gene mục<br /> 4µl (dung dịch ethidium bromide 5mg/ml). Điện di<br /> tiêu của các vi khuẩn ñích và sản phẩm khuếch ñại<br /> ở ñiện thế 135V trong 25 phút. Sau ñó quan sát kết<br /> này sẽ có kích thước khác biệt nhau ñể phân biệt<br /> quả<br /> trên máy chụp hình ñiện di bằng tia UV có<br /> ñược vi khuẩn gây bệnh có trong mẫu thử là vi<br /> bước<br /> sóng 312nm. Nếu xuất hiện các vạch có chiều<br /> khuẩn nào.<br /> dài:<br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> + 280bp: là sản phẩm PCR phát hiện Listeria<br /> - Tối ưu các ñiều kiện cho multiplex PCR sử<br /> monocytogenes<br /> dụng chung mồi: nồng ñộ mồi, nồng ñộ Mg2+.<br /> + 600bp: là sản phẩm PCR phát hiện Vibrio<br /> - Thử nghiệm ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của bộ<br /> cholerae<br /> kit trên canh khuẩn chủng chuẩn.<br /> + 380bp: là sản phẩm PCR phát hiện Shigella<br /> - Thử nghiệm so sánh khả năng phát hiện<br /> - Pha chế bộ kit thử multiplex-PCR với 12 tổ hợp<br /> Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella<br /> thành phần khác nhau với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM,<br /> spp trong thực phẩm bằng hai phương pháp<br /> 4,5mM với các nồng ñộ mồi riêng cho từng loại vi<br /> multiplex-PCR sử dụng chung mồi và phương pháp<br /> khuẩn và mồi chung với tỷ lệ 2-5.<br /> nuôi cấy truyền thống.<br /> - Thử nghiệm khảo sát sát nồng ñộ Mg2+ và nồng<br /> ñộ mồi: Chuẩn bị vi khuẩn Listeria monocytogenes,<br /> ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU<br /> Vibrio cholerae, và Shigella spp. trên canh khuẩn TSB<br /> Vật liệu nghiên cứu<br /> sau 24 giờ nuôi cấy ñể tách chiết DNA.<br /> - Vi khuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio<br /> - Thử nghiệm ñộ nhạy và ñộc ñặc hiệu<br /> cholerae, và Shigella spp<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 328<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> + Thử ñộ nhạy trên chủng chứng<br /> Thử nghiệm ñộ nhạy với 3 chủng vi khuẩn<br /> (Listeria monocytogenes,Vibrip cholerae, Shigella<br /> spp.) với các nồng ñộ 107,106,105,104,103,102,101 và<br /> 100 vi khuẩn/ml trên chủng chứng. Sử dụng các nồng<br /> ñộ vi khuẩn trên ñể tách chiết DNA và ñưa vào phản<br /> ứng multiplex-PCR.<br /> Thử ñộ ñặc hiệu trên chủng không phải ñích<br /> Các vi khuẩn không ñích cho Listeria<br /> monocytogenes bao gồm Listeria inocua, Listeria<br /> ivanovii và Listeria seewil, cho Vibrio choleare là<br /> Vibrio parahaemolyticus và cho Shigella spp. là<br /> Salmonella và E. coli.<br /> Nuôi cấy vi khuẩn không phải mục tiêu này trên<br /> môi trường nuôi cấy tăng sinh TSB, qua ñêm (16giờ).<br /> Nồng ñộ vi khuẩn ước khoảng 108 CFU/ml. Pha loãng<br /> canh khuẩn theo ñộ pha loãng bậc 10 với ñệm<br /> phosphate, sử dụng nồng vi khuẩn ñã khảo sát về ñộ<br /> ñặc hiệu. Sử dụng các nồng ñộ vi khuẩn trên ñể chiết<br /> tách DNA, và thực hiện phản ứng PCR.<br /> - Thử nghiệm so sánh khả năng phát hiện Listeria<br /> monocytogenes,Vibrip cholerae, Shigella spp. bằng<br /> phương pháp multiplex-PCR chung mồi và phương<br /> pháp nuôi cấy truyền thống.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> Khảo sát nồng ñộ Mg2+ với nồng ñộ các mồi<br /> khác nhau<br /> Thử nghiệm qui trình multiplex-PCR chung mồi<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> với 2 nồng ñộ Mg2+: 3,5mM và 4,5mM ñược thử với<br /> các cặp mồi phát hiện Listeria monocytogenes, và<br /> Vibrio cholerae Shigella spp. cho phản ứng multiplexPCR, với nồng ñộ mồi chung 5pM và mồi riêng là<br /> 2pM theo bố trí thử nghiệm với 12 tổ hợp khác nhau<br /> master mix khác nhau. Kết quả khảo sát về nồng ñộ<br /> Mg 2+ và nồng ñộ các cặp mồi chung, mồi ñặc hiệu<br /> cho từng vi khuẩn trình bày ở hình 1, 2 và 3.<br /> Kết quả thử nghiệm phát hiện Listeria monocytogenes<br /> với 12 tổ hợp maxter mix khác nhau .<br /> <br /> Hình 1. Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ<br /> mồi thích hợp của cặp mồi chung và mồi ñặc hiệu ñể<br /> phát hiện Listeria monocytognes<br /> Qua kết quả hình 1, với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM và<br /> nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và các cặp mồi ñặc<br /> hiệu ñể phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio<br /> choleare và Shiggella spp. là 2pM cho một phản ứng<br /> PCR ñược sử dụng ñể phát hiện chủng chứng (+)<br /> Listeria monpcytognes, trên hình 1 vạch ñiện di ở vị<br /> trí 1L sáng, rõ và không có các không xuất hiện nhiều<br /> vạch trắng sáng do primer thừa so với các vạch ñiện<br /> di ở các vạch ñiện di từ 2L cho ñến 12L (ñó là tổ hợp<br /> 12 maxter mix khác nhau).<br /> <br /> Kết quả thử nghiệm phát hiện Vibrio cholerae với 12 tổ hợp maxter mix khác nhau<br /> <br /> 600bp<br /> <br /> Hình 2. Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ mồi thích hợp của cặp mồi chung và mồi ñặc hiệu ñể phát<br /> hiện Vibrio cholerae<br /> Qua kết quả hình 2, với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM và nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và các cặp mồi ñặc hiệu<br /> ñể phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. là 2pM cho một phản ứng PCR ñược<br /> sử dụng ñể phát hiện chủng chứng (+) Vibrio cholerae trên hình 2 vạch ñiện di ở vị trí 1L sáng, rõ và không<br /> có các không xuất hiện nhiều vạch trắng sáng do primer thừa so với các vạch ñiện di ở các vạch ñiện di từ 2L<br /> cho ñến 12L (ñó là tổ hợp 12 maxter mix khác nhau).<br /> Qua kết quả hình 3, với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM và nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và các cặp mồi ñặc hiệu<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 329<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> ñể phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. là 2pM cho một phản ứng PCR ñược<br /> sử dụng ñể phát hiện chủng chứng (+) Shigella spp. trên hình 3 vạch ñiện di ở vị trí 1L sáng, rõ và không có<br /> các không xuất hiện nhiều vạch trắng sáng do primer thừa so với các vạch ñiện di ở các vạch ñiện di từ 2L<br /> cho ñến 12L (ñó là tổ hợp 12 maxter mix khác nhau).<br /> Như vậy qua kết quả khảo sát trên, bộ kít thử phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella<br /> spp. với các thành phần một phản ứng multiplex-PCR có nồng ñộ Mg2+ là 3,5mM, nồng ñộ mồi chung là 5pM,<br /> nồng ñộ mồi ñặc hiệu cho Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. mỗi loại là 2pM cho một<br /> phản ứng.<br /> <br /> - Thử nghiệm ñộ nhạy của bộ kít với các vi khuẩn ñích<br /> Thử nghiệm ñộ nhạy với 3 chủng vi khuẩn (Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp.) với các<br /> nồng ñộ 107,106,105,104,103,102,101 và 100 tế bào vi khuẩn/ml.<br /> <br /> Kết quả thử nghiệm phát hiện Shigella spp. với 12 tổ hợp maxter mix khác nhau<br /> <br /> 380bp<br /> <br /> Hình 3. Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ mồi thích hợp của cặp mồi chung và mồi ñặc hiệu ñể phát<br /> hiện Shigella spp.<br /> <br /> 500bp<br /> 380bp<br /> <br /> Hình 4. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của bộ kít với các nồng ñộ Listeria monocytogenes khác nhau Vạch 280bp:<br /> Listeria monocytogenes; Vạch 500bp: chứng nội tại<br /> 3, 4, có nồng ñộ Listeria monocytogenes lần lượt là<br /> + Kết quả ñộ nhạy trên canh khuẩn Listeria<br /> 6<br /> 10<br /> , 105, 104, 103 CFU/ml khi ñưa vào phản ứng<br /> monocytogenes<br /> multiplex PCR chung mồi mới có thể phát hiện ñược<br /> Chủng Listeria monocytogenes trên canh khuẩn<br /> Listeria monocytogenes. Như vậy nồng ñộ vi khuẩn<br /> thuần ñược pha thành các nồng ñộ vi khuẩn tương<br /> Listeria monocytogenes sau khi tăng sinh tối thiểu là<br /> ñương ở giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 có nồng ñộ Listeria<br /> 3<br /> vi khuẩn/ml thì bộ kít mới có thể phát hiện ñược.<br /> 10<br /> monocytogenes lần lượt là 106, 105, 104, 103, 102, 101,<br /> Kết quả ñộ nhạy trên canh khuẩn Vibrio<br /> 100 CFU/ml, từ các nồng ñộ này ñem chiết tách DNA<br /> cholerae<br /> và cho vào phản ứng multiplex-PCR chung mồi ñể<br /> Chủng Vibrio cholerae trên canh khuẩn thuần<br /> phát hiện Listeria monocytogenes. Kết quả trình bày ở<br /> hình 4. Qua kết quả trên hình 4, cho thấy ở giếng 1, 2,<br /> ñược pha thành các nồng ñộ vi khuẩn tương<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 330<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> ñương ở giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, có nồng ñộ Vibrio<br /> cholerae lần lượt là 106, 105, 104, 103, 102, 101<br /> CFU/ml, từ các nồng ñộ này ñem chiết tách DNA<br /> và cho vào phản ứng multiplex-PCR chung mồi<br /> ñể phát hiện Vibrio cholerae. Kết quả trình bày ở<br /> hình 5.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 4, có nồng ñộ Vibrio cholerae lần lượt là 106, 105, 104,<br /> 103 vi khuẩn/ml khi ñưa vào phản ứng multiplex PCR<br /> chung mồi mới có thể phát hiện ñược Vibrio cholerae.<br /> Như vậy nồng ñộ vi khuẩn Vibrio cholerae sau khi<br /> tăng sinh tối thiểu là 103 vi khuẩn/ml bộ kít mới có thể<br /> phát hiện ñược.<br /> <br /> Qua kết quả trên hình 5, cho thấy ở giếng 1, 2, 3,<br /> <br /> 500bp<br /> <br /> 600bp<br /> <br /> Hình 5. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của bộ kít với các nồng ñộ Vibrio cholerae khác nhau Vạch 600bp: Vibrio<br /> cholerae; Vạch 500bp: chứng nội tại<br /> <br /> 500bp<br /> 380bp<br /> <br /> Hình 6. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của bộ kít với các nồng ñộ Shigella spp. khác nhau Vạch 380bp: Shigella spp.;<br /> Vạch 500bp: chứng nội tại<br /> Thử nghiệm ñộ ñặc hiệu của bột kít multiplexKết quả ñộ nhạy trên canh khuẩn Shigella<br /> PCR chung mồi cho các vi khuẩn cùng giống nhưng<br /> spp.<br /> khác<br /> loài ñối với các vi khuẩn ñích ñể xác ñịnh ñộ ñặc<br /> Chủng Shigella spp. trên canh khuẩn thuần ñược<br /> hiệu<br /> của<br /> bộ kít.<br /> pha thành các nồng ñộ vi khuẩn tương ñương ở giếng<br /> Nuôi cấy vi khuẩn không phải mục tiêu này trên<br /> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 có nồng ñộ Shigella spp. lần lượt là<br /> 6<br /> 5<br /> 4<br /> 3<br /> 2<br /> 1<br /> 0<br /> môi<br /> trường nuôi cấy tăng sinh (BHI), qua ñêm (16hr).<br /> 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 CFU/ml, từ các nồng<br /> Nồng<br /> ñộ vi khuẩn ước khoảng 108 CFU/ml. Pha loãng<br /> ñộ này ñem chiết tách DNA và cho vào phản ứng<br /> canh khuẩn theo ñộ pha loãng bậc 10 với ñệm<br /> multiplex-PCR chung mồi ñể phát hiện Shigella spp.<br /> phosphate, ñến mức ñộ giới hạn phát hiện của bộ<br /> Kết quả trình bày ở hình 6.Qua kết quả trên hình 6,<br /> kít,sau ñó chiết tách DNA, và thực hiện phản ứng<br /> cho thấy ở giếng 1, 2, 3, 4, có nồng ñộ Shigella spp.<br /> 6<br /> 5<br /> 4<br /> 3<br /> PCR.<br /> lần lượt là 10 , 10 , 10 , 10 vi khuẩn/ml khi ñưa vào<br /> phản ứng multiplex PCR chung mồi mới có thể phát<br /> Kết quả ñộ ñặc hiệu Listeria monocytogenes<br /> hiện ñược Shigella spp. Như vậy nồng ñộ vi khuẩn<br /> trên<br /> canh khuẩn các vi khuẩn không ñích<br /> Shigella spp. sau khi tăng sinh tối thiểu là 103 CFU/ml<br /> Các vi khuẩn không ñích của Listeria<br /> bộ kít mới có thể phát hiện ñược.<br /> monocytogenes là các chủng Listeria innocua,<br /> <br /> Thử nghiệm ñộ ñặc hiệu trên canh khuẩn<br /> chủng không phải ñích<br /> <br /> Listeria ivanovii và Listeria seewil ñược ñưa vào thử<br /> nghiệm ñộ ñặc hiệu của bộ kít. Kết quả trình bày hình<br /> <br /> Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010<br /> <br /> 331<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2