Xây dựng qui trình real-time PCR kết hợp HRM phát hiện gen gây độc stx1, stx2, eae và ehxA của nhóm vi khuẩn E. Coli sinh độc tố shiga (STEC)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> <br /> XÂY DỰNG QUI TRÌNH REAL-TIME PCR KẾT HỢP HRM<br /> PHÁT HIỆN GEN GÂY ĐỘC STX1, STX2, EAE VÀ EHXA<br /> CỦA NHÓM VI KHUẨN E. coli SINH ĐỘC TỐ SHIGA (STEC)<br /> Nguyễn Quốc Tuấn*, Ngô Kế Sương**, Nguyễn Đăng Quân***, Nguyễn Hoàng Chương****<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: STEC (Shiga toxin producing Escherichia coli) là nhóm vi khuẩn gây ra các triệu chứng như<br /> viêm đại tràng xuất huyết (hemorrhagic colitis) và hội chứng urê huyết tan máu (hemolytic uremic syndrome), có<br /> thể dẫn đến suy thận và tử vong. Khả năng gây bệnh của nhóm E. coli này do các gen gây độc stx1, stx2, eae,<br /> ehxA quyết định. Vì vậy, cần phải có một quy trình phân tử phát hiện các gen gây độc như trên ở nhóm vi khuẩn<br /> STEC phục vụ cho việc xác định chính xác nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm do E. coli sinh độc tố<br /> shiga (STEC) gây ra cũng như áp dụng cho các nghiên cứu về dịch tễ học loài vi khuẩn này.<br /> Mục tiêu: Xây dựng quy trình phát hiện các gen gây độc stx1, stx2, eae và ehxA của nhóm vi khuẩn STEC<br /> dựa trên kỹ thuật real-time PCR kết hợp phân tích HRM.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Cắt ngang bao gồm thiết kế các cặp primer phát hiện các gen gây độc bằng kỹ<br /> thuật real-time PCR HRM; xây dựng và khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR HRM; đánh giá quy<br /> trình mới xây dựng trên các chủng E. coli phân lập từ thực phẩm.<br /> Kết quả: xây dựng thành công quy trình real-time PCR kết hợp HRM phát hiện đặc hiệu bốn gen gây độc<br /> stx1, stx2, eae, ehxA ở các chủng vi khuẩn STEC. Trên 30 mẫu E. coli phân lập từ thực phẩm, quy trình đã phát<br /> hiện được 8 mẫu mang các gen gây độc.<br /> Kết luận: Quy trình real-time PCR kết hợp HRM có thể được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu và kiểm<br /> soát các vụ ngộ độc thực phẩm do STEC gây ra.<br /> Từ khóa: gen gây độc, STEC, real-time PCR, HRM.<br /> ABSTRACT<br /> APPLICATION OF REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION COUPLED WITH HIGH-<br /> RESOLUTION MELTING ANALYSIS FOR DETECTION OF STX1, STX2, EAE, EHXA GENES<br /> Nguyen Quoc Tuan, Ngo Ke Suong, Nguyen Dang Quan, Nguyen Hoang Chuong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 374 - 380<br /> <br /> Backgrounds: Shiga toxin producing Escherichia coli (STEC) is a group of bacteria causing hemorrhagic<br /> colitis and hemolytic uremic syndrome which may lead to kidney failure and mortality. The pathogenicity of<br /> STEC is conferred by virulent genes comprising stx1, stx2, eae and ehxA. Therefore, a detection protocol for these<br /> virulent genes would be essential for identifying the microbial that is one of the most serious causes of food<br /> poisoning. The protocol would also be useful for epidemiological studies of STEC.<br /> Objectives: The aim of this study was to set up a protocol based on the real-time polymerase chain reaction<br /> (PCR) high-resolution melting (HRM) technique for detection of four virulent genes of STEC comprising stx1,<br /> stx2, eae and ehxA.<br /> <br /> <br /> * Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh ** Viện Sinh học Nhiệt đới - Viện HLKH&CN Việt Nam<br /> ***<br /> Trung tâm CNSH Tp.HCM **** Trường Đại học KHTN – ĐHQG Tp.HCM<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Quốc Tuấn ĐT: 0984444839 Email: nguyenquoctuan@iph.org.vn<br /> <br /> 374 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Methods: A laboratory study was performed to design primers for the real-time PCR, asses the specificity of<br /> the real-time PCR protocol and applying this protocol to detect the virulent genes in 30 E. coli strains isolated<br /> from food.<br /> Results: A protocol was developed successfully for detection four virulent genes stx1, stx2, eae, ehxA in<br /> STEC strains. There were 8 out of 30 E. coli strains carrying one of the virulent genes isolated from food.<br /> Conclusion: Real time PCR HRM protocol can be applied for detecting for STEC in food poisoning<br /> incidents.<br /> Keywords: virulent genes, STEC, real-time PCR, HRM.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ trình phát hiện các gen gây độc STEC dựa trên<br /> kỹ thuật real-time PCR kết hợp phân tích HRM<br /> STEC là nhóm vi khuẩn gây bệnh lây truyền (high resolution melting). Đây là kỹ thuật cho<br /> qua thực phẩm và là mối quan tâm sức khỏe phép phát hiện các gen gây độc ngay khi phản<br /> cộng đồng quan trọng. Khả năng gây bệnh của ứng PCR đang diễn ra với giá trị Ct (chu kỳ<br /> nhóm E. coli này do các gen gây độc quyết định, ngưỡng). Sau khi kết thúc phản ứng real-time<br /> trong đó bao gồm stx1, stx2, eae, ehxA. Nhóm vi PCR, sự phân tích nhiệt độ nóng chảy của các<br /> khuẩn STEC có nhiều serotype khác nhau bao sản phẩm PCR bằng chương trình HRM sẽ giúp<br /> gồm serotype nguy hiểm là O157:H7. Hơn 100 xác định chính xác mẫu phân tích có mang gen<br /> serotype STEC đã được xác định có chứa một gây độc loại nào. Quy trình này không những<br /> trong bốn gen gây độc kể trên. Ngộ độc thực làm giảm thời gian phân tích các gen gây độc<br /> phẩm do nhóm vi khuẩn STEC vẫn đang phổ cũng như làm giảm các bước thao tác mà còn<br /> biến trên thế giới với số người mắc bệnh ngày tăng độ tin cậy cho các kết quả phát hiện các gen<br /> càng tăng. Đợt dịch ngộ độc thực phẩm ở Đức gây độc nhờ đặc tính triệt tiêu hiện tượng nhiễm<br /> năm 2011 là một ví dụ rõ nét về đặc tính gây chéo DNA.<br /> bệnh của nhóm STEC với chủng vi khuẩn đã<br /> được xác định là O104:H4 có sinh độc tố Shiga(1,2). Mục tiêu nghiên cứu<br /> Thiết kế các cặp primer phát hiện các gen<br /> Ở Việt Nam các vụ ngộ độc thực phẩm do E.<br /> gây độc stx1, stx2, eae và ehxA và gen chứng<br /> coli cũng rất phổ biến và là mối quan tâm lớn của<br /> toàn xã hội. Đã có nhiều nghiên cứu về các nhóm nội uspA.<br /> E. coli gây ngộ độc thực phẩm khác nhau ở Việt Xây dựng quy trình real-time PCR kết hợp<br /> Nam, tuy nhiên các nghiên cứu về nguyên nhân HRM và khảo sát độ đặc hiệu của qui trình đối<br /> gây độc do các gen stx1, stx2, eae, ehxA vẫn còn với các gen gây độc của vi khuẩn STEC.<br /> quá ít và chưa triển khai áp dụng tại các phòng Ứng dụng quy trình mới xây dựng để xác<br /> thí nghiệm an toàn thực phẩm hiện nay. Phát định các gen gây độc trên các chủng vi khuẩn E.<br /> hiện chính xác nguyên nhân của các vụ ngộ độc coli phân lập từ thực phẩm.<br /> thực phẩm là yếu tố quan trọng giúp cho việc ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> chữa trị có hiệu quả các vụ ngộ độc thực phẩm<br /> có nguồn gốc từ vi sinh vật. Ngoài ra, một quy Đối tượng nghiên cứu<br /> trình phân tử phát hiện các gen gây độc ở nhóm Các gen gây độc từ các chủng vi khuẩn E. coli<br /> vi khuẩn STEC còn có thể được áp dụng trong phân lập từ thực phẩm.<br /> các nghiên cứu về dịch tễ học nhằm tìm hiểu Chứng dương: chủng vi khuẩn E. coli DH5α/pSTEC.<br /> nguyên nhân dẫn đến các vụ dịch ngộ độc thực Chứng âm: bao gồm các chủng vi khuẩn Vibrio<br /> phẩm trong xã hội, từ đó các cơ quan chức năng cholera, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa,<br /> sẽ có các biện pháp phòng chống thích hợp. Với Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus.<br /> lý do trên, chúng tôi đề xuất xây dựng một quy<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 375<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu cho stx2, 239 bp cho eae, 130 bp cho ehxA và<br /> Thiết kế các primer phát hiện các gen gây độc 834 bp cho uspA.<br /> Trên ngân hàng dữ liệu bộ gen GenBank, Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình PCR HRM<br /> chúng tôi tải về các trình tự của các gen gây độc Các sản phẩm PCR từ các gen gây độc được<br /> stx1, stx2, eae, ehxA và gen chứng nội uspA. Tiếp gửi giải trình tự tại công ty 1st base (Singapore).<br /> đến, chúng tôi xếp so hàng (alignment) các trình Các trình tự đã giải mã được so sánh với các<br /> tự này để tìm ra các vùng bảo tồn. Chúng tôi trình tự gốc trên GenBank. Ngoài ra, chúng tôi<br /> cũng tham khảo vùng bảo tồn của các gen gây cũng khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc của<br /> độc từ công trình của Son và cộng sự năm 2014. các cặp primer trong quy trình trên vật liệu di<br /> Trên các vùng bảo tồn đã phân tích, chúng tôi truyền của nhiều loại vi khuẩn khác nhau như<br /> lựa chọn các vùng bảo tồn mà Son và cộng sự đã Vibrio cholera, Salmonella sp., Pseudomonas<br /> lựa chọn. Trên các vùng bảo tồn đã lựa chọn này, aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus.<br /> chúng tôi cải tiến các primer phát hiện các gen Ứng dụng quy trình trên các chủng E. coli phân<br /> gây độc sao cho Tm của chúng hoàn toàn khác lập từ thực phẩm<br /> biệt để phân tích bằng kỹ thuật HRM. Sau cùng,<br /> Các chủng E. coli phân lập từ thực phẩm<br /> chúng tôi khảo sát các primer bằng phần mềm<br /> được tiến hành tách chiết DNA, thực hiện phản<br /> Blast để khẳng định tính đặc hiệu của các primer<br /> ứng real-time PCR HRM. Sự xuất hiện của các<br /> đã cải tiến.<br /> gen gây độc được đánh giá bằng kết quả Ct và<br /> Tách chiết DNA vi khuẩn bằng phương pháp điểm nóng chảy Tm để từ đó rút ra kết quả về sự<br /> đun sôi xuất hiện của các gen gây độc stx1, stx2, eae, ehxA<br /> Từ khuẩn lạc của môi trường TSA chuyển ở các chủng E. coli phân lập từ thực phẩm.<br /> vào ống eppendorf 1,5 mL chứa 100 µL và đun<br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> sôi 1000C trong 10 phút. Ly tâm 14.000 vòng, thu<br /> dịch nổi và sử dụng cho phản ứng PCR. Mẫu Thiết kế primer để thu nhận các sản phẩm<br /> dịch chiết còn lại lưu giữ -200C. PCR có Tm khác biệt từ các gen gây độc và<br /> Phản ứng nhân bản các gen gây độc bằng PCR gen chứng nội<br /> Thành phần phản ứng: SensiFast Master 1X, Trong phần thiết kế primer cho quy trình<br /> nồng các cặp primer 0,4 mM, DNA tách chiết 5 real-time PCR HRM của nghiên cứu này, chúng<br /> l, nước vừa đủ thể tích 25 l. tôi có tham khảo công trình xây dựng PCR<br /> multiplex phát hiện 4 gen gây độc stx1, stx2, eae,<br /> Điều kiện phản ứng real-time PCR HRM: 950C –<br /> ehxA và gen chứng nội uspA của Son và cộng sự<br /> 2 phút (1 chu kỳ); 950C – 10 giây, 540C – 10 giây,<br /> (2014)(3). Các primer sau khi thiết kế có trình tự<br /> 720C – 15 giây (40 chu kỳ); 600C – 990C, tăng<br /> như trong Bảng 1.<br /> 0,50C/giây (1 chu kỳ).<br /> Bảng 1: Trình tự nucleotide của các primer nhân bản<br /> Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose<br /> các gen gây độc và gen chứng nội<br /> Sản phẩm sau phản ứng PCR được điện di Gen mục<br /> Tên primer Trình tự nucleotide<br /> trên gel agarose 2% có bổ sung Ethidium tiêu<br /> bromide. Điện di trong 30 phút. Sau đó quan M-stx1F AACCGCTGTTGTACCTGG stx1<br /> M-stx1R TTCTCGACTGCAAAGACGTATG<br /> sát kết quả điện di trên máy chụp hình điện di M-stx2F GGGAGTTTACGATAGACTTTTCG stx2<br /> bằng tia UV có bước sóng 312 nm. Bước kiểm M-stx2R CAGAACTGCTCTGGATGCATC<br /> M-eaeF TTTGCTGGGCGCTCATC eae<br /> tra điện di sản phẩm PCR nhằm khẳng định M-eaeR CGTTACATTGACTCCCGCTTTA<br /> kết quả phân biệt các sản phẩm PCR bằng kỹ M-ehxAF GTATCTGCGGGAGTTAGTGC ehxA<br /> thuật HRM. Các sản phẩm PCR khi điện di có M-ehxAR CGTGCTCAAACATAGCCTGTT<br /> M-uspAF CCGATACGCTGCCAATCAGT uspA<br /> kích thước lần lượt là 300 bp cho stx1, 476 bp M-uspAR ACGCAGACCGTAGGCCAGAT<br /> <br /> 376 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Trình tự nucleotide của các cặp primer này stx1, 15,5 cho stx2, 12,2 cho eae, 12,1 cho ehxA và<br /> được kiểm tra tính đặc hiệu mục tiêu bằng 29,1 cho uspA.<br /> chương trình Blast. Kết quả Blast cho thấy tất cả<br /> các trình tự đều bắt cặp với các gen gây độc và<br /> gen chứng nội của các chủng vi khuẩn STEC. ehxA<br /> Tiếp đến, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb stx2<br /> stx1<br /> để thu nhận trình tự nucleotide của các đoạn gen eae<br /> gây độc nằm giữa các cặp primer đã thiết kế và uspA<br /> sử dụng chương trình phân tích nhiệt độ nóng<br /> chảy Umelt để tính toán Tm của từng đoạn gen<br /> gây độc này. Kết quả khảo sát Tm của các đoạn<br /> gen gây độc và gen chứng nội được trình bày Hình 1: Phản ứng real-time PCR HRM trên các gen<br /> trong Bảng 2. gây độc và gen chứng nội<br /> Bảng 2: Kết quả phân tích Tm của các đoạn gen nằm Phản ứng real-time PCR trên các mẫu chứng<br /> giữa các cặp primer âm không cho kết quả Ct. Khi phân tích nhiệt độ<br /> Đoạn gen<br /> 0<br /> Tm ( C) nóng chảy của các sản phẩm PCR bằng kỹ thuật<br /> stx1 82,9 HRM, các sản phẩm PCR khác nhau cho các Tm<br /> stx2 85,8 khác nhau thể hiện qua các đỉnh nhiệt (Tm peak)<br /> Eae 84,5 hoàn toàn tách biệt. Cụ thể Tm của sản phẩm<br /> ehxA 85,1<br /> PCR các gen gây độc stx1, stx2, eae, ehxA và gen<br /> uspA 87,9<br /> uspA lần lượt là 81,80C, 84,930C, 83,480C, 840C,<br /> Kết quả phân tích Tm cho thấy các đoạn gen<br /> 870C. Các đỉnh nhiệt khác biệt nhau ít nhất 0,40C.<br /> gây độc khác nhau ít nhất là 0,50C. Mức khác biệt<br /> Độ khác biệt nhiệt độ này giúp xác định chính<br /> này đủ để phân biệt các sản phẩm PCR từ các<br /> xác gen gây độc có trong mẫu khảo sát.<br /> gen gây độc khác nhau khi sử dụng phân tích<br /> HRM bằng máy real-time PCR có độ phân giải<br /> cao. Như vậy, khi khảo sát in silico thì các primer<br /> đã thiết kế cho các gen gây độc và gen chứng nội<br /> đạt yêu cầu như mong muốn. Tiếp đến, chúng<br /> tôi sử dụng các primer này để xây dựng phản<br /> ứng real-time PCR HRM.<br /> Xây dựng quy trình real-time PCR kết<br /> hợp phân tích HRM để phát hiện các gen Hình 2: Kết quả điện di trên gel agarose các sản phẩm<br /> PCR từ các gen gây độc<br /> gây độc<br /> Giếng 1: thang DNA 100 bp; Giếng 2,4,6,8,10: mẫu<br /> Với các primer đã thiết kế và DNA chứng<br /> chứng âm với các primer cho stx1, stx2, eae, ehxA,<br /> dương chứa trình tự của các gen gây độc và gen uspA; Giếng 3: gen stx1 (300 bp),5: gen stx2 (476 bp),7:<br /> chứng nội, chúng tôi thực hiện phản ứng real- gen eae (239 bp),9: gen ehxA (130 bp) và 11: gen uspA<br /> time PCR kết hợp phân tích Tm của các sản (834 bp). Các sản phẩm PCR cho các gen độc lực tách<br /> phẩm PCR bằng HRM. Mẫu DNA bản mẫu chiết từ DNA của vi khuẩn E. coli mang plasmid<br /> được tách chiết từ DH5α/pSTEC. Kết quả được DH5α/pSTEC sử dụng làm chứng dương.<br /> trình bày trong Hình 1. Các đỉnh nhiệt thực nghiệm này đều cao hơn<br /> Kết quả real-time PCR cho thấy các phản đỉnh nhiệt đã khảo sát trên lý thuyết bằng phần<br /> ứng real-time PCR trên các mẫu gen gây độc và mềm Umelt. Tuy nhiên, sự chênh lệch về nhiệt<br /> chứng nội cho kết quả Ct lần lượt là 17,5 cho độ vẫn lớn hơn 0,40C đủ để phát hiện bằng HRM<br /> của máy real-time PCR. Chúng tôi cũng tiến<br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 377<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> hành điện di trên gel agarose các sản phẩm PCR DH5α/pSTEC. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu<br /> từ quy trình real-time PCR HRM để kiểm chứng được trình bày trong Hình 3.<br /> kết quả phân biệt các gen gây độc bằng kỹ thuật Kết quả ở hình 3 cho thấy, chỉ có tín hiệu<br /> HRM. Kết quả điện di được trình bày trong dương tính đối với mẫu chứng dương trong cả<br /> Hình 2. năm phản ứng real-time PCR cho 4 gen gây độc<br /> Kết quả điện di cho thấy tất cả các sản phẩm và 1 gen chứng nội trong khi những phản ứng<br /> PCR đều có kích thước như mong muốn khi so này cho tín hiệu âm tính đối với vật liệu di<br /> sánh với thang DNA 100 bp. Để khẳng định các truyền từ các loại vi khuẩn khác nhau như Vibrio<br /> sản phẩm PCR là đặc hiệu cho các gen gây độc cholera, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa,<br /> stx1, stx2, eae và ehxA, chúng tôi tiến hành giải Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. Khi phân<br /> trình tự nucleotide các sản phẩm PCR này và so tích HRM thì các tín hiệu dương tính này đều<br /> sánh với các trình tự gen gây độc trên ngân hàng cho các đỉnh nhiệt phù hợp với đỉnh nhiệt đã xác<br /> dữ liệu nucleotide (GenBank). Kết quả giải trình lập cho các gen gây độc và gen chứng nội. Điều<br /> tự nucleotide và so sánh với các trình tự gen gốc này chứng tỏ các cặp primer thiết kế trong đề tài<br /> trên GenBank của E. coli EDL 933, mã NCBI là này hoàn toàn đặc trưng, chỉ phát hiện đặc hiệu<br /> AE005174 cho thấy có sự tương đồng hoàn toàn cho các gen gây độc của các chủng STEC.<br /> trong trình tự nucleotide của các sản phẩm PCR Quy trình real-time PCR HRM đã xây dựng<br /> và các gen gây độc stx1, stx2, eae, ehxA trên<br /> Chúng tôi đề xuất quy trình real-time PCR<br /> GenBank. Như vậy, các cặp primer sử dụng<br /> HRM phát hiện các gen gây độc stx1, stx2, eae,<br /> trong nghiên cứu này là hoàn toàn đặc hiệu cho<br /> ehxA được thực hiện theo sơ đồ ở Hình 4.<br /> các gen gây độc, và kết quả phân biệt các gen<br /> gây độc dựa trên Tm của các sản phẩm PCR<br /> bằng kỹ thuật HRM đã được khẳng định tính<br /> chính xác.<br /> Khảo sát tính đặc hiệu của quy trình real-<br /> time PCR HRM<br /> ehxA<br /> stx1<br /> stx2<br /> uspA<br /> eae<br /> <br /> Hình 4: Quy trình real-time PCR HRM phát hiện các<br /> gen gây độc stx1, stx2, eae, ehxA<br /> Ứng dụng quy trình real-time PCR HRM<br /> trên các mẫu E. coli phân lập từ thực phẩm<br /> Hình 3. Khảo sát tính đặc hiệu của quy trình real-<br /> Chúng tôi thực hiện quy trình real-time PCR<br /> time PCR HRM trên nhiều loại vi khuẩn khác nhau<br /> HRM trên 30 mẫu E. coli phân lập từ thực phẩm<br /> Chúng tôi đánh giá tính đặc hiệu của quy để đánh giá hiệu quả hoạt động của quy trình.<br /> trình real-time PCR HRM đối với các gen gây Kết quả phát hiện gen gây độc bằng quy trình<br /> độc của nhóm vi khuẩn STEC bằng cách thực real-time PCR HRM được so sánh với quy trình<br /> hiện quy trình này trên nhiều loại vi khuẩn khác multiplex PCR đã được xây dựng thành công<br /> nhau, bao gồm Vibrio cholera, Salmonella sp., trước đó. Kết quả một số mẫu được trình bày<br /> Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, trong Hình 5. Kết quả tổng kết trên 30 mẫu E. coli<br /> Staphylococcus aureus và chứng dương là được trình bày trong Bảng 3.<br /> <br /> 378 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Kết quả ở Bảng 3 cho thấy đã phát hiện các<br /> gen gây độc ở 8 chủng E. coli phân lập từ thực<br /> phẩm, 22 chủng E. coli còn lại không mang gen<br /> gây độc. Tất cả 30 chủng E. coli này đều dương stx2<br /> uspA<br /> tính phản ứng PCR với cặp primer nhân bản gen<br /> uspA, điều này khẳng định tính chính xác của các<br /> mẫu âm tính với gen gây độc. Khi so sánh kết<br /> quả phát hiện gen gây độc thì quy trình real-time<br /> PCR HRM cho kết quả trùng hợp với quy trình<br /> Hình 5A: Kết quả phát hiện gen gây độc trên chủng<br /> multiplex PCR đã xây dựng trước đó.<br /> E. coli C745<br /> Bảng 3: Kết quả đánh giá quy trình real-time PCR<br /> HRM trên 30 mẫu E. coli phân lập từ thực phẩm<br /> ehxA<br /> STT Tên mẫu Kết quả real-time Kết quả real-time<br /> PCR gen gây độc PCR gen uspA<br /> stx1<br /> 1 NDBC25 - +<br /> uspA<br /> 2 NDBC39 - +<br /> eae<br /> 3 D162 stx2 +<br /> 4 G413 - +<br /> 5 G3464 - +<br /> 6 S96 ehxA +<br /> 7 D168 ehxA +<br /> 8 C330 - + Hình 5B: Kết quả phát hiện gen gây độc trên chủng<br /> 9 NDBC47 - + E. coli F469<br /> 10 E157 eae, ehxA +<br /> 11 F419 - + KẾT LUẬN<br /> 12 NDBC44 - + Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình<br /> 13 F650 stx1 +<br /> real-time PCR HRM để phát hiện các gen gây<br /> 14 C91 - +<br /> 15 NDBC41 - + độc của các chủng vi khuẩn STEC. Quy trình<br /> 16 D87 - + mới xây dựng có độ đặc hiệu cao đối với các<br /> 17 NDBC3 - + chủng vi khuẩn STEC. Khi áp dụng quy trình<br /> 18 F649 - + real-time PCR HRM trên 30 mẫu E. coli phân lập<br /> 19 C780 - + từ thực phẩm, kết quả cho thấy có 8/30 mẫu có<br /> 20 F153 - +<br /> mang một hoặc nhiều gen gây độc.<br /> 21 F469 stx1, eae, ehxA +<br /> 22 E683 - + KIẾN NGHỊ<br /> 23 NDBC43 stx2 +<br /> 24 D117 - + Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của quy trình<br /> 25 E654 - + real-time PCR HRM phát hiện các gen gây đã<br /> 26 C745 stx2 + xây dựng trong đề tài này, hướng sắp tới chúng<br /> 27 E919 - + tôi sẽ so sánh kết quả phát hiện các gen gây độc<br /> 28 G582 - + của quy trình real-time PCR HRM với các bộ kit<br /> 29 D89 - +<br /> phát hiện gen gây độc đã được thương mại hóa.<br /> 30 C228 - +<br /> Kết quả Hình 5 cho thấy, mẫu F469 dương TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> tính với 3 gen gây độc là stx1, eae, ehxA; mẫu 1. Centers for Disease Prevention and Control (CDC), 2006.<br /> Bacterial Foodborne and Diarrheal Disease National Case<br /> C745 dương tính với gen stx2. Surveillance. Annual Report, 2005. Available at:<br /> http://www.cdc.gov/foodborneoutbreaks (accessed 14.04.11.)<br /> 2. Radosavljevic V, et al (2015). Escherichia coli O104:H4 outbreak<br /> in Germany-clarification of the origin of the epidemic.<br /> European journal of Public Health, 25: 125-129.<br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 379<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> 3. Son I, et al (2014). Detection of five Shiga toxin-producing Ngày nhận bài báo: 19/7/2016<br /> Escherichia coli genes with multiplex PCR. Food Microbiology,<br /> 40: 31-40. Ngày phản biện nhận xét bài báo: 1/8/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 05/10/2016<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 380 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br />